一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法与流程

一种基于nmaldi-tof技术的多snp位点基因分型方法
技术领域
1.本发明属于snp位点基因分型技术领域，具体涉及一种基于nmaldi-tof技术的多snp位点基因分型方法。


背景技术：

2.核酸质谱检测技术是在maldi-tof原理的基础上，结合引物延伸分析法和碱基特异裂解分析法，针对双链dna的特性进行特殊优化，使样品在电离过程中不产生或产生较少的碎片离子，可检测生物样品中的核酸分子量，是研究基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)的重要手段，这一技术近年来被广泛应用在精准医疗检测项目中。核酸质谱检测分四个步骤完成：
①
样本的dna提取及dna质检；
②
基因位点选择及引物设计、合成与质检；
③
样品dna的3步反应(pcr扩增、sap反应纯化及单碱基延伸反应)；
④
反应产物上样至专用芯片用maldi-tof-ms检测，得到检测结果。用飞行时间质谱技术检测核酸，实验结果稳定，与以凝胶电泳为基础的测序法相比，具有分辨率高、分离速度快、杂质干扰少的优点。质谱技术在基因分型方面的应用有大量文献做深入分析，基因分型检测被广范应用于疾病诊断，是基因分型分析的利器。
3.应用该技术进行基因分型的常规方案在进行pcr扩增、sap反应纯化及单碱基延伸反应，所用操作时间超7.3h，无法当天出检测结果。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，缩短基因分型的操作时间，本发明提供了一种基于nmaldi-tof技术的多snp位点基因分型方法。
5.本发明采用如下技术方案：
6.一种基于nmaldi-tof技术的多snp位点基因分型方法，包括如下步骤：
7.s1、针对待测样本dna的多个snp位点设计并合成探针以及pcr扩增引物，所述探针为拱桥式探针，包括两端的探针结合区和中间的探针臂，所述探针臂为非人类序列；
8.s2、将探针和样本dna进行杂交；
9.s3、在s2的杂交反应产物中加入延伸连接反应液，混匀，然后进行延伸、连接；
10.s4、在s3的反应产物中加入核酸外切酶ⅶ，混匀，进行酶切；
11.s5、在s4的反应产物中加入s5&n7引物的混合液、纯化水、pcr预混液，混匀，进行pcr反应；
12.s6、将s5的反应产物脱盐后，上样至专用芯片用maldi-tof-ms检测，得到检测结果。
13.进一步的，所述探针臂序列为tagatcgctaaggcga。
14.进一步的，所述s5&n7引物序列如下：
15.s5引物：5'-tagatcgc-3'；
16.n7引物：5'-taaggcga-3'。
17.进一步的，s2的杂交反应体系为：x ul的样本dna，1ul的探针mix，1ul的杂交缓冲液，纯化水补足10ul，x表示10～50ng dna样本体积。
18.更进一步的，s2的杂交反应程序为：98℃，5min；60℃，1.5h；4℃，保持。
19.更进一步的，s3中延伸连接反应液的加入量为1ul，延伸、连接的程序均为：60℃，10min；4℃，保持。
20.更进一步的，s4的外切酶混合液加入量为1ul，酶切的反应程序为：37℃，30min；95℃，10min；4℃，保持。
21.更进一步的，s5中加入s5&n7引物的混合液、纯化水、pcr预混液的量依次为25ul、8.5ul、3ul，pcr反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，61℃，30s，72℃，20s，20个循环；72℃，5min；4℃，保持。
22.本发明的有益效果如下：
23.本发明应用分子探针及滚环扩增技术将原来的实验时间缩短了一半，可实现当天完成检测；并且应用分子探针技术可克服因为多重pcr的引物非特异性结合问题，实现更多基因位点检测。
附图说明
24.图1为拱桥式探针模式图。
25.图2为采用对比例1方法(a)和实施例1方法(b)对rs2306283位点的检测结果。
26.图3为采用对比例1方法(a)和实施例1方法(b)对rs4149056位点的检测结果。
27.图4为采用对比例1方法(a)和实施例1方法(b)对rs7412位点的检测结果。
28.图5为采用对比例1方法(a)和实施例1方法(b)对rs429358位点的检测结果。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.应用核酸飞行时间质谱技术(nmaldi-tof)进行基因分型的原理：
31.质谱仪的质量分析器是离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。该技术的实现依托与多重pcr反应、单碱基延伸反应及碱基之间的质量差，因为技术弊端，受多重pcr的影响，该方法无法将同源性高的序列放到一起反应，故限制了其单管反应检测位点数。优化的方案完成抛开现有的操作流程，采用分子探针技术与待检测样本杂交，改造探针样式，从传统的线性探针，改造成拱桥式探针，所有的探针臂上采用非人类序列连接，此改造可在空间上控制探针与样本的杂交，减少非特异性结合，因为所有的探针臂都是相同序列，运用滚环扩增即可将序列数量扩增出来，达到可检测浓度。探针样式如图1所示。
32.实施例1：基于nmaldi-tof技术的多snp位点基因分型方法
33.1、杂交反应
34.1.1取出冰盒、待测样本dna、探针mix、杂交缓冲液，室温解冻，待解冻后涡旋混匀，
