NADPH氧化酶2作为治疗靶点在制备治疗血管功能紊乱的药物中的应用

nadph氧化酶2作为治疗靶点在制备治疗血管功能紊乱的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及nadph氧化酶2作为治疗靶点在制备治疗血管功能紊乱的药物中的应用。


背景技术：

2.在全球范围包括在我国，心血管病发病率与死亡率均已居于首位，高于肿瘤和其他疾病，严重危害了人类健康。最常见的心血管疾病是冠心病，它是由于心脏冠状动脉(冠脉)血管内产生粥样斑块，使得冠脉管腔狭窄或阻塞，引起心肌缺血、缺氧甚至坏死而导致的疾病。上世纪末发展起来的冠脉支架植入术在狭窄冠脉节段植入金属支架，撑开血管而恢复血运，是目前治疗冠心病的最有效手段。但传统的金属裸支架植入时会导致血管平滑肌细胞的增生与迁移，使得支架植入术后的血管腔再狭窄发生率高居不下。因此，自从本世纪开始，药物涂层支架(drug-eluting stent,des)已发展为治疗冠心病的主要手段。与传统的金属裸支架相比，des通过局部释放抗细胞增殖药物，抑制血管平滑肌细胞的增生与迁移，可显著减少支架植入术后的血管腔再狭窄发生率。目前des的涂层药物主要是mtor抑制剂雷帕霉素(rapamycin，又名西罗莫司sirolimus)及其衍生物依维莫司(everolimus)等。mtor在哺乳动物中参与形成两种复合物，即复合物1(mtorc1)和复合物2(mtorc2)。其中mtorc1由mtor和raptor等形成，通过磷酸化下游底物蛋白s6激酶(s6k)和真核翻译起始因子4e-结合蛋白1(4e-bp1)来调控蛋白质翻译等过程。mtorc2则由mtor和rictor等形成，通过调控下游akt和pkcα的活性，影响细胞骨架重组与细胞生存。雷帕霉素可以快速抑制mtorc1，长时间(如24小时)处理也显著抑制mtorc2。除了作为支架涂层药物，雷帕霉素还广泛应用于临床抗肿瘤治疗以及抗器官移植后排斥反应。虽然广泛应用于临床，许多国际大型临床研究显示，使用雷帕霉素类药物会导致动脉内皮依赖性的血管舒张(endothelial cell-dependent dilatation,edd)功能受损。
3.因此，亟需寻找一种能够治疗和/或预防血管功能紊乱的药物。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中存在的上述技术问题，本技术提供nadph氧化酶2(nox2)作为治疗靶点在制备治疗和/或预防血管功能紊乱的药物中的应用。
5.本技术的第一个目的是提供抑制nadph氧化酶2基因表达的物质在制备治疗和/或预防血管功能紊乱的药物中的应用。
6.进一步的，所述物质能够通过抑制nadph氧化酶2基因表达，从而降低血液中，尤其是动脉血管中的活性氧(ros)含量，抑制enos解偶联，从而提高血液中，尤其是动脉血管中的一氧化氮(no)的含量，进而治疗和/或预防血管功能紊乱。
7.进一步的，所述血管功能紊乱是由mtor抑制剂类药物导致的。
8.进一步的，所述mtor抑制剂药物是雷帕霉素。
9.本技术的第二个目的是提供抑制nadph氧化酶2活性的物质在制备治疗和/或预防血管功能紊乱的药物中的应用。
10.进一步的，所述物质通过降低内皮细胞细胞的p38激酶和/或jnk1/2激酶活性，抑制nadph氧化酶2活性。
11.进一步的，所述物质能够通过抑制nadph氧化酶2活性，从而降低血液中，尤其是动脉血管中的活性氧(ros)含量，抑制enos解偶联，从而提高血液中，尤其是动脉血管中的一氧化氮(no)的含量，进而治疗和/或预防血管功能紊乱。
12.在某个特定的实施例中，所述抑制nadph氧化酶2活性的物质为抑制剂sb203580或sp600125。
13.进一步的，所述血管功能紊乱是由mtor抑制剂类药物导致的。
14.进一步的，所述mtor抑制剂药物是雷帕霉素。
