胶束纳米颗粒及其用途
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技术领域
3.本公开提供了可以用于递送阴离子有效负载(例如，寡核苷酸)穿过生理渗透屏障例如脑血屏障的阳离子载体单元和胶束系统。
背景技术：
4.体内存在某些屏障，限制了药物通过膜的渗透性。因此，只有选择性物质才能通过这种类型的膜。一些重要和专门的生理屏障是血脑屏障和细胞膜。血脑屏障(bbb)是一种高度选择性的半透性边界，它将循环血液与脑和中枢神经系统(cns)的胞外液分开。血脑屏障由毛细血管壁的内皮细胞、包裹毛细血管的星形胶质细胞末端足和嵌入毛细血管基底膜的周细胞形成。该系统允许水、一些气体和脂溶性分子通过被动扩散，以及对神经功能至关重要的分子(诸如葡萄糖和氨基酸)的选择性运输来通过。
5.血脑屏障限制病原体的通过，血液中的溶质以及大分子或亲水性分子扩散进入脑脊液(csf)，同时允许o2、co2、疏水性分子(例如，激素)和小极性分子的扩散(johansen等人,(2017)journal of cerebral blood flow and metabolism.epub(4):659-668)。bbb几乎从脑中排除了100％的大分子神经治疗剂和超过98％的所有分子药物。daneman&prat(2015)“the blood brain barrier”cold spring harbor perspectives in biology 7(1):a020412。克服将治疗剂递送到脑特定区域的困难是治疗大多数脑部病症的主要挑战。因此，在诊断和治疗中可能有效的治疗分子不能以足够的量跨过bbb。
6.胞内靶向也常常具有挑战性，因为要到达胞质溶胶，外源性分子必须首先穿过细胞膜。细胞膜可选择性渗透非极性治疗剂，非极性治疗剂是脂溶性的并且可以通过细胞膜。在另一个方面，高电荷治疗剂(诸如寡核苷酸)被细胞膜有效排除。
7.由于带负电的膜和多核苷酸上的高负电荷之间的电荷排斥，多核苷酸不容易渗透细胞膜。因此，多核苷酸的生物利用率和细胞摄取率都很低，通常小于1％(dheur等人,nucleic acid drug dev.,9:522(1999)；park等人,j controlled release,93:188(2003))。由于大多数多核苷酸通常在5,000da以上，因此它们不容易通过细胞膜扩散，并且被细胞的摄取主要限于胞饮或内吞过程。一旦进入细胞，多核苷酸就可以在溶酶体区室中积聚，从而限制它们进入细胞质或细胞核。肠胃外施用的多核苷酸也对细胞质内外的快速核酸酶降解高度敏感。研究表明，静脉内施用后血液中的多核苷酸会快速降解，半衰期为约30分钟(geary等人,j.pharmacol.exp.ther.296:890-897(2001))。
8.因此，多核苷酸(例如，反义寡核苷酸)的递送所面临的问题可以大致分为两个部分。首先，治疗性多核苷酸必须以能够被递送到细胞质的方式进行配制，其次，多核苷酸必
须完整且功能齐全地到达细胞核。虽然寡核苷酸和寡核苷酸类似物作为治疗剂的应用取得了进展，但是仍需要提供改善的药理学性质(例如，血清稳定性、递送至正确的器官、组织或细胞以及跨膜递送)的递送系统。
9.旨在改善核酸和寡核苷酸的跨膜递送的工作已经利用了蛋白质载体、抗体载体、脂质体递送系统、电穿孔、直接注射、细胞融合、病毒运载体和磷酸钙介导的转化。然而，很多这些技术受到启用跨膜运输的细胞类型和实现这种运输所需的条件的限制。因此，需要能够将带电的治疗剂(例如，反义寡核苷酸，诸如antimir)选择性地引导至特定靶细胞或组织，并且跨过渗透屏障(例如，质膜或bbb)，同时改善血清稳定性和/或对内源性裂解酶(例如，rna酶)的耐性的递送系统。
技术实现要素：
10.本公开提供了一种阳离子载体单元，所述阳离子载体单元包括
11.[wp]-l1-[cc]-l2-[am]
ꢀꢀ
(架构i)
[0012]
或
[0013]
[wp]-l1-[am]-l2-[cc]
ꢀꢀ
(架构ii)
[0014]
其中
[0015]
wp是水溶性生物聚合物部分；
[0016]
cc是带正电的载体部分；
[0017]
am是佐剂部分；以及，
[0018]
l1和l2是独立地任选的接头，并且
[0019]
其中当与核酸以约1:1的离子比混合时，阳离子载体单元形成胶束。
[0020]
在一些方面，水溶性聚合物包括聚(亚烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(“poz”)、聚(n-丙烯酰基吗啉)、或它们的任何组合。在一些方面，水溶性聚合物包括聚乙二醇(“peg”)、聚甘油、或聚(丙二醇)(“ppg”)。在一些方面，水溶性聚合物包括：
[0021][0022]
