一种靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体及其制备方法

1.本发明属于石墨烯量子点领域，具体涉及一种靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体及其制备方法。


背景技术：

2.近年来，荧光纳米材料层数不穷，包括半导体量子点、贵金属纳米粒子、碳点、石墨烯基二维量子点(gqds)等。相比较其它荧光纳米材料，石墨烯量子点作为碳基纳米材料，因其合成方法多样、出色的水溶性、特殊的含氧官能团修饰、优异的生物相容性和低毒性、可调光致发光(pl)和持久的发光稳定性。其中石墨烯量子点已经广泛应用到生物成像领域，其中包括调节石墨烯量子点的尺寸实现不同荧光性质并运用到肿瘤细胞成像、结合高分子实现可调荧光成像，不同非金属原子掺杂实现荧光性质的变化来实现细胞成像，尽管围绕石墨烯量子点已经开展了近十年的研究，其中石墨烯量子点单独存在的情况下无酸响应定位功能、进入细胞能力有限，所以需要对石墨烯量子点进行适当的修饰以实现特定功能。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种ph敏感的正电荷型石墨烯量子点双发射荧光复合材料，作为靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体。
4.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
5.一种靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体，该载体具有如下式(ⅰ)所示的结构式：
[0006][0007]
其中，n＝15-120。
[0008]
具体地，该载体为石墨烯量子点(gqds)与聚乙烯亚胺(b-pei)和双醛聚乙二醇(da-peg)交联而成；支状聚乙烯亚胺(b-pei)是带有强大正电荷的阳离子聚合物之一，通常作为非病毒型基因的递送载体，同时拥有穿透细胞膜的能力，而且b-pei支上含有丰富的氨基，易于修饰和接枝羧基，形成牢固的酰胺键。以往研究报道通过b-pei水热合成石墨烯量子点以实现量子点的细胞成像，以及通过低分子量b-pei(1800及以下)与石墨烯量子点在非温和环境中制备氮掺杂石墨烯量子点三色荧光成像，其中低分子量的b-pei对基因的负载能力几乎为零。若能实现高分子量的b-pei的正电荷性质与结构极大的保留，就需要以较为温和的方式实现高分子量的b-pei与石墨烯量子点结合，进而拥有较强的正电荷。众所周知，由于一些纳米载体所带正电荷性越强，越容易与带负电荷的蛋白质相互作用，从而降低载体在血液循环系统中的时间。进而，正因为肿瘤微环境存在ph值为6.7～7.1的酸性条件，因此利用ph敏感的化学键席夫碱键来使得载体在正常生理条件下无断键，而对较低ph值的肿瘤微环境产生特异性反应断键。载体需要设计成在ph为7.4的环境中zeta电位尽可能低，在ph为6.8的肿瘤微环境中zeta电位会变大。因此需要引入静电屏蔽层双醛聚乙二烯，在降低zeta电位的同时降低生物体的免疫反应。
[0009]
进一步地，本发明还提供上述靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)将氧化石墨烯水溶液和过氧化氢水溶液混合制备石墨烯量子点溶液；
[0011]
(2)将步骤(1)得到的石墨烯量子点溶液浓缩，经透析除去反应多余的过氧化氢，再过滤得到高浓度纯净的石墨烯量子点溶液；
[0012]
(3)将步骤(2)得到的石墨烯量子点溶液与支状聚乙烯亚胺水溶液混合均匀，加入催化剂充分反应，所得产物经透析、冷冻干燥得到石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体(gqds/b-pei)；
[0013]
(4)分别配置双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液，然后将二者混合完成自组装，即得。
[0014]
其中，步骤(1)中，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5～1.5g/l，所述过氧化氢水溶液的浓度为25～35vt.％，氧化石墨烯和过氧化氢的质量比为1：(30-90)。
[0015]
步骤(1)中，将氧化石墨烯水溶液和过氧化氢水溶液混合，超声5-30min，然后在150-200℃下水热80-140min，得到稳定绿色荧光的石墨烯量子点溶液。
[0016]
步骤(2)中，石墨烯量子点溶液采用旋转蒸发浓缩除去大部分的水，再将其转移至3500da透析袋中透析48h，每隔12h换一次去离子水，除去反应多余的过氧化氢，最后通过0.22μm的滤膜过滤。
[0017]
步骤(3)中，将石墨烯量子点溶液和支状聚乙烯亚胺水溶液超声10-30min混合均匀，再加入催化剂，搅拌10-50min，然后间隔30min-1h再次加入催化剂，在20-50℃下反应8-12h；反应结束后，收集产物透析、冷冻干燥，即得到单发射石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体粉末。
