一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体地说，是涉及一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒。
背景技术：
：：2.近十几年来，针对免疫检查点的免疫治疗为治疗恶性肿瘤开辟了一条新的路径。目前以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫治疗药物已被广泛应用于肺癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗中。肿瘤细胞pd-l1的表达目前被认为是抗pd-1/pd-l1治疗的优势人群选择的最合理标志物，晚期肺癌的多项临床试验结果都支持肿瘤细胞pd-l1阳性表达与其疗效及预后相关。3.然而，大量临床实际也发现肿瘤细胞pd-l1表达水平作为免疫治疗疗效预测的生物标志物的存在一定程度欠缺，checkmate017、oak研究都发现pd-l1表达阴性的患者也能从免疫治疗中获益。2018年asco上发表的pembrolizumab联合化疗对比单纯化疗用于转移性鳞癌的keynote407研究中表明在不同pd-l1tps表达情况下均观察到受益，pd-l1《1％、1％～50％和≥50％的hr分别为0.61、0.57和0.6427。4.造成pd-l1作为免疫治疗标志物存在缺陷的原因可能包括：(1)pd-l1的表达受多种机制的调控，一方面包括肿瘤细胞本身癌变过程中的信号通路，而另一方面炎性反应细胞因子，不仅会导致肿瘤细胞pd-l1的表达，还会激发免疫微环境中其他类型细胞pd-l1的表达；(2)pd-l1可以同时表达于肿瘤细胞和免疫细胞，pd-l1检测的可能是肿瘤细胞、免疫细胞或两者共同表达的水平；(3)不同检测pd-l1表达的抗体、不同的检测平台、不同的评价体系都有其不同的阳性临界值，难以形成一个一致的标准去衡量肿瘤细胞pd-l1的表达。5.在实际工作中，我们发现pd-l1表达在患者人群中呈现出明显的偏态分布，阴性表达的病例较多，但临床上完全不能从免疫治疗中获益的患者比例明显少于阴性表达的比例。综上所述，pd-l1的表达对于肿瘤免疫治疗疗效的预测仍然是一个不完美的标志物。6.形成素蛋白(formin)是一类细胞骨架相关蛋白，主要参与单体肌动蛋白聚合成线状丝的过程。所有的形成素蛋白都具有两个特征结构域：fh2结构域，催化肌动蛋白聚合；fh1结构域，结合profilin使肌动蛋白形成fh2结构域。大量研究表明，大部分形成素蛋白在恶性肿瘤中扮演促癌基因的角色，通过介导细胞骨架重构促进肿瘤转移。7.哺乳动物透明基因相关成蛋白1(diaphanous-relatedforminshomology1，diaph1)在近乎所有瘤种中均是形成蛋白家族中丰度最高的成员，且在肿瘤组织中显著高表达。在过去二十余年，已有学者对diaph1在多种肿瘤中的生物学功能进行了研究，结果表明敲低diaph1显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，并促进其凋亡，大量研究证实了diaph1在多种恶性肿瘤中均是一种促癌基因。在分子机制上，除了调控细胞骨架重构外，diaph1还参与介导多种关键的致癌信号，包括egf信号通路、tgfβ1信号通路、age信号通路等。8.目前还未见diaph1与肿瘤免疫相关的任何研究报道，尤其缺乏diaph1蛋白在制备肿瘤免疫治疗疗效预测试剂盒中的应用。技术实现要素：9.发明目的：本发明的目的在于提供一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒。10.技术方案：本发明提供一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法，包括以下步骤：11.将diaph1蛋白作为分子标记，利用diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化试剂，检测diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，根据diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量预测患者对免疫治疗的疗效。12.优选的，所述免疫治疗为抗pd-1免疫治疗。所述肿瘤类型不限，所述pd-1免疫治疗的具体药物包括卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗和信迪利单抗，具体药物应用方式包括单药及联合化疗。13.优选的，所述的通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法，包括以下步骤：14.(a)将肿瘤组织切片进行免疫组化染色；15.(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；16.(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤组织阳性信号强度和染色范围；17.(d)根据评分法则计算肿瘤组织中diaph1蛋白相对表达量，设定标准值，当评分低于或等于标准值，为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切；当免疫组化评分高于标准值，为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。