瞬时离心，置于冰盒上待用。准备相应数量的pcr管并做好标记。
35.1.2按照下表在200ul pcr管中配制杂交反应体系(10ul)：
36.表1杂交反应体系
[0037][0038]
注：当样本为外周血时，“x”表示10～50ng dna样本体积，推荐50ng。
[0039]
1.3涡旋或吹打混匀，瞬时离心，置于pcr仪上，运行以下程序：
[0040]
表2杂交反应程序
[0041][0042]
注：仪器运行时间约95min。
[0043]
2、延伸、连接
[0044]
2.1取出延伸连接反应液，室温解冻，待解冻完全后涡旋混匀，瞬时离心，置于冰盒上待用。
[0045]
2.2从pcr仪上取下反应管，离心，置于冰盒上，加入1ul延伸连接反应液，涡旋，离心，置于pcr仪上，运行以下程序：
[0046]
表3延伸、连接反应程序
[0047][0048]
注：仪器运行时间约10min。
[0049]
3、酶切
[0050]
3.1取出核酸外切酶ⅶ混合液涡旋混匀，瞬时离心置于冰盒上待用。
[0051]
3.2从pcr仪上取下反应管，离心，置于冰盒上，取2ul混匀后的外切酶(浓度1u/rxn)加入反应管中。
[0052]
3.3涡旋，离心，置于pcr仪上，运行以下程序：
[0053]
表4酶切反应体系
[0054][0055]
注：仪器运行时间约40min。
[0056]
4、pcr反应
[0057]
4.1取出s5&n7引物混合液(0.5μmol)、pcr预混液待解冻完全后涡旋混匀，瞬时离心，置于冰盒上待用。
[0058]
4.2从pcr仪上取下反应管，离心，置于冰盒上，按照下表加入相应试剂。
[0059]
表5pcr反应体系加入组分及体积
[0060][0061]
4.3涡旋混匀，瞬时离心，将反应管置于pcr仪上，运行以下程序：
[0062]
表6 pcr反应程序
[0063][0064][0065]
注：仪器运行时间约40min。
[0066]
5、样本脱盐(以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节)
[0067]
5.1把洁净树脂平铺在96/15mg dimple plate上，风干最少10min。
[0068]
5.2在样本板的每个有样本的孔里加入41ul水然后离心。
[0069]
5.3加入15mg洁净树脂：轻轻将样本凌空反转，放在已放树脂的dimple plate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。
[0070]
5.4用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15min。
[0071]
5.5以3200g(标准板离心机的4000rmp)将板离心5min。
[0072]
5.6把处理好的板放在点样仪上点样，前期处理完成。
[0073]
注：该优化后的实验方案仪器运行时间只需要运行185min，大大缩短了仪器运行时间，可实现当天样本当天检测出报告，该方案运用结合了探针技术，实现了多位点同一管反应检测，无需考虑多重pcr的影响，可大幅度提高位点检测数。
[0074]
对比例1：常规检测(核酸质谱法)
[0075]
1、pcr反应
[0076]
1.1配制1um(每个引物)pcr引物混合物，里面包含多重反应里每个snp位点的正向和反向引物。
[0077]
1.2将库存dna样本稀释成10ng/ul。
[0078]
1.3根据下表配制pcr混液，dna样本和对照不要加在其中。
[0079]
表7 pcr反应体系
[0080][0081]
注：个别机械移液器可能需要预留更多过剩体积；如果低于27重，调整pcr酶到0.5u/反应，以hplc级水补充体积；dna模板的最低/最高量需要进行预实验确定。
[0082]
1.4在每个孔各加2.2ul的pcr混合液，然后把对应孔的dna样本取3.3ul加入反应孔内。用pcr膜把板封好，涡旋震荡短暂离心(4000rpm5s)
[0083]
1.5将96孔板放在pcr仪上进行以下热循环：
[0084]
表8 pcr反应程序
[0085]
[0086]
注：仪器运行时间约2.5个h。
[0087]
2、sap反应
[0088]
2.1根据表9配制sap混液。
[0089]
表9 sap混液
[0090][0091]
2.2加2ulsap混液到每一个孔里(加混液后总体积：7ul)
[0092]
2.3把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5s)。
[0093]
2.4将板放上pcr仪进行以下程序：
[0094]
表10 sap反应程序
[0095][0096]
注：仪器运行时间约45min。
[0097]
3、延伸反应
[0098]
3.1根据“线性调整方法”配制延伸引物混合液，各引物的体积请参照附上的excel表。每个延伸引物(500um)有15ul已预先放在孔a1到c12里，并成干粉状。加15ulpcr grade h2o到每个孔里并且混匀。然后根据线性引物回归表(linear primer regression spreadsheet)混合不同体积的延伸引物到新的管中，并加水至目标体积。
[0099]
3.2把混好的延伸液进行一次质谱测试，根据质谱图来调整各延伸物的浓度。
[0100]
3.3根据下表在1.5ml管中配制iplex延伸混液。
[0101]
表11 iplex延伸混液
[0102][0103]
