一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒

技术特征：
1.一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的pcr引物，其特征在于，所述引物设计位点位于牛的艾美耳球虫ssu rrna高度保守区且其扩增片段中存在区分不同虫种的单核苷酸多态性位点。2.根据权利要求1所述pcr引物，其特征在于，所述引物为巢式pcr引物，包括第一轮pcr上游引物eimeria-f1、第一轮pcr下游引物eimeria-r1和第二轮pcr上游引物eimeria-f2、第二轮pcr下游引物eimeria-r2，其引物的核苷酸序列依次如seq id no：1～4所示。3.权利要求1或2所述pcr引物在牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定中的应用。4.一种用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.从待测粪便样品中提取dna；s2.以步骤s1所述dna为模板，用权利要求1或2所述pcr引物进行pcr或巢式pcr扩增；s3.对步骤s2中扩增产物进行电泳检测，其中只要扩增出一条条带即为阳性样本，并把阳性样本进行测序分析，根据虫种特异性单核苷酸多态性位点上的碱基序列来鉴定待测样品的虫种。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述巢式pcr第一轮扩增的反应体系为：1μl dna、25μl 2
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dreamtaq pcr master mix、1.25μl第一轮pcr上游引物和下游引物、2μl牛血清蛋白、最后加入去离子水至50μl；第二轮扩增的反应体系为：2μl第一轮pcr产物、25μl 2
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dreamtaq pcr master mix、2μl牛血清蛋白、1.25μl第二轮pcr上游引物和下游引物、最后加入去离子水至50μl。6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述巢式pcr第一轮与第二轮扩增程序相同均为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，52℃退火30秒和68℃延伸30秒，一共循环该过程45次；最后，68℃延伸7分钟。7.权利要求1或2所述引物在制备用于牛的艾美耳球虫检测和虫种鉴定试剂盒中的应用。8.一种用于牛中艾美耳球虫的检测和虫种鉴定的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的pcr引物。9.根据权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，还包含pcr所需试剂阳性和阴性对照。10.根据权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，还包含从待测粪便样品中提取dna所需的试剂。

技术总结
本发明公开了一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。本发明采用牛的艾美耳球虫SSU rRNA基因作为检测靶序列，所述序列中具有保守区域和可变区域，相应扩增片段中包含多个单核苷多态性位点；本发明进一步通过设计巢式PCR引物，建立了牛中常见艾美耳球虫巢式PCR检测方法，可检测出不同的牛中常见艾美耳球虫，进行艾美耳球虫的虫种鉴定。采用本发明的检测方法能够最低检测到一个卵囊，其扩增效率高，检测灵敏，可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫，并确定引起发病的不同虫种，用于牛球虫病的精准防控。用于牛球虫病的精准防控。用于牛球虫病的精准防控。


技术研发人员：肖立华 陈雪华 冯耀宇 郭亚琼 李娜
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.03.08
技术公布日：2022/5/30