其中n为1-1000。
[0023]
在一些方面，n为至少约110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140、或至少约141。在一些方面，n为约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约140至约150、或约150至约160。
[0024]
在一些方面，水溶性聚合物是直链的、支链的或树枝状的。在一些方面，阳离子载体部分包含一个或多个碱性氨基酸。在一些方面，阳离子载体部分包含至少三、至少四、至少五、至少六、至少七、至少八、至少九、至少十、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至
少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、或至少50个碱性氨基酸。
[0025]
在一些方面，阳离子载体部分包含约30至约50个碱性氨基酸。在一些方面，碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些方面，阳离子载体部分包含约40个赖氨酸单体。
[0026]
在一些方面，佐剂部分能够调节免疫反应、炎症反应或组织微环境。在一些方面，佐剂部分能够调节免疫反应。在一些方面，佐剂部分能够调节患有肿瘤的受试者的肿瘤微环境。
[0027]
在一些方面，佐剂部分能够抑制或减轻所述肿瘤微环境中的缺氧。在一些方面，佐剂部分包括咪唑衍生物、氨基酸、维生素或它们的任何组合。
[0028]
在一些方面，佐剂部分包含：
[0029][0030]
其中
[0031]
(i)g1和g2中的每一个独立地选自h、芳环或1-10个烷基；或者，
[0032]
(ii)g1和g2共同形成芳环；以及，
[0033]
其中n为1-10。
[0034]
在一些方面，佐剂部分包括硝基咪唑。在一些方面，佐剂部分包括甲硝唑、替硝唑、尼莫唑、地美硝唑、普托马尼、奥硝唑、美格唑、阿扎硝唑、苄硝唑、或它们的任何组合。在一些方面，佐剂部分包括氨基酸。在一些方面，佐剂部分包含
[0035][0036]
其中ar是以及
[0037]
其中z1和z2中的每一个独立地选自h和oh。
[0038]
在一些方面，佐剂部分能够抑制或减少炎症反应。在一些方面，佐剂部分是维生素。在一些方面，维生素包括环状环或环状杂原子环和羧基或羟基。
[0039]
在一些方面，维生素包含：
[0040][0041]
其中y1和y2中的每一个独立地选自c、n、o和s，并且其中n为1或2。
[0042]
在一些方面，维生素选自由以下组成的组：维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b6、维生素b7、维生素b9、维生素b12、维生素c、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素m、维生素h、以及它们的任何组合。在某些方面，维生素是维生素b3。
[0043]
在一些方面，佐剂部分包含至少约二、至少约三、至少约四、至少约五、至少约六、至少约七、至少约八、至少约九、至少约十、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、或至少约20个维生素b3单元。在一些方面，佐剂部分包含至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、或至少约50个维生素b3单元。在一些方面，佐剂部分包含约10个维生素b3单元。在一些方面，佐剂部分包含约20个维生素b3单元。在一些方面，佐剂部分包含约30个维生素b3单元。在一些方面，佐剂部分包含约40个维生素b3单元。
[0044]
在一些方面，阳离子载体单元包含大致上具有约120至约130个peg单元的水溶性生物聚合物部分、包含具有约30至约40个赖氨酸单元的聚赖氨酸的阳离子载体部分、以及具有约5至约10个维生素b3单元的佐剂部分。在一些方面，阳离子载体单元还包含阴离子有效负载，所述阴离子有效负载通过离子键与所述阳离子载体单元相互作用。
[0045]
在一些方面，阳离子载体单元包含大致上具有约120至约130个peg单元的水溶性生物聚合物部分、包含具有约70至约90个赖氨酸单元(例如，约80个赖氨酸单元)的聚赖氨酸的阳离子载体部分、以及具有约20至约40个维生素b3单元(例如，约30个维生素b3单元)的佐剂部分。在一些方面，阳离子载体单元还包含阴离子有效负载，所述阴离子有效负载通过离子键与所述阳离子载体单元相互作用。
[0046]