18.进一步优选的，步骤(d)中，所述评分法则如下：染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分；阳性细胞所占比例评分标准：0分：《1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：》76％；染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出免疫反应性得分(immunoreactivityscore，irs)，范围0-12分(注：对细胞染色强度和染色范围预测时只纳入视野中的肿瘤细胞)；所述标准值为2分。19.本发明还提供了一种预测肿瘤免疫治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括以下：20.diaph1单克隆抗体或多克隆抗体和免疫组化试剂。21.优选的，所述免疫组化试剂包括如下：22.2-4％h2o2溶液，0.5-1.5％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。23.本发明最后还提供了所述的试剂盒在预测肿瘤免疫治疗疗效中的应用。24.优选的，所述应用包括以下步骤：25.将diaph1蛋白作为分子标记，利用所述试剂盒，检测diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，根据diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量预测患者对免疫治疗的疗效。26.优选的，所述免疫治疗为抗pd-1免疫治疗。所述肿瘤类型不限，所述pd-1免疫治疗的具体药物包括卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗和信迪利单抗，具体药物应用方式包括单药及联合化疗。27.有益效果：申请人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测diaph1在晚期应用免疫治疗的肿瘤患者组织中的表达量，能够判断患者对于免疫治疗的敏感性。本发明基于diaph1蛋白的表达量与肿瘤免疫治疗的这种相关性，以该蛋白作为分子标记，对其表达量进行检测可以用于肿瘤患者免疫治疗疗效的预测指标，相较于pd-l1表达，diaph1表达对免疫治疗具有更显著的预测价值。28.正是基于以上发现本发明提供了一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒，该方法将diaph1蛋白作为分子标记，利用diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，以及相应的免疫组化试剂，分析diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，预测患者的对免疫治疗的敏感性。29.本发明diaph1蛋白与肿瘤免疫治疗疗效相关性的发现为临床上免疫治疗疗效预测提供了全新的生物标志物。当评分低于或等于2分为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分高于2分为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。因此，检测diaph1表达对于辅助判断晚期肿瘤患者免疫治疗疗效具有重要的指导意义。附图说明30.图1为diaph1与免疫相关基因、pd-l1表达和t细胞炎症评分的相关性。(a)在大部分瘤种中diaph1与免疫调节基因正相关，*表示相关性有统计学差异；(b)在大部分瘤种中diaph1与pd-l1表达正相关；(c)在大部分瘤种中diaph1与t细胞炎症评分正相关；(d，e)在11种肿瘤组织中，diaph1与pd-l1表达正相关。注：针对diaph1和pd-l1的免疫组化检测在多瘤种组织芯片horgc120pg04上进行，该芯片购自上海芯超生物科技有限公司，包括常见癌11种，每种1-6例。31.图2为三个公开数据集中diaph1和pd-l1在不同治疗反应的肿瘤患者中的表达。(a)gse91061数据集中diaph1表达差异显著；(b)gse91061数据集中pd-l1表达无显著差异；(c)gse78220数据集中diaph1表达差异显著；(d)gse78220数据集中pd-l1表达无显著差异；(e)gse165252数据集中diaph1表达差异有统计学趋势；(f)gse165252数据集中pd-l1表达无显著差异。注：*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异。32.图3为不同治疗反应的患者ct示例图、diaph1和pd-l1免疫组化染色示例图及表达差异。(a)pd、sd、pr代表病例的ct图像；(b)pd、sd、pr代表病例的diaph1和pd-l1免疫组化染色；(c)pd、sd、pr病例diaph1表达，diaph1不同治疗反应的肿瘤患者中的表达差异显著；(d)pd、sd、pr病例pd-l1表达，pd-l1不同治疗反应的肿瘤患者中的表达差异显著，但统计学上不如diaph1显著。注：*代表p《0.05，**代表p《0.01，ns代表无统计学差异。33.