一种水产品中硝基呋喃类兽药检测方法与流程

一种水产品中硝基呋喃类兽药检测方法
发明领域
1.本发明涉及食品中兽药的检测方法。具体的说，本发明涉及一种 水产品(鱼、虾)中硝基呋喃类兽药残留的测定方法。


背景技术：

2.鱼肉与虾肉是主要水产组成部分，因其味美性平，含有丰富且易 于人体吸收的蛋白质与碳水化合物、脂肪、钙、铁、磷等营养成分而 广受消费者喜爱。我国食用鱼、虾的历史已有上千年之久，到如今鱼 肉和虾肉依旧是中国人菜谱上的最重要的肉类组成部分。但在水产养 殖过程中频频爆出一些违禁药物使用的新闻(如“多宝鱼事件”，3.15 打假曝光“毒海参事件”等)，其中在养殖过程中添加硝基呋喃类兽 药尤被相关部门重视。硝基呋喃作为合成的广谱性抗生素，曾广泛用 于水产养殖生产中以治愈肠炎、赤鳍病等鱼虾类疾病，但研究表明硝 基呋喃具有致癌致畸等危害，使得包括世界范围内大多数国家明确禁 止使用硝基呋喃类兽药。但由于其疗效好价钱便宜等原因，使得现如 今这类药物的违规使用依旧很严重。
3.硝基呋喃兽药进入鱼虾体内后，会进行快速的代谢，生成对应的 硝基呋喃代谢物。这类代谢物的毒性更强，并且会和水产品的肌肉组 织形成稳定的结合态物质，会随着食物链传递到人体内，带来严重的 食品安全风险。现今的检测手段通常是以邻硝基苯甲醛作为衍生试 剂，使用具有较低检测限的hplc-ms/ms进行检测，并提出了硝基呋 喃代谢物的残留量的检测限不能高于1.0mg/kg。但在检测过程中发 现，邻硝基苯甲醛与硝基呋喃代谢物生成的代谢衍生物的离子碎片峰 不明显，很难获得较好的检测结果。并且现今人们对食品安全越来越 重视，未来对肉类中的硝基呋喃类兽药的检测要求一定会越来越高， 检测限也会不断的降低。基于此，开发出具有更明显的离子碎片特征 的代谢衍生物，进而增强hplc-ms/ms的检测灵敏度势在必行。
4.水产品中硝基呋喃类兽药检测通常参照国标gb/t 21311-2007进 行预处理并检测其硝基呋喃类药物的含量，在预处理中需要将目标物 在37℃中过夜衍生16h，并且需要加入一定浓度的k3po4和naoh进 行繁琐的ph调节，此外还需加入正己烷进行除脂，这无法实现样品 快速且简单的检测。因此，需要开发一种快速、高效检测水产品中硝 基呋喃类兽药残留的高效液相色谱串联质谱(hplc-ms/ms)的分析方 法，在缩短样品前处理时间的同时，也可获得高灵敏度的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了提供一种水产品中硝基呋喃类兽药的 hplc-ms/ms的测定方法，以解决现有国标gb/t 21311-2007对食品 中硝基呋喃类兽药残留检测过程中衍生反应时间长，衍生化产物离子 碎片特征不明显等问题。
6.本发明是通过以下技术方案进行实现的：
7.一种水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法，该分析方法包 括以下步骤：
8.(1)将均质的样品加入离心管中，使用乙酸乙酯和高纯水进行 清洗，随后在6000r/min下进行离心，弃去液体；
9.(2)在残留的固体中加入盐酸溶液后进行30min的超声处理， 离心，移取所有上清液；
10.(3)将步骤(2)中的上清液在50℃的氮气氛围下进行浓缩；
11.(4)将步骤(3)中的浓缩液中依次加入衍生试剂、盐酸水溶液、 乙腈，在超声下进行衍生，结束后过膜直接上机测试；
12.其中，步骤(1)中虾肉的质量为1.00g。
13.优选地，步骤(1)中的乙酸乙酯和高纯水的使用体积为10ml， 清洗1次。
14.优选地，步骤(1)中的离心时间为5min。
15.优选地，步骤(2)中的酸溶液的浓度选为0.3mol/l，加入体 积为5ml。
16.优选地，步骤(4)中的衍生试剂为4-二苯胺基苯甲醛。
17.优选地，步骤(4)中衍生试剂4-二苯胺基苯甲醛的体积为50ml， 浓度为2～10mmol/l。
18.更为优选地，步骤(4)中衍生试剂4-二苯胺基苯甲醛的体积为 50ml，浓度为6mmol/l。
19.优选地，步骤(4)中加入的色谱纯乙腈体积为250ml。
20.优选地，步骤(4)中酸性水溶液体积为200ml，ph＝1.0～3.0。
21.更为优选地，步骤(4)中酸性水溶液体积为200ml，ph＝1.0。
22.优选地，步骤(3)中恒温超声辅助衍生过程中的衍生时间选为 5～80min，衍生温度选为20～70℃。
23.更为优选地，步骤(3)中恒温超声辅助衍生过程中的衍生时间 选为40min，衍生温度选为40℃。
24.通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
25.与现有的衍生方法对比，本发明在前处理过程中使用超声辅助衍 生技术，用于加快虾肉中四种硝基呋喃代谢物的衍生反应，使得40 min完成衍生反应(常规为16h),明显缩短了前处理过程中衍生步 骤花费的时间。
26.本发明优化了鱼、虾肉中硝基呋喃代谢物的前处理步骤，过程中 不使用有机试剂并且不需要进行繁琐的ph调节，简化了实验步骤， 使用离子碎片特征明显(待测物离子碎片质量均大于240)的4-二苯 胺基苯甲醛，使得该发明的检测灵敏度变得更高。
27.本发明使用4-二苯胺基苯甲醛作为硝基呋喃的衍生试剂，并且 将其使用于鱼、虾肉中四种硝基呋喃代谢物的衍生反应中，衍生反应 能够快速反应完全，得到的代谢衍生物性质稳定且具有显著的检测灵 敏度。
