一种用于制备IgM类校准品的方法与流程

一种用于制备igm类校准品的方法
技术领域
1.本发明涉及igm类校准品技术领域，尤其涉及一种用于制备igm类校准品的方法。


背景技术：

2.igm主要存在于生物体内血液中，对防止菌血症起主要作用。igm类抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
3.igm抗体它是免疫应答中首先分泌的抗体，一经感染快速产生，经过一段时间，igm抗体量逐渐减少而消失。它们在与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆以便于巨噬细胞的吞噬。母体中的igm不能通过胎盘，如果胎儿或新生儿的血液中发现有igm，说明已发生过宫内感染。
4.igm占血清免疫球蛋白总量的5％～10％，血清浓度约1mg/ml。单体igm以膜结合型表达于b细胞表面，构成b细胞抗原受体。igm是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的先头部队，血清中检出igm，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。
5.特异性igm抗体一般是在发病第二天至第四天内开始出现，最早时即可在第一天测到，后续会在第七天至第十五天达到高峰，之后会逐渐减少至消失。一般认为，隐性感染时特异性igm抗体、igg抗体均会升高；再感染时只会出现特异性igg抗体，无症状表现；部分接种疫苗后再感染的病人，特异性igm抗体，igg抗体均会升高。对于一些慢性感染性疾病，特异性igm抗体的长期存在可能意味着持续感染。对于疫苗接种者而言，特异性igm抗体的出现可能意味着有效接种。
6.igm抗体在诊断中具有重要的意义。对于研发工作者，但是由于其仅在感染初期出现，故此类样本的获取难度较大，样本量较少；
7.同时据报道，igm抗体血清在冻融2次或者-25℃存放2至8周，基本可使大量igm弱阳性的标本转为阴性。存放太久可能会出现非特异性吸附，血清在低稀释度使用时可能出现假性结果，因此需要一种用于制备igm类校准品的方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于制备igm类校准品的方法。
9.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
10.一种用于制备igm类校准品的方法，包括以下步骤：
11.步骤一：羊多抗的获取：按固定免疫程序免疫羊，当效价合格后，提取血清；
12.步骤二：羊多抗的纯化：使用亲和层析法纯化提取到的羊多抗；
13.步骤三：羊多抗的切割：使用酶对羊多抗igg进行切割，纯化羊多抗中的fab片段，并将纯化后的fab片段用于后续偶联；
14.步骤四：人igm与fab片段的偶联：使用化学方法将人igm与羊多抗的fab片段进行偶联；
15.步骤五：检测：将人igm与羊多抗的fab片段进行偶联后的产物进行亲和性测试以及老化试验测试；
16.步骤六：再调整：根据步骤五中检测的结果对人igm与羊多抗的fab片段进行偶联的位置以及操作方法进行调整。
17.步骤七：培育：将步骤六中再调整后的人igm与羊多抗的fab片段偶联得到的校准品进行培育，同时进三组不同环境的实验，选择出最适合培育的环境
18.上述技术方案进一步包括：
19.所免疫的某蛋白主要为传染病抗原。
20.切割羊多抗获取fab的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。
21.人igm与fab片段的化学偶联剂包括smcc、sata、dss、马来酰亚胺基等化学偶联剂。
22.人igm与fab中的偶联比例为1:2-1:10。
23.相比现有技术，本发明的有益效果为：
24.1、本发明中，制备好的特异性igm按照一定浓度添加至阴性血清中，即可得到此类igm抗体血清，可以用于体外诊断igm类试剂盒的研发及特异性igm类血清的校准品。
25.2、本发明中，获取的特异性igm类血清，亲和力高，稳定性好，可耐受反复冻融次数十余次，在-20℃的环境下可保存两年。
具体实施方式
26.一种用于制备igm类校准品的方法，包括以下步骤：
27.步骤一：蛋白羊多抗的获取：对该蛋白按固定免疫程序免疫羊，当效价合格后，提取血清，所免疫的某蛋白主要为传染病抗原；
28.步骤二：羊多抗的纯化：使用亲和层析法纯化提取到的羊多抗；
29.步骤三：羊多抗的切割：使用酶对羊多抗igg进行切割，纯化羊多抗中的fab片段，并将纯化后的fab片段用于后续偶联，切割羊多抗获取fab的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等；