注：按照recist1.1标准对疗效进行定义，具体为：①完全缓解(completeremission，cr)：所有目标病灶和非目标病灶均消失，且肿瘤标志物正常；②部分缓解(partialremission，pr)：基线病灶长径总和缩小≥30％；③疾病稳定(stabledisease，sd)：缩小未达pr或增加未到pd，1个或多个非目标病灶和/或标志物异常；④疾病进展(progressivedisease，pd)：基线病灶长径总和增加≥20％或出现新病灶，或/和非目标病灶进展。34.图4为diaph1和pd-l1对免疫治疗疗效及预后的预测价值。(a)diaph1表达与治疗反应的关系，diaph1表达对免疫治疗具有显著的预测价值；(b)diaph1表达与预后的相关性，高表达diaph1的患者接受免疫治疗后总生存期更长；(c)pd-l1表达与治疗反应的关系，pd-l1表达对免疫治疗没有显著的预测价值；(d)pd-l1表达与预后的相关性，不同pd-l1表达状态的患者接受免疫治疗后总生存期无明显差异。总的来说，相较于pd-l1表达，diaph1表达对免疫治疗具有更显著的预测价值。注：***代表p《0.001，ns代表无统计学差异；参考pd-l1的表达模式和现有的评分标准，irs为0时，pd-l1是为低表达，其余为高表达。35.注：图中肿瘤的缩写所代表的具体名称见下表。[0036][0037]具体实施方式[0038]下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。[0039]采用本发明方法制得试剂盒，配方为：包括diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，3％h2o2溶液，1％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。[0040]利用上述试剂盒开展实施相关实验。实施示例：[0041]从南京医科大学附属无锡人民医院收集晚期各类型肿瘤患者在接受免疫治疗前留取的穿刺或既往手术样本35例，制作并切取石蜡4mm的组织切片，用于免疫组化染色，具体步骤如下：[0042](1)切片脱腊：二甲苯i①10min→二甲苯ⅱ②10min→二甲苯ⅲ③10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→双蒸水5min[0043](2)灭活酶：在预处理后的切片上滴加3％h2o2溶液，室温放置20min；[0044](3)双蒸水洗5min×3；[0045](4)抗原修复：切片放入1×edta抗原修复液(ph9.0)中煮沸30min；[0046](5)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；[0047](6)1％bsa封闭30min，37℃；[0048](7)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(鼠diaph1单克隆抗体，购自santacruzbiotechnology公司，稀释比例1：500)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；[0049](8)4℃取出，室温复温15min，然后0.01mpbs洗5min×4；[0050](9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)45min，37℃；[0051](10)0.01mpbs洗5min×4，dab显色2-10min，镜下观察；[0052](11)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；[0053](12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；[0054](13)脱水透明，盖玻片覆盖；[0055](14)显微镜下观察阳性染色，于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照；[0056](15)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：[0057]1.肿瘤细胞染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。[0058]2.肿瘤阳性细胞所占比例评分标准：0分：《1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：》76％。[0059]3.染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出irs评分，范围0-12分。[0060]采用以上免疫组化方法的试验步骤检测diaph1蛋白在肿瘤组织中表达情况，当评分低于或等于2分为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分高于2分为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。[0061]试验结果如图1-4所示，由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测diaph1蛋白分子表达量，结果表明diaph1蛋白的表达量与患者免疫治疗疗效存在显著相关性，因此，以diaph1蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测能用于预测患者免疫治疗的疗效。相应的，特异性抗diaph1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备肿瘤免疫治疗疗效预测的试剂盒。[0062]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体地说，是涉及一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒。