[0018]
步骤(3)中，所述的支状聚乙烯亚胺的分子量为10k-70k；所述的催化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐；石墨烯量子点与支状聚乙烯亚胺的质量比为(0.1-0.8)：1。
[0019]
步骤(4)中，所述双醛聚乙二醇是通过对甲酸苯甲醛和聚乙二醇通过酯化反应而
成，其中聚乙二醇的分子量为2000；双醛聚乙二醇与石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺质量比为：(0.1-0.8)：1。
[0020]
步骤(4)中，双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液分别采用磷酸缓冲液调节ph值均为7.4。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0022]
(1)本发明利用生物亲和的石墨烯量子点的荧光性质，赋予材料拥有基础的荧光功能，同时降低高分子量型支状聚乙烯亚胺的生物毒性。
[0023]
(2)单独的带负电荷石墨烯量子点进入肿瘤细胞的能力有限，需要借助正电荷的支状聚乙烯亚胺来功能化石墨烯量子点，实现纳米荧光材料有效跨膜。
[0024]
(3)靶向肿瘤微环境中ph值较低的特性，被认为是最有效、最便捷的一种靶向肿瘤的策略，同时采用席夫碱键形成屏蔽体包裹整个材料，可以有效提高材料的血液循环时长，并且双醛聚乙二醇由于苯环的堆叠效应，使得其同样拥有发光致光的荧光能力，进而实现载体双荧光发射。
附图说明
[0025]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0026]
图1是gqds、gqds/b-pei和da-peg的紫外可见光吸收图。
[0027]
图2是gqds、gqds/b-pei的傅里叶变换红外光谱图。
[0028]
图3是gqds/b-pei单发射荧光图。
[0029]
图4是合成da-peg的核磁共振氢谱。
[0030]
图5是纳米双发射载体的双发射荧光图。
[0031]
图6是gqds/b-pei投射电镜图。
[0032]
图7是纳米双发射载体的投射电镜图。
[0033]
图8是gqds、b-pei、gqds/b-pei和纳米双发射载体zeta电位图。
[0034]
图9是b-pei、gqds/b-pei和纳米双发射载体的细胞活力图。
[0035]
图10是纳米双发射荧光载体ph敏感性测试结果。
具体实施方式
[0036]
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
[0037]
实施例1
[0038]
(1)取预先超声10min的1g/l 100ml氧化石墨烯溶液，之后与10ml 30vt.％过氧化氢混合加入到烧杯中磁力搅拌10min。然后，将溶液从烧杯中转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热釜中，放入烘箱反应温度为160℃、反应时间为120min，合成石墨烯量子点溶液。
[0039]
(2)将得到的石墨烯量子点溶液进行旋转蒸发浓缩除去大部分的水，在将其转移至3500da透析袋中透析48h其中每隔12h换一次去离子水，除去反应多余的过氧化氢。最后通过0.22μm的滤膜过滤，获得高浓度纯净的石墨烯量子点溶液，通过紫外确定浓度。
[0040]
(3)将10ml 0.05g/l的石墨烯量子点溶液与10ml 0.1g/l支状聚乙烯亚胺水溶液，超声10min混合均匀。之后与1ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水
溶液一起加入到50ml的单口烧瓶中，室温搅拌20min，再次加入0.5ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水溶液，在35℃下保温搅拌反应12h，得到石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体。
[0041]
(4)将反应后的溶液通过3500da透析袋透析48h，通过冷冻干燥得到纯净的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体粉末。
[0042]
(5)将预先使用磷酸缓冲液配置双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液且ph值均为7.4。然后10ml 0.5g/l双醛聚乙二醇与10ml 1g/l的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体混合超声30min完成自组装，最终形成具有靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体材料。
[0043]