15.本发明的第三个目的是提供降低血液中活性氧含量的物质在制备治疗和/或预防血管功能紊乱的药物中的应用。
16.所述物质降低血液中活性氧含量，抑制enos解偶联，从而提高血液中一氧化氮的含量，进而治疗血管功能紊乱。
17.进一步的，所述血管功能紊乱是由mtor抑制剂类药物导致的。
18.进一步的，所述mtor抑制剂药物是雷帕霉素。
19.本发明的第四个目的是提供nadph氧化酶2作为治疗靶点在制备治疗和/或预防血管功能紊乱的药物中的应用。
20.进一步的，所述血管功能紊乱是由mtor抑制剂类药物导致的。
21.进一步的，所述mtor抑制剂药物是雷帕霉素。
22.本发明的第五个目的是提供一种治疗和/或预防血管功能紊乱的药物，包含抑制nadph氧化酶2基因表达的物质，或包含抑制nadph氧化酶2活性的物质。
23.进一步的，所述血管功能紊乱是由mtor抑制剂类药物导致的。
24.进一步的，所述mtor抑制剂药物是雷帕霉素。
25.与现有技术相比，本技术技术方案具有以下有益效果：
26.本技术首次发现当由于雷帕霉素类药物或其他因素导致mtorc2被抑制时，内皮细胞(endothelial cell,ec)中mapk家族成员p38、jnk1/22激酶被激活。这些mapk家族成员上调nadph氧化酶2(nox2)的表达，从而促进ros在ec中的积累与enos解偶联，ec生成并释放到血管中的no水平降低，而最终导致动脉内皮依赖性的血管舒张edd功能受损。因此，本技术首次提出nox2能够作为治疗靶点在应用于制备治疗血管功能紊乱的药物中。
27.所述物质通过抑制nox2基因表达，或通过抑制ec细胞p38激酶、jnk1/2激酶的活性以抑制nox2活性，能够实现降低血液中ros的水平，抑制enos解偶联，从而提高血液中，尤其是动脉血管中的no水平，改善mtorc2抑制损伤的动脉内皮依赖性的血管舒张功能(edd)，从而降低雷帕霉素等mtor抑制剂药物的副作用、增强治疗效果，或应用于设计新的疗效更好、副作用更低的雷帕霉素等mtor抑制剂类药物。
附图说明
28.图1、腹腔注射雷帕霉素后小鼠的主动脉edd及eid功能。其中图1a为经皮超声检测
血管舒缩功能图像；图1b为小鼠edd功能柱状图；图1c为小鼠eid功能柱状图；*：两组之间p《0.05。
29.图2、敲除ec中mtor基因、敲除ec中rictor基因后的小鼠主动脉edd功能。其中图2a为mtor
ec-/-组小鼠edd功能和经皮超声检测血管舒缩功能图像；图2b为rictor
ec-/-组小鼠edd功能和经皮超声检测血管舒缩功能图像；*：两组之间p《0.05；**：两组之间p《0.01。
30.图3、抑制mtor或mtorc2后小鼠离体血管环的edd功能。其中图3a为mtor
ec-/-组小鼠edd功能；图3b为rictor
ec-/-组小鼠edd功能。；*：两组之间p《0.05；**：两组之间p《0.01；***：两组之间p《0.001。
31.图4、抑制mtor或mtorc2后的小鼠血清no水平。其中图4a为显色法检测野生型对照组和mtor
ec-/-组小鼠血清no水平柱状图；图4b-c为epr法检测野生型对照组和mtor
ec-/-组小鼠血清no水平柱状图及代表图；图4d为显色法检测野生型对照组和rictor
ec-/-组小鼠血清no水平柱状图；图4e-f为epr法检测野生型对照组和rictor
ec-/-组小鼠血清no水平柱状图及代表图；；*：两组之间p《0.05；**：两组之间p《0.01。a和d，显色法；b-c和e-f，epr法。
32.图5抑制mtorc2后对ros的影响。其中图5a为雷帕霉素1小时处理人主动脉ec后以流式细胞仪法检测ros水平；图5b为torin1小时处理人主动脉ec后检测ros水平图5c为雷帕霉素48小时处理人主动脉ec后检测ros水平；图5d为以化学发光法检测雷帕霉素腹腔注射的小鼠血清中ros水平；图5e为mtorec-/-组小鼠血清ros水平；图5f为rictorec-/-组小鼠血清ros水平；图5g为torin处理人主动脉ec后以elisa法检测bh4水平；*：与对照组之间p《0.05；**：与对照组之间p《0.01。