背景技术：
：：2.近十几年来，针对免疫检查点的免疫治疗为治疗恶性肿瘤开辟了一条新的路径。目前以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫治疗药物已被广泛应用于肺癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗中。肿瘤细胞pd-l1的表达目前被认为是抗pd-1/pd-l1治疗的优势人群选择的最合理标志物，晚期肺癌的多项临床试验结果都支持肿瘤细胞pd-l1阳性表达与其疗效及预后相关。3.然而，大量临床实际也发现肿瘤细胞pd-l1表达水平作为免疫治疗疗效预测的生物标志物的存在一定程度欠缺，checkmate017、oak研究都发现pd-l1表达阴性的患者也能从免疫治疗中获益。2018年asco上发表的pembrolizumab联合化疗对比单纯化疗用于转移性鳞癌的keynote407研究中表明在不同pd-l1tps表达情况下均观察到受益，pd-l1《1％、1％～50％和≥50％的hr分别为0.61、0.57和0.6427。4.造成pd-l1作为免疫治疗标志物存在缺陷的原因可能包括：(1)pd-l1的表达受多种机制的调控，一方面包括肿瘤细胞本身癌变过程中的信号通路，而另一方面炎性反应细胞因子，不仅会导致肿瘤细胞pd-l1的表达，还会激发免疫微环境中其他类型细胞pd-l1的表达；(2)pd-l1可以同时表达于肿瘤细胞和免疫细胞，pd-l1检测的可能是肿瘤细胞、免疫细胞或两者共同表达的水平；(3)不同检测pd-l1表达的抗体、不同的检测平台、不同的评价体系都有其不同的阳性临界值，难以形成一个一致的标准去衡量肿瘤细胞pd-l1的表达。5.在实际工作中，我们发现pd-l1表达在患者人群中呈现出明显的偏态分布，阴性表达的病例较多，但临床上完全不能从免疫治疗中获益的患者比例明显少于阴性表达的比例。综上所述，pd-l1的表达对于肿瘤免疫治疗疗效的预测仍然是一个不完美的标志物。6.形成素蛋白(formin)是一类细胞骨架相关蛋白，主要参与单体肌动蛋白聚合成线状丝的过程。所有的形成素蛋白都具有两个特征结构域：fh2结构域，催化肌动蛋白聚合；fh1结构域，结合profilin使肌动蛋白形成fh2结构域。大量研究表明，大部分形成素蛋白在恶性肿瘤中扮演促癌基因的角色，通过介导细胞骨架重构促进肿瘤转移。7.哺乳动物透明基因相关成蛋白1(diaphanous-relatedforminshomology1，diaph1)在近乎所有瘤种中均是形成蛋白家族中丰度最高的成员，且在肿瘤组织中显著高表达。在过去二十余年，已有学者对diaph1在多种肿瘤中的生物学功能进行了研究，结果表明敲低diaph1显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，并促进其凋亡，大量研究证实了diaph1在多种恶性肿瘤中均是一种促癌基因。在分子机制上，除了调控细胞骨架重构外，diaph1还参与介导多种关键的致癌信号，包括egf信号通路、tgfβ1信号通路、age信号通路等。8.目前还未见diaph1与肿瘤免疫相关的任何研究报道，尤其缺乏diaph1蛋白在制备肿瘤免疫治疗疗效预测试剂盒中的应用。技术实现要素：9.发明目的：本发明的目的在于提供一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒。10.技术方案：本发明提供一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法，包括以下步骤：11.将diaph1蛋白作为分子标记，利用diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化试剂，检测diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，根据diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量预测患者对免疫治疗的疗效。12.优选的，所述免疫治疗为抗pd-1免疫治疗。所述肿瘤类型不限，所述pd-1免疫治疗的具体药物包括卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗和信迪利单抗，具体药物应用方式包括单药及联合化疗。13.优选的，所述的通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法，包括以下步骤：14.(a)将肿瘤组织切片进行免疫组化染色；15.(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；16.(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤组织阳性信号强度和染色范围；17.(d)根据评分法则计算肿瘤组织中diaph1蛋白相对表达量，设定标准值，当评分低于或等于标准值，为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切；当免疫组化评分高于标准值，为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。