实施例2
[0044]
(1)取预先超声10min的1g/l 100ml氧化石墨烯溶液，之后与20ml 30vt.％过氧化氢混合加入到烧杯中磁力搅拌10min。然后，将溶液从烧杯中转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热釜中，放入烘箱反应温度为170℃、反应时间为100min，合成石墨烯量子点溶液。
[0045]
(2)将得到的石墨烯量子点溶液进行旋转蒸发浓缩除去大部分的水，在将其转移至3500da透析袋中透析72h其中每隔12h换一次去离子水，除去反应多余的过氧化氢。最后通过0.22μm的滤膜过滤，获得高浓度纯净的石墨烯量子点溶液，通过紫外确定浓度。
[0046]
(3)将10ml 0.01g/l的石墨烯量子点溶液与10ml 0.1g/l支状聚乙烯亚胺水溶液，超声10min混合均匀。之后与2ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水溶液一起加入到50ml的单口烧瓶中，室温搅拌20min，再次加入1ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水溶液，在37℃下保温搅拌反应10h，得到石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体。
[0047]
(4)将反应后的溶液通过3500da透析袋透析48h，通过冷冻干燥得到纯净的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体粉末。
[0048]
(5)将预先使用磷酸缓冲液配置双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液且ph值均为7.4。然后10ml 0.1g/l双醛聚乙二醇与10ml 1g/l的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体混合超声30min完成自组装，最终形成具有靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体材料。
[0049]
图1-2分别为合成材料的紫外可见光吸收图和傅里叶变换红外光谱图，通过图1中gqds/b-pei n-π跃迁可以看出材料中包含石墨烯量子点，再结合图2红外图中～1651cm-1
处的酰胺键伸缩峰都可以说明石墨烯量子点和支状聚乙烯亚胺的接枝反应成功。再由图3和图5的荧光光谱以及图4中da-peg的核磁共振氢谱，双醛聚乙二醇本身是拥有荧光性质的，结合gqds/b-pei以后，出现的双荧光性质，即合成了双发射荧光载体材料，得到式(ⅰ)所示结构。结合图6和图7的材料的投射电镜图可以明显看出gqds/b-pei粒径均匀呈现球状的纳米材料，而纳米双发射荧光材料的投射电镜图可以看出材料粒径有所下降呈现纺锤形长的平均尺寸为85nm。
[0050]
图8为原材料以及合成的双发射荧光材料的zeta电位图，通过使用磷酸缓冲液调节待测液在ph为6.8和7.4的条件下测试了gqds、b-pei、gqds/b-pei和双发射荧光材料的zeta电位变化情况，可以得到原本带较强正电荷的b-pei( 41mv，ph＝7.4)通过与带负电荷的gqds(-25mv，ph＝7.4)所形成的gqds/b-pei( 14mv，ph＝7.4)对b-pei的正电荷的减弱程
度比较明显，尤其是在ph＝7.4的环境下。有趣的是，不论是形成gqds/b-pei还是双发射荧光材料，都有一个共同点在于ph＝6.8的zeta电位总是大于ph＝7.4的，而且对于双发射荧光材料来说这样的效应更加明显，这也直接证明通过较低的ph使得席夫碱断裂，脱出部分带负电荷的双醛聚乙二醇，从而暴露出更多正电荷的gqds/b-pei，更有利于附着带负电荷的肿瘤细胞。
[0051]
图9是利用cck-8测试法评估了原材料和所合成材料的生物相容性。当b-pei、gqds/b-pei和双发射荧光材料与hela细胞(104cells)共培养时，添加浓度低于10μg ml-1
时，都表现出较低的细胞毒性，但当所有材料的添加浓度增加到20μg ml-1
，可见b-pei表现出明显的细胞毒性，同时当b-pei结合gqds之后形成gqds/b-pei，hela细胞活力恢复至45％左右，更进一步的结合上双醛聚乙二醇形成纳米双发射荧光材料，hela细胞活力恢复至接近50％。此结果说明石墨烯量子点和双醛聚乙二醇都有降低细胞毒性的作用，石墨烯量子点的作用更加明显。
[0052]
实施例3
[0053]
(1)取预先超声10min的1g/l 100ml氧化石墨烯溶液，之后与30ml 30vt.％过氧化氢混合加入到烧杯中磁力搅拌20min。然后，将溶液从烧杯中转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热釜中，放入烘箱反应温度为170℃、反应时间为90min，合成石墨烯量子点溶液。
[0054]