30.步骤四：人igm与fab片段的偶联：使用化学方法将人igm与羊多抗的fab片段进行偶联，人igm与fab片段的化学偶联剂包括smcc、sata、dss、马来酰亚胺基等化学偶联剂，人igm与fab中的偶联比例为1:2-1:10；
31.步骤五：检测：将人igm与羊多抗的fab片段进行偶联后的产物进行亲和性测试以及老化试验测试；
32.步骤六：再调整：根据步骤五中检测的结果对人igm与羊多抗的fab片段进行偶联的位置以及操作方法进行调整。
33.步骤七：培育：将步骤六中再调整后的人igm与羊多抗的fab片段偶联得到的校准品进行培育，同时进三组不同环境的实验，选择出最适合培育的环境
34.实施例一
35.一、甲肝多克隆抗体的获取
36.获取甲肝抗原5mg用于免疫山羊。免疫程序按照初次2mg，后续1mg每次的方法进行免疫，免疫间隔为2周。第四针免疫完成后7天后，山羊放血，离心收集山羊的多克隆血清。
37.多克隆血清过proteing纯化多克隆抗体，使用100mm gly ph3.0洗脱。收集洗脱
液，透析至pbs ph7.6中，。
38.12000rpm，10min离心，取上清，即使抗甲肝的山羊多克隆抗体，冷冻干燥保存。
39.二、甲肝多克隆抗体fab获取
40.取山羊抗甲肝多克隆抗体100mg、木瓜蛋白酶5mg，之后加入200ul 0.5m的半胱氨酸、200ul的0.1m的edta ph7.0及0.1m磷酸盐缓冲体系(ph7.6)，之后置于37℃、150rpm恒温水浴摇床中进行酶解4小时，再加入20ul碘乙酰胺溶液(0.2m)冰浴半小时以终止反应。
41.上样本之后经过proteing纯化，收集流穿，透析至pbs ph7.6中。
42.12000rpm，10min离心，取上清，即为抗甲肝的fab片段。
43.三、igm抗原/u链与抗甲肝fab片段的交联
44.取20mg的抗甲肝的fab片段，缓冲液置换为0.03m pbs(ph7.1)；10mg的人igm缓冲液置换为0.1m pbs(ph8.0)。
45.甲肝fab片段中加入200ul 1.mg/ml的4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，充分混匀后室温反应1h，获得smcc活化的甲肝fab片段，透析至0.01m pbs，ph6.1；人igm中加入200ul 1mg/ml的n-琥珀酰亚胺s-乙酰硫代乙酸盐(sata)，充分混匀后室温反应1h，获得sata活化的人igm，透析至0.01m pbs，ph6.1。
46.sata活化的人igm中，加入1ml 0.5m的盐酸羟胺，室温反应0.5h，透析至0.01m pbs，ph6.1。
47.将甲肝fab片段与人igm混合室温反应1h，加入半胱氨酸至终浓度0.002m，室温反应0.5h；最终加甲基马来酰至0.005m，室温反应1h，透析至pbs中，即为交联好的甲肝fab-人igm。
48.为长期有效保存，可在制备好的甲肝fab-人igm聚合物中加入5mg/ml的牛血清白蛋白，8％甘油，6％蔗糖。这样该品可有效长期保存。
49.实施例二
50.制备的甲肝fab-人igm聚合物与天然甲肝igm抗血清相比，均可以与甲肝天然抗原发生反应。使用酶联免疫检测试剂盒比较如下：
51.天然甲肝血清1天然甲肝血清2天然甲肝血清3甲肝fab-人igm聚合物(阴性血清1:10稀释)
[0052][0053]
通过以上发现，制备的甲肝fab-人igm可以很好的天然的甲肝抗原发生反应且效价较高，阴性值与血清阴性值相近，无本底，可以作为甲肝igm类的校准品进行使用。
[0054]
实施例三
[0055]
为了进一步对比本发明制备的甲肝fab-人igm的稳定效果，使用阴性空白血清对本品进行稀释，分别进行多次冻融实验及长期稳定性实验，使用酶联免疫检测试剂盒比较如下对比吧本品的长期稳定效果。
[0056][0057]
反复冻融结果
[0058]
长期稳定性结果(≤-20℃)
[0059][0060]
通过上述两表发现，本发明制备的甲肝fab-人igm相比于天然的甲肝igm血清，反复冻融三次后仍有80％以上活性，天然甲肝igm在反复冻融三次以后活性损失均在50％以上；在≤-20℃条件下保存时，甲肝fab-人igm聚合物保存在6个月后活性仍≥85％，天然的甲肝igm保存6个月后活性损失较大，均≥50％，弱阳性的血清样本在反复冻融及-20℃保存时活性损失80％以上。
[0061]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。