18.进一步优选的，步骤(d)中，所述评分法则如下：染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分；阳性细胞所占比例评分标准：0分：《1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：》76％；染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出免疫反应性得分(immunoreactivityscore，irs)，范围0-12分(注：对细胞染色强度和染色范围预测时只纳入视野中的肿瘤细胞)；所述标准值为2分。19.本发明还提供了一种预测肿瘤免疫治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括以下：20.diaph1单克隆抗体或多克隆抗体和免疫组化试剂。21.优选的，所述免疫组化试剂包括如下：22.2-4％h2o2溶液，0.5-1.5％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。23.本发明最后还提供了所述的试剂盒在预测肿瘤免疫治疗疗效中的应用。24.优选的，所述应用包括以下步骤：25.将diaph1蛋白作为分子标记，利用所述试剂盒，检测diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，根据diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量预测患者对免疫治疗的疗效。26.优选的，所述免疫治疗为抗pd-1免疫治疗。所述肿瘤类型不限，所述pd-1免疫治疗的具体药物包括卡瑞利珠单抗、帕博利珠单抗和信迪利单抗，具体药物应用方式包括单药及联合化疗。27.有益效果：申请人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测diaph1在晚期应用免疫治疗的肿瘤患者组织中的表达量，能够判断患者对于免疫治疗的敏感性。本发明基于diaph1蛋白的表达量与肿瘤免疫治疗的这种相关性，以该蛋白作为分子标记，对其表达量进行检测可以用于肿瘤患者免疫治疗疗效的预测指标，相较于pd-l1表达，diaph1表达对免疫治疗具有更显著的预测价值。28.正是基于以上发现本发明提供了一种通过diaph1蛋白预测肿瘤免疫治疗疗效的方法及试剂盒，该方法将diaph1蛋白作为分子标记，利用diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，以及相应的免疫组化试剂，分析diaph1蛋白在肿瘤组织中的表达量，预测患者的对免疫治疗的敏感性。29.本发明diaph1蛋白与肿瘤免疫治疗疗效相关性的发现为临床上免疫治疗疗效预测提供了全新的生物标志物。当评分低于或等于2分为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分高于2分为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。因此，检测diaph1表达对于辅助判断晚期肿瘤患者免疫治疗疗效具有重要的指导意义。附图说明30.图1为diaph1与免疫相关基因、pd-l1表达和t细胞炎症评分的相关性。(a)在大部分瘤种中diaph1与免疫调节基因正相关，*表示相关性有统计学差异；(b)在大部分瘤种中diaph1与pd-l1表达正相关；(c)在大部分瘤种中diaph1与t细胞炎症评分正相关；(d，e)在11种肿瘤组织中，diaph1与pd-l1表达正相关。注：针对diaph1和pd-l1的免疫组化检测在多瘤种组织芯片horgc120pg04上进行，该芯片购自上海芯超生物科技有限公司，包括常见癌11种，每种1-6例。31.图2为三个公开数据集中diaph1和pd-l1在不同治疗反应的肿瘤患者中的表达。(a)gse91061数据集中diaph1表达差异显著；(b)gse91061数据集中pd-l1表达无显著差异；(c)gse78220数据集中diaph1表达差异显著；(d)gse78220数据集中pd-l1表达无显著差异；(e)gse165252数据集中diaph1表达差异有统计学趋势；(f)gse165252数据集中pd-l1表达无显著差异。注：*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异。32.图3为不同治疗反应的患者ct示例图、diaph1和pd-l1免疫组化染色示例图及表达差异。(a)pd、sd、pr代表病例的ct图像；(b)pd、sd、pr代表病例的diaph1和pd-l1免疫组化染色；(c)pd、sd、pr病例diaph1表达，diaph1不同治疗反应的肿瘤患者中的表达差异显著；(d)pd、sd、pr病例pd-l1表达，pd-l1不同治疗反应的肿瘤患者中的表达差异显著，但统计学上不如diaph1显著。注：*代表p《0.05，**代表p《0.01，ns代表无统计学差异。33.注：按照recist1.1标准对疗效进行定义，具体为：①完全缓解(completeremission，cr)：所有目标病灶和非目标病灶均消失，且肿瘤标志物正常；②部分缓解(partialremission，pr)：基线病灶长径总和缩小≥30％；③疾病稳定(stabledisease，sd)：缩小未达pr或增加未到pd，1个或多个非目标病灶和/或标志物异常；④疾病进展(progressivedisease，pd)：基线病灶长径总和增加≥20％或出现新病灶，或/和非目标病灶进展。