3.4每个孔加入2ul iplex延伸混液并把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5s)。
[0104]
3.5将96孔板放在pcr仪进行以下热循环。
[0105]
表12延伸反应程序
[0106][0107]
注：仪器运行时间约3个h。
[0108]
4、样本脱盐(以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节。)
[0109]
4.1把洁净树脂平铺在96/15mg dimple plate上，风干最少10min。
[0110]
4.2在样本板的每个有样本的孔里加入41ul水然后离心。
[0111]
4.3加入15mg洁净树脂：轻轻将样本凌空反转，放在已放树脂的dimple plate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。
[0112]
4.4用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15min。
[0113]
4.5以3200g(标准板离心机的4000rmp)将板离心5min。
[0114]
4.6把处理好的板放在点样仪上点样，前期处理完成。
[0115]
注：该常规方案仪器运行时间需要6.5h加上手工操作部分1.5h，完成该实验的操作时间至少需要8个h，此时间还未包括质谱仪检测的时间，故无法满足当天发报告的需求。
[0116]
应用实施例
[0117]
利用实施例1和对比例1的方法分别对slco1b1和apoe基因的snp位点进行基因分型，slco1b1基因的snp位点包括rs2306283和rs4149056，apoe基因的snp位点包括rs7412和rs429358。
[0118]
探针序列见下表，s5&n7引物序列如下：
[0119]
s5引物：tagatcgc；
[0120]
n7引物：taaggcga。
[0121]
对比例1涉及引物存在于商品化的检测试剂盒，且该试剂盒已取得了医疗器械注册证(国械注准20153400245)，由友芝友医疗科技公司生产。
[0122]
表13探针序列
[0123][0124]
注：下划线表示探针臂序列。
[0125]
结果：
[0126]
1)图2a为采用采用对比例1的方法(荧光pcr法)对rs2306283位点的检测结果。其中横坐标代表ct值，纵坐标代表荧光强度，fam通道代表野生型，vic通道代表突变型，rox通道代表质控曲线；图中三个通道均检测到荧光信号(曲线上升)，表示该样本的该位点为杂合型，且结果可靠。
[0127]
图2b为采用实施例1的方法对rs2306283位点的检测结果。其中横坐标代表分子质量大小，纵坐标代表信号强度。其中，实线i位置为探针分子质量位置，虚线ii为突变型(g)分子质量位置，虚线iii为野生型(a)分子质量位置，实线i位置未检测到探针信号，表示该次实验探针已完全反应，虚线ii和虚线iii都有检测到信号，表示该样本该位点为杂合型，与对比例1方法结果一致。
[0128]
2)图3a为采用采用对比例1的方法(荧光pcr法)对rs4149056位点的检测结果。其中横坐标代表ct值，纵坐标代表荧光强度；图中fam通道、rox通道检测到信号，vic通道未检测到信号，表示该样本的该位点为野生型，且结果可靠。
[0129]
图3b为采用实施例1的方法对rs4149056位点的检测结果。其中横坐标代表分子质量大小，纵坐标代表信号强度。其中，虚线i为探针分子质量位置，虚线iii位置为野生型(t)分子质量位置，实线ii位置为突变型(c)分子质量位置；图中虚线i位置未检测到探针信号，表示该次实验探针已完全反应；虚线iii位置有检测到信号，实线ii位置未检测到信号，表示该样本该位点为野生型。与对比例1方法结果一致。
[0130]
3)图4a为采用采用对比例1的方法(荧光pcr法)对rs7412位点的检测结果。其中横坐标代表ct值，纵坐标代表荧光强度；图中fam通道、rox通道检测到信号，vic通道未检测到信号，表示该样本的该位点为野生型，且结果可靠。
[0131]
图4b为采用实施例1的方法对rs7412位点的检测结果。其中横坐标代表分子质量大小，纵坐标代表信号强度。其中，实线i位置为探针分子质量位置，虚线iii位置为为野生型(c)分子质量位置，虚线ii位置为突变型(t)分子质量位置；虚线iii位置有检测到信号，而虚线ii位置未检测到信号，表示该样本该位点为野生型。与对比例1方法结果一致，其余虚线位置为其他基因位点的分子质量位置，与该位点无关。
[0132]
4)图5a为采用采用对比例1的方法(荧光pcr法)对rs429358位点的检测结果。其中横坐标代表ct值，纵坐标代表荧光强度；图中fam通道、rox通道检测到信号，vic通道未检测到信号，表示该样本的该位点为野生型，且结果可靠。
[0133]
图5b为采用实施例1的方法对rs429358位点的检测结果。其中横坐标代表分子质量大小，纵坐标代表信号强度。其中，虚线i位置为探针分子质量位置，虚线iii位置为野生型(t)分子质量位置，实线ii位置为突变型(c)分子质量位置；图中，虚线i位置未检测到探针信号，表示该次实验探针已完全反应；虚线iii位置有检测到信号，实线ii位置未检测到信号，表示该样本该位点为野生型。与对比例1方法结果一致。
[0134]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0135]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。