本公开还提供了一种包含本文公开的所述阳离子载体单元和阴离子有效负载的胶束，其中所述阳离子载体复合物的所述阳离子载体部分和所述阴离子有效负载彼此缔合。在一些方面，缔合是共价键。在其他方面，缔合是非共价键。在一些方面，缔合是离子键。
[0047]
在一些方面，当在溶液中与阴离子有效负载混合时，阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷足以形成胶束，其中所述溶液中的阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷与阴离子有效负载的负电荷的总离子比为约1:1。在一些方面，阳离子载体单元能够保护阴离子有效负载免受dna酶和/或rna酶降解。在一些方面，阴离子有效负载不通过共价键与所述阳离子载体单元缀合，和/或所述阴离子有效负载仅通过离子相互作用与所述阳离子载体单元的所述阳离子载体部分相互作用。
[0048]
在一些方面，与未掺入胶束的游离的阴离子有效负载的半衰期相比，所述阴离子有效负载的半衰期延长。在一些方面，胶束中的阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷与阴离子有效负载的负电荷的离子比为约3:1、约2.9:1、约2.8:1、约2.7:1、约2.6:1、约2.5:1、约2.4:1、约2.3:1、约2.2:1、约2:1、约2:1、约1.9:1、约1.8:1、约1.7:1、约1.6:1、约1.5:1、约1.4:1、约1.3:1、约1.2:1、约1.1:1、约1:1、约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、或约1:3。在一些方面，胶束中的阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷与阴离子有效负载的负电荷的离子比为约3:1至约1:3。在一些方面，胶束中的阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷与阴离子有效负载的负电荷的电荷比为1:1。在一些方面，胶束的直径在约1nm和100nm之间、在约10nm和约100nm之间、在约10nm和约90nm之间、在约10nm和约80nm之间、在约10nm和约70nm之间、在约20nm
和约100nm之间、在约20nm和约90nm之间、在约20nm和约80nm之间、在约20nm和约70nm之间、在约30nm和约100nm之间、在约30nm和约90nm之间、在约30nm和约80nm之间、在约30nm和约70nm之间、在约40nm和约100nm之间、在约40nm和约90nm之间、在约40nm和约80nm之间、或在约40nm和约70nm之间。
[0049]
在一些方面，阴离子有效负载包含核酸。在一些方面，核酸包括mrna、mirna、mirna海绵(mirna sponge)、坚韧诱饵mirna(tough decoy mirna)、antimir、小rna、rrna、sirna、shrna、gdna、cdna、pdna、pna、bna、反义寡核苷酸(aso)、适体、环状二核苷酸、或它们的任何组合。在一些方面，核酸包含至少一种核苷类似物。在一些方面，核苷类似物包括锁核酸(lna)；2'-0-烷基-rna；2'-氨基-dna；2'-氟-dna；阿拉伯糖核酸(ana)；2'-氟-ana、己糖醇核酸(hna)、嵌入核酸(ina)、受约束乙基核苷(cet)、2'-0-甲基核酸(2'-ome)、2'-0-甲氧基乙基核酸(2'-moe)、或它们的任何组合。
[0050]
在一些方面，核酸包含长度为5至30个核苷酸的核苷酸序列。在一些方面，核苷酸序列的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。在一些方面，核苷酸序列具有骨架，所述骨架包含磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、以及它们的组合。在一些方面，阳离子载体单元还包含靶向部分，所述靶向部分任选地通过接头连接至所述水溶性聚合物。
[0051]
在一些方面，靶向部分能够靶向组织。在一些方面，组织是肝、脑、肾、肺、卵巢、胰腺、甲状腺、乳房、胃、或它们的任何组合。在一些方面，组织是癌组织。在一些方面，组织是肝。在一些方面，肝靶向部分包括胆固醇。在一些方面，组织是胰腺。在一些方面，胰腺靶向部分包括结合至整合素受体的配体。
[0052]
在一些方面，靶向部分靶向中枢神经系统。在一些方面，脑靶向部分能够由大型中性氨基酸转运蛋白1(lat1)转运。在一些方面，脑靶向部分是氨基酸。在一些方面，脑靶向部分包括支链或芳族氨基酸。在一些方面，氨基酸是缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸。在一些方面，氨基酸是色氨酸和/或酪氨酸。