34.图4为diaph1和pd-l1对免疫治疗疗效及预后的预测价值。(a)diaph1表达与治疗反应的关系，diaph1表达对免疫治疗具有显著的预测价值；(b)diaph1表达与预后的相关性，高表达diaph1的患者接受免疫治疗后总生存期更长；(c)pd-l1表达与治疗反应的关系，pd-l1表达对免疫治疗没有显著的预测价值；(d)pd-l1表达与预后的相关性，不同pd-l1表达状态的患者接受免疫治疗后总生存期无明显差异。总的来说，相较于pd-l1表达，diaph1表达对免疫治疗具有更显著的预测价值。注：***代表p《0.001，ns代表无统计学差异；参考pd-l1的表达模式和现有的评分标准，irs为0时，pd-l1是为低表达，其余为高表达。35.注：图中肿瘤的缩写所代表的具体名称见下表。[0036][0037]具体实施方式[0038]下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。[0039]采用本发明方法制得试剂盒，配方为：包括diaph1单克隆抗体或多克隆抗体，3％h2o2溶液，1％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。[0040]利用上述试剂盒开展实施相关实验。实施示例：[0041]从南京医科大学附属无锡人民医院收集晚期各类型肿瘤患者在接受免疫治疗前留取的穿刺或既往手术样本35例，制作并切取石蜡4mm的组织切片，用于免疫组化染色，具体步骤如下：[0042](1)切片脱腊：二甲苯i①10min→二甲苯ⅱ②10min→二甲苯ⅲ③10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→双蒸水5min[0043](2)灭活酶：在预处理后的切片上滴加3％h2o2溶液，室温放置20min；[0044](3)双蒸水洗5min×3；[0045](4)抗原修复：切片放入1×edta抗原修复液(ph9.0)中煮沸30min；[0046](5)自然冷却至室温，双蒸水洗5min×3；[0047](6)1％bsa封闭30min，37℃；[0048](7)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(鼠diaph1单克隆抗体，购自santacruzbiotechnology公司，稀释比例1：500)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；[0049](8)4℃取出，室温复温15min，然后0.01mpbs洗5min×4；[0050](9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)45min，37℃；[0051](10)0.01mpbs洗5min×4，dab显色2-10min，镜下观察；[0052](11)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；[0053](12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；[0054](13)脱水透明，盖玻片覆盖；[0055](14)显微镜下观察阳性染色，于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照；[0056](15)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：[0057]1.肿瘤细胞染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。[0058]2.肿瘤阳性细胞所占比例评分标准：0分：《1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：》76％。[0059]3.染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出irs评分，范围0-12分。[0060]采用以上免疫组化方法的试验步骤检测diaph1蛋白在肿瘤组织中表达情况，当评分低于或等于2分为diaph1蛋白低表达，患者对免疫治疗不敏感，临床获益不确切。当免疫组化评分高于2分为diaph1蛋白高表达，患者对免疫治疗敏感，临床获益显著。[0061]试验结果如图1-4所示，由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测diaph1蛋白分子表达量，结果表明diaph1蛋白的表达量与患者免疫治疗疗效存在显著相关性，因此，以diaph1蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测能用于预测患者免疫治疗的疗效。相应的，特异性抗diaph1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备肿瘤免疫治疗疗效预测的试剂盒。[0062]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。当前第1页12当前第1页12
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