33.图6、抑制nox2后对mtorc2抑制导致的ros累积与no生成障碍的影响。其中图6a为10nm torin处理人主动脉ec(1小时)后检测nox2的mrna水平；图6b为torin处理人主动脉ec后检测nox2的蛋白水平；图6c为ros清除试剂乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac，2mm)或nox抑制剂apocynin(apo，20m)预处理人主动脉ec，再以torin处理后以流式细胞法检测ros水平；图6d为nac或apo预处理人主动脉ec，再以torin处理后以显色法检测no水平；*：与对照组之间p《0.05。
34.图7、抑制mtorc2激活mapk，上调nox2的表达与ros生成。其中图7a为1小时雷帕霉素或torin处理人主动脉ec后检测p38和jnk1/2的磷酸化；图7b-c为分别以p38或jnk1/2抑制剂sb203580(sb)或sp600125(sp)预处理人主动脉ec，再以torin处理后检测nox2的mrna(b)或蛋白(c)表达；图7d为apo预处理人主动脉ec，再以torin处理后检测p38和jnk1/2的磷酸化；图7e为以sb或sp预处理人主动脉ec，再以torin处理后流式细胞仪法检测ros水平；图7f为以sb或sp预处理人主动脉ec，再以torin处理后以显色法检测no水平；*：与对照组之间p《0.05。
35.图8、敲降小鼠ec的nox2基因对mtorc2抑制导致的ros积累与no生成障碍的影响。其中图8a为与aav空载体(aav-gfp)对比，aav-shnox2显著敲降小鼠原代ec中nox2的表达量；图8b为注射aav-gfp或aav-shnox2的内皮rictor基因敲除小鼠血清中的ros含量；图8c为注射aav-gfp或aav-shnox2的内皮rictor基因敲除小鼠血清中的no含量；*：两组之间p《0.05。
36.图9、敲降小鼠ec的nox2基因对mtorc2抑制导致的edd功能损伤的影响。其中图9a为注射aav-gfp或同样剂量的aav-shnox2载体小鼠edd功能柱状图；图9b为注射aav-gfp或
同样剂量的aav-shnox2载体小鼠小鼠eid功能柱状图；**：两组之间p《0.01。
具体实施方式
37.实施例1、腹腔注射雷帕霉素损伤小鼠主动脉edd功能
38.将c57bl/6背景小鼠随机分为对照组和处理组。对照组小鼠腹腔注射玉米油，处理组小鼠腹腔注射2mg/kg体重雷帕霉素，该剂量与临床使用雷帕霉素药物所达到的血液浓度相似。小鼠以腹腔注射1％戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后，取仰卧位，腹部剃毛处理，涂抹耦合剂，以超声仪(vevo 770)检测腹主动脉血管舒张末内径。测量期间，超声探头保持在同一位置不变，分别取3个心动周期的测量平均值。首先，测量基础状态下腹主动脉内径(记为d0)，然后用袖带扎住小鼠右下肢，血压计加压至200mmhg持续2分钟后，迅速解开袖带导致血流改变，从而诱导血管舒张，这种血流介导的舒张依赖于ec。解开袖带后1分钟记录腹主动脉内径(d1)，计算内皮(ec)依赖性血管舒张(edd)＝(d
1-d0)/d0×
100％。小鼠休息15分钟后，舌下含服500μg硝酸甘油，3分钟后记录腹主动脉内径(d2)。由于硝酸甘油导致的血管舒张并不依赖于ec，可计算ec非依赖性血管舒张(eid)＝(d
2-d0)/d0×
100％。结果(图1)显示腹腔注射雷帕霉素可降低edd达31.9％，而对eid没有影响。这与临床使用雷帕霉素药物导致edd功能障碍的发现相一致。
39.实施例2、敲除ec中mtor基因以抑制mtor，或rictor基因以抑制mtorc2，均损伤小鼠主动脉edd功能