[0053]
本公开还提供了一种包含本文公开的所述阳离子载体单元和带负电的分子的组合物。还提供了一种包含本文公开的阳离子载体单元、组合物或胶束以及药学上可接受的载体的药物组合物。
[0054]
本公开还提供了一种制备本文公开的阳离子载体单元的方法，所述方法包括合成阳离子载体单元。在一些方面，制备本文公开的胶束的方法包括将阳离子载体单元与带负电的分子以1:1的离子比在溶液中混合。在一些方面，方法还包括纯化胶束。
[0055]
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括将本公开的胶束施用于受试者。在一些方面，胶束的核心中的所述阴离子有效负载表现出比相应的未整合进胶束中的阴离子有效负载更长的半衰期。在一个方面，受试者是哺乳动物。
[0056]
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的胶束施用于受试者。在一些方面，癌症是胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、或宫颈癌。在一些方面，胰腺癌是胰腺腺癌。
[0057]
本公开还提供了一种减轻患有神经退行性疾病的受试者的炎症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的胶束施用于受试者。
[0058]
本公开还提供了一种恢复和/或诱导患有神经退行性疾病的受试者的神经发生的
方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的胶束施用于受试者。
[0059]
本公开还提供了一种改善患有神经退行性疾病的受试者的认知功能的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的胶束施用于受试者。
[0060]
在一些方面，神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
[0061]
本公开还提供了一种减少患有阿尔茨海默氏病的受试者的淀粉样蛋白斑块负荷的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的胶束施用于受试者。
[0062]
在一些方面，胶束包含靶向lat1的阳离子载体单元和有效负载，所述有效负载包含靶向mirna-485-3p的反义寡核苷酸(例如，seq id no:18的反义寡核苷酸)或其片段、变体或衍生物。在一些方面，片段包含seq id no:18的14、15、16、17、18、19、20、或21个连续核苷酸。在一些方面，变体与seq id no:18具有至少70％序列同一性。在一些方面，衍生物包含至少一个糖修饰和/或至少一个骨架修饰。
附图说明
[0063]
图1显示了本公开的载体单元的示例性构造。示例性载体单元包括任选的组织特异性靶向部分、水溶性聚合物以及阳离子或阴离子载体单元(它们可以分别与阴离子或阳离子有效负载相互作用)。在一些方面，阳离子/阴离子载体和阴离子/阳离子有效负载不被束缚并且发生静电相互作用。在一些方面，阳离子/阴离子载体和阴离子/阳离子有效负载被束缚并且发生静电相互作用。为简单起见，可以在水溶性聚合物和阳离子/阴离子载体之间或在阳离子/阴离子载体之后末端的佐剂部分未在图中描绘。
[0064]
图2显示了一种使用本公开的载体单元来负载中性有效负载的替代方法，其中中性有效负载(例如，疏水性治疗剂)共价连接至接头，继而可以与载体单元的阳离子或阴离子载体部分发生静电相互作用。
[0065]
图3显示了本公开的载体单元的示例性构造。所提供的实例包括阳离子载体部分，所述阳离子载体部分可以与阴离子有效负载发生静电相互作用，例如靶向基因的核酸，诸如反义寡核苷酸，例如mirna(antimir)。在一些方面，am可以定位于wp和cc之间。为简单起见，cc和am组件以线性排列方式描绘。然而，如图4所示，cc和am可以以支架的方式排列。
[0066]
图4显示了包含脑靶向部分的载体单元的1h-nmr特征，所述脑靶向部分在与阴离子有效负载结合之后可以形成胶束结构。与脑靶向部分对应的1h-nmr图(标记为“脑靶分子”)显示脑靶向部分(含有与脑内皮上的lat1靶标结合的环结构的氨基酸部分)得以成功合成。第二1h-nmr图(标记为“聚合物”)显示阳离子peg嵌段共聚物(另外包含阳离子载体部分和佐剂部分)也得以合成。
[0067]
图5是显示本公开的载体单元如何插入胶束的示意图，其中组织特异性靶向部分将装饰胶束的外表面，并且核酸有效负载将定位于例如胶束的核心(聚离子复合物反义寡核苷酸)处。