28.本发明中所得的代谢衍生物离子碎片峰明显，使用超高效液相色 谱串联质谱检测法对代谢衍生物进行检测具有很高的灵敏度。在获得 更低的检测限的同时明显的减少了前处理过程花费的时间，会为相关 检测部门提供简单高效的检测方法。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例或
现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而 易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域 普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他的附图。
30.图1为四种代谢衍生物质谱图(amoz衍生物质谱图，sem衍生物 质谱图，ahd衍生物质谱图，aoz衍生物质谱图)。
31.图2为硝基呋喃代谢物的衍生物mrm典型色谱图。
具体实施方式
32.下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实 施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围 的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的 改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也 仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明 做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
33.一种水产品(鱼肉、虾肉)中的硝基呋喃代谢物残留的检测方法， 包括以下实施例子：
34.实施例1
35.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯和10ml的高纯水进行清洗，通过5000r/min的转速， 离心5min来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3mol/l 的hcl，涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min，随后 在6000r/min的转速下离心10min，移取全部上清液，并且将该上 清液在氮气保护下于50℃进行浓缩。
36.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，8 mmol/l的4-二苯胺基苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋2min后，将反 应液置于40℃的超声波反应器中衍生标记40min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
37.实施例2
38.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯对样品进行清洗，通过5000r/min的转速，离心5min 来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3mol/l的hcl， 涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min，随后在6000 r/min的转速下离心10min，移取全部上清液，并且将该上清液在氮 气保护下于50℃进行浓缩。
39.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，8 mmol/l的4-二苯胺基苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋2min后，将反 应液置于40℃的超声波反应器中衍生标记40min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
40.实施例3
41.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯和10ml的高纯水进行清洗，通过5000r/min的转速， 离心10min来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3 mol/l的hcl，涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min， 随后在6000r/min的转速下离心10min，移取全部上清液，并且将 该上清液在氮气保护下于60℃进行浓缩。
42.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，8 mmol/l的4-二苯胺基
苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋2min后，将反 应液置于40℃的超声波反应器中衍生标记40min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
43.实施例4
44.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯和10ml的高纯水进行清洗，通过5000r/min的转速， 离心5min来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3mol/l 的hcl，涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min，随后 在6000r/min的转速下离心10min，移取全部上清液，并且将该上 清液在氮气保护下于60℃进行浓缩。
45.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，10 mmol/l的4-二苯胺基苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋1min后，将反 应液置于40℃的超声波反应器中衍生标记40min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
46.实施例5
47.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯和10ml的高纯水进行清洗，通过5000r/min的转速， 离心5min来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3mol/l 的hcl，涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min，随后 在10000r/min的转速下离心5min，移取全部上清液，并且将该上 清液在氮气保护下于50℃进行浓缩。
48.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，8 mmol/l的4-二苯胺基苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋2min后，将反 应液置于40℃的超声波反应器中衍生标记40min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
49.实施例6
50.称取1.00g均质样品于15ml的聚丙烯离心管中，分别加入10 ml的乙酸乙酯和10ml的高纯水进行清洗，通过5000r/min的转速， 离心5min来弃去上清液，随后在目标物残渣中加入5ml的0.3mol/l 的hcl，涡旋1min，将离心管在超声波反应器中解离30min，随后 在10000r/min的转速下离心5min，移取全部上清液，并且将该上 清液在氮气保护下于50℃进行浓缩。
51.在浓缩液中依次加入200ml的ph＝1的酸性水溶液，50ml，8 mmol/l的4-二苯胺基苯甲醛和250ml的乙腈，涡旋2min后，将反 应液置于50℃的超声波反应器中衍生标记30min，之后将反应液过 滤，将滤液上机检测。
52.实施例1～6所用的检测仪器为thermo tsq quantum型三重四级 杆质谱仪，其具体检测条件如表1所示。
53.表1
[0054][0055][0056]
实施例中1～6中四种硝基呋喃代谢物工作溶液(amoz、sem、ahd、 aoz)的配制方法为：移取四种硝基呋喃代谢物粉末各1.00mg，加 入甲醇后放入超声中进行溶解，再转移至10ml的棕色容量瓶中，稀 释至刻度后得到四种代谢物的标准储备液浓度为100mg/ml(-20℃ 状态下保存备用，有效期6个月)，随后移取标准储备液100ml于 10ml容量瓶中，再加入甲醇进行稀释和定容，所得四种硝基呋喃代 谢物的标准工作液都为1.0mg/ml。
[0057]
以空白鱼肉为例作为测试样本，按照本发明提出的检测方法在 0.5、1、5mg/kg三个浓度水平上进行加标回收率测试实验每个样品 重复六次实验，通过得到的标准曲线来计算每个分析样本的浓度，并 计算样本的加标回收率和相对标准偏差，实验数据见表2。
[0058]
表2
[0059][0060]
表3
[0061][0062]
表4
[0063]
[0064][0065]
表5
[0066][0067]a建立分析方法.bgb/t20752-2006.
[0068]
表2中的实验相关数据说明，样品的重现性好，精密度在标准要 求的8％以下，该方法得到的检测数据稳定、可靠。
[0069]
对实际鱼肉和虾肉样品进行检测，所得结果见表3和表4，通过 表3可以发现，检测过程中鱼肉样品中存在sem的残留。由表4可 以看出，样品中sem和ahd有检出。随后将虾肉样品使用国家标准进 行检测，对比两种方法可以看出，所建立的分析方法能够很好地应用 于实际样品的检测中。
[0070]
以上实施例为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本 领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和 变型，也应视为本发明的保护范围。