40.mtor
flox/flox
和cdh5cre
ert2
小鼠杂交后，最终得到ec特异性mtor基因敲除小鼠(mtor
ec-/-)及其对照(wt)小鼠。同样，rictor
flox/flox
和cdh5cre
ert2
小鼠杂交后，最终得到ec特异性rictor基因敲除小鼠(rictor
ec-/-)及其对照小鼠。选取6周左右mtor
ec-/-和rictor
ec-/-及各自年龄性别相同的野生型小鼠，通过腹腔注射一周他莫昔芬(tamoxifen)诱导ec特异性基因敲除。经皮超声检测血管舒缩功能同上。
41.结果(图2)显示敲除ec中mtor基因以抑制mtor，或敲除ec中rictor抑制mtorc2，均损伤小鼠主动脉edd功能，即ec中mtor或rictor缺失均显著降低edd，降低程度分别为33.9％和41.1％。这表明mtorc2参与维持正常的动脉edd功能，雷帕霉素药物损伤edd功能至少部分是由于ec内mtorc2受到抑制。
42.实施例3、抑制mtor或mtorc2均显著降低离体血管环的edd功能
43.从实施例2处理的mtor
ec-/-或rictor
ec-/-及其对照小鼠分离主动脉血管环，以10-9
～10-5
mol/l浓度以十倍为一个梯度的乙酰胆碱(ach)分别诱导edd，用离体血管张力测量仪(myograph)检测。结果(图3)显示ec中mtor或rictor缺失均显著降低主动脉血管环的edd程度，这与以上体内实验结果相吻合，进一步支持以上抑制mtor药物通过抑制mtorc2损伤edd功能这一结论。
44.实施例4、抑制mtor或mtorc2均显著减低小鼠血清no水平
45.mtor
ec-/-和rictor
ec-/-小鼠及其对照野生型小鼠的配繁见实施例2，即mtor
flox/flox
和cdh5cre
ert2
小鼠杂交后，得到ec特异性mtor基因敲除小鼠(mtor
ec-/-)及其对照(wt)小鼠。同样，rictor
flox/flox
和cdh5cre
ert2
小鼠杂交后，得到ec特异性rictor基因敲除小鼠(rictor
ec-/-)及其年龄性别相同的野生型对照小鼠。选取6周左右mtor
ec-/-和rictor
ec-/-小鼠及各自年龄性别相同的野生型小鼠，通过腹腔注射一周他莫昔芬诱导ec特异性基因敲
除。心脏取血后分离血清，运用试剂盒(a012-1,南京建成)以比色法(图4)测定小鼠血清中no，结果显示mtor
ec-/-和rictor
ec-/-小鼠血清中no分别下降了28.8％和45.8％。以epr仪(a300-10/12)检测cptio的epr信号，同样表明no降低了21.6％和38.1％。这表明mtorc2参与维持no水平，mtor抑制剂素类药物通过抑制ec中mtorc2而抑制no生成。
46.实施例5、抑制mtorc2导致ros生成增加与enos解耦联
47.dhe染色后以流式细胞仪检测人主动脉ec内ros水平显示：雷帕霉素短时间(1nm，1小时)处理(已知该条件仅抑制mtorc1)，不影响人主动脉ec中ros水平(图5a)，但另一种mtor抑制剂torin(10nm,1小时)抑制mtorc2，则促进ros累积(图5b)已知长时间(≥24小时)雷帕霉素处理也抑制mtorc2。48小时处理帕霉素(1nm)处理也升高ec中ros水平(图5c)。同样，以化学发光探针光泽精(lucigenin)检测小鼠血清中ros，发现雷帕霉素腹腔注射的小鼠(图5d)、或者敲除ec中mtor或rictor基因都使得血清中ros升高(图5e-f)。运用试剂盒(jl15170，上海江莱)以elisa法检测细胞bh4水平，结果显示雷帕霉素短时间处理不影响bh4水平，torin处理升高bh4水平。这些结果表明抑制mtorc2，导致ros生成增加以及enos解耦联。
48.实施例6、mtorc2被抑制后nox2的表达上调，ros生成增加