(2)将得到的石墨烯量子点溶液进行旋转蒸发浓缩除去大部分的水，在将其转移至3500da透析袋中透析72h其中每隔12h换一次去离子水，除去反应多余的过氧化氢。最后通过0.22μm的滤膜过滤，获得高浓度纯净的石墨烯量子点溶液，通过紫外确定浓度。
[0055]
(3)将10ml 0.08g/l的石墨烯量子点溶液与10ml 0.1g/l支状聚乙烯亚胺水溶液，超声30min混合均匀。之后与3ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水溶液一起加入到50ml的单口烧瓶中，室温搅拌20min，再次加入1.5ml 0.1g/l 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐水溶液，在37℃下保温搅拌反应12h，得到石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体。
[0056]
(4)将反应后的溶液通过3500da透析袋透析72h，通过冷冻干燥得到纯净的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体粉末。
[0057]
(5)将预先使用磷酸缓冲液配置双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液且ph值均为7.4。然后10ml 0.8g/l双醛聚乙二醇与10ml 1g/l的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体混合超声30min完成自组装，最终形成具有靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体材料。
[0058]
ph敏感性测试
[0059]
实施例3所得的纳米双发射荧光材料样品装入10000da透析袋中，放入ph值分别为7.4和6.8的溶液中分别测试双醛聚乙二醇在溶液中的浓度变化间接验证材料的ph敏感性，所得结果如图10所示。
[0060]
结果表明，通过ph敏感性测试结果可以看出，所合成的靶向肿瘤纳米双发射荧光载体材料的ph敏感性显著，在模拟正常生理环境ph为7.4中释放量不及在模拟肿瘤微环境ph为6.8中的释放量，可以说明本发明具有一定的ph敏感性。
[0061]
综上，本发明通过支状聚乙烯亚胺对石墨烯量子点进行功能化，克服了量子点单独存在时的局限性(单独量子点的zeta电位值为负值，没用正电荷性质，所以没有靶向肿瘤
的作用)，同时使用双醛聚乙二醇对石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体进行包裹，形成具有ph敏感靶向肿瘤的双荧光纳米载体，增强材料的潜在拓展应用。
[0062]
对比例
[0063]
(1)取预先超声10min的1g/l 100ml氧化石墨烯溶液，之后与20ml 30vt.％过氧化氢混合加入到烧杯中磁力搅拌10min。然后，将溶液从烧杯中转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热釜中，放入烘箱反应温度为170℃、反应时间为100min，合成石墨烯量子点溶液。
[0064]
(2)将得到的石墨烯量子点溶液进行旋转蒸发浓缩除去大部分的水，在将其转移至3500da透析袋中透析72h其中每隔12h换一次去离子水，除去反应多余的过氧化氢。最后通过0.22μm的滤膜过滤，获得高浓度纯净的石墨烯量子点溶液，通过紫外确定浓度。
[0065]
(3)将10ml 0.01g/l的石墨烯量子点溶液与10ml 0.1g/l支状聚乙烯亚胺水溶液，超声10min混合均匀。在37℃下保温搅拌反应10h，得到石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体。
[0066]
(4)将反应后的溶液通过3500da透析袋透析48h，通过冷冻干燥得到纯净的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体粉末。
[0067]
(5)将预先使用磷酸缓冲液配置双醛聚乙二醇水溶液和石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体水溶液且ph值均为7.4。然后10ml 0.1g/l双醛聚乙二醇与10ml 1g/l的石墨烯量子点/支状聚乙烯亚胺结合体混合超声30min完成自组装，最终形成具有靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体材料。
[0068]
对比例在步骤(3)中石墨烯量子点和支状聚乙烯亚胺的反应过程，没有催化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳亚胺盐酸盐的加入。当没有催化剂存在下的石墨烯量子点和支状聚乙烯亚胺的反应微乎其微，酰胺键也没有生成。
[0069]
本发明提供了一种靶向肿瘤酸环境的纳米双发射荧光载体及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。