49.nox家族是催化ros生成的重要的酶。在所有nox家族成员中，nox2酶复合物在ec中表达水平最高。torin处理1小时人主动脉ec(购于美国atcc)后，荧光定量pcr检测结果显示nox2酶复合物的核心亚基(也命名为nox2)的mrna上升，western印迹也显示nox2蛋白表达上升(图6a-b)，而雷帕霉素短时间(1小时)处理人主动脉ec则不影响nox2表达(结果未显示)。以2mm非特异的ros清除试剂乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，nac)或20m nox酶抑制剂apocynin(apo)预处理人主动脉ec1小时，再以流式细胞法检测ros，以比色法检测no，结果显示这两种预处理均有效逆转mtorc2抑制所导致的ros累积(图6c)，并改善no水平(图6d)。这些结果表明抑制nox2或直接清除ros，可改善抑制mtor类药物导致的ros累积与no生成障碍。
50.实施例7、nox2活性抑制剂改善抑制mtor类药物所导致的ros累积与no生成障碍
51.雷帕霉素(1nm)或torin(10nm)处理人主动脉ec1小时后，western印迹检测显示：雷帕霉素处理不明显影响p38和jnk1/2的磷酸化，而torin处理抑制mtorc2后则显著升高两者的磷酸化(图7a)。以20m nox2酶抑制剂apocynin(apo)预处理人主动脉ec1小时抑制nox2也抑制p38和jnk1/2的磷酸化(图7c)。
52.以20μm p38抑制剂sb203580或20μm jnk1/2抑制剂sp600125预处理人主动脉ec1小时，再以10nm的torin处理1小时，荧光定量pcr和western印迹检测显示：这些预处理显著降低mtorc2抑制诱导的nox2亚基的mrna和蛋白水平表达(图7b-c)；流式细胞法显示这些预处理有效逆转mtorc2抑制所导致的ros累积(图7d)，改善no水平(图7e)。这些结果表明mtorc2被抑制后，mapk被激活，抑制mapk成员p38或jnk1/2可抑制nox2亚基表达与nox2酶复合物活性，从而改善抑制mtor类药物所导致的ros累积与no生成障碍。
53.实施例8、敲降小鼠ec内nox2基因显著逆转ros积累与no生成障碍
54.委托上海吉凯公司构建了敲降小鼠nox2基因(又名cybb基因，id:13058)的腺相关病毒aav载体(aav-shnox2)。该载体中，两段针对小鼠nox2基因的序列(5
’‑
gcugccagugugucgaaautt-3’,5
’‑
ccuauguuccuguaccuuutt-3’)序列与增强型绿色荧光蛋白
(egfp)和标签蛋白flag编码序列融合。在这些序列上游插入了ec特异的icam2启动子序列，以达到特异敲除ec内nox2的目的。在小鼠原代ec证实了该aav载体可有效敲降nox2基因表达(图8a)。
55.将实施例2获得的内皮rictor敲除小鼠随机分为对照组和处理组。对照组每只小鼠尾静脉注射3
×
10
11
vg剂量的aav空载体(aav-gfp)，处理组注射同样剂量的aav-shnox2载体。以光泽精检测血清中的ros，结果显示注射aav-shnox2的小鼠其血清中的ros显著降低(图8b)。以显色法检测no量，结果显示注射aav-shnox2的小鼠其血清中no水平显著增高(图8c)，证实抑制nox2基因的表达，可通过降低ros生成而有效改善因mtorc2抑制而降低的no水平。
56.实施例9、敲降小鼠ec内nox2基因缓解edd功能损伤
57.将实施例9对照与处理组小鼠经皮超声检测血管舒缩功能，结果显示注射aav-shnox2的小鼠其血流介导的edd功能得到明显改善(图9a)，证实抑制nox2基因的表达，可改善mtorc2抑制损伤的edd功能。注射aav-shnox2的小鼠其eid也有所上升图9b)，进一步证实抑制nox2可治疗和/或预防血管功能紊乱，改善血管舒张功能。