[0068]
图6显示了如何通过改变水溶性生物聚合物(例如，peg)和阳离子载体(例如，聚赖氨酸)之间的比率来改变本公开的胶束的形状和大小以及因此改变负载能力。根据比率，载体单元可以组织为小颗粒、小胶束、胶束、棒状结构或聚合物囊泡。应当理解，术语“本公开的胶束”不仅涵盖经典胶束，而且还涵盖小颗粒、小胶束、胶束、棒状结构或聚合物囊泡。
[0069]
图7显示了包含在本公开的胶束中的有效负载被递送至中枢神经系统中的靶标位
置的机制的示意图。胶束通过受体介导的转胞吞作用来跨过血脑屏障，随后通过脑细胞(例如，神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞)进行细胞更新。胶束在细胞质中去组装，导致有效负载(例如，抗mirna)释放，所述有效负载在与靶标mrna结合时抑制或下调靶标mrna编码的蛋白质的表达。
[0070]
图8显示了由于有效负载包封在本公开的胶束中而导致的稳定性增加(血浆半衰期增加)。在不存在胶束的情况下，抗微rna(antimir)的血浆半衰期小于5分钟。在本公开的胶束掺入后，antimir的血浆半衰期增加至80-120分钟。在包封后，实例中公开的antimir的半衰期从小于5分钟增加到大约93分钟(即，血浆半衰期增加大约20倍)。
[0071]
图9显示了在pbs中的本公开的负载有寡核苷酸(例如，抗mirna)的胶束的粒度分布。负载有寡核苷酸(例如，抗mirna)的胶束显示出32nm粒度，以及低pdi(多分散性指数)分布，这表明胶束群是同质的。
[0072]
图10显示了lat1(slc7a5)溶质载体家族7成员5[智人(homo sapiens)(人)]在不同组织中的分布。数据来自ncbi，对应于来自20个人组织的总rna的rna测序。
[0073]
图11显示了不同小鼠组织中的体内lat1表达水平。
[0074]
图12显示了使用本公开的脑靶向载体单元的lat1靶向。荧光(cy5.5)标记的脑靶向载体单元与在脑实质中表达的lat1结合，并且显示出比非靶向cy5.5分子更高的积聚。
[0075]
图13显示了人小胶质细胞、星形胶质细胞、神经母细胞样sh-5y细胞和原代肝细胞对负载有cy5.5标记的抗微rna胶束的细胞摄取。在每种类型的细胞与cy5.5一起孵育后，将标记的抗微rna转染至细胞中，并且使用incucyte成像平台跟踪荧光图像48小时。抗微rna在人脑细胞(小胶质细胞、星形胶质细胞、sh-5y)中的摄取显著，但是在肝细胞(肝细胞系)中未观察到摄取。
[0076]
图14显示了gl-26细胞中的lat1靶向性的比较，gl-26细胞在其表面上过表达lat1。图中显示了经过和未经过lat1抑制剂处理的细胞。靶向胶束的摄取比观察到的非靶向胶束的吸收高3倍。当lat1被抑制时，未观察到非靶标和靶标胶束之间的摄取的显著差异。
[0077]
图15比较了游离的cy5.5标记的抗微rna和负载至本公开的胶束中的cy5.5标记的抗微rna(aso-mds；反义寡核苷酸-胶束递送系统)在静脉内注射后的生物分布。在通过注射将两种样品施用至小鼠后，以16小时的时间间隔捕获全身荧光图像。
[0078]
图16显示了与裸抗mirna施用(裸aso)相比，本公开的负载有抗mirna的胶束(aso-mds)的脑积聚。负载有cy5.5标记的抗mirna的胶束静脉内注射，并且在脑组织裂解后测量剩余的荧光强度。与非靶向胶束相比，脑靶向胶束显示出显著的脑积聚。
[0079]
图17显示了实验程序的示意图。aso-mds胶束(即，包含lat1靶向部分和针对mirna 485-3p有效负载的antimir的本公开的胶束)在8月龄5xfad转基因小鼠中每周注射达4周。aso-mds包含(i)针对mir485-3p的antimir和(ii)100个阳离子载体单元，其中50个阳离子载体单元中的每一个都连接至苯丙氨酸(靶向部分)，并且50个阳离子载体单元中的每一个都不连接至任何靶向部分。aso-mds中的阳离子载体单元中的每一个包含与47个赖氨酸融合的(peg)
5000
，其中10个赖氨酸中的每一个都连接至烟酰胺，即在一个阳离子载体单元中总共有10个烟酰胺。
[0080]
图18a显示了在aso-mds处理后小鼠原代神经胶质细胞中的aβ吞噬作用的增强。
[0081]
图18b显示了在aso-mds处理后小鼠原代小胶质细胞中的aβ吞噬作用的增强。
[0082]
图18c显示了在aso-mds处理后小鼠原代小胶质细胞中的aβ吞噬作用的增强。图像显示了对照或aso-mds处理的原代小胶质细胞中的iba1(小胶质细胞)和β-淀粉样蛋白1-16(6e10，用于检测aβ斑块)的免疫细胞计数。
[0083]
图19a显示5xfad小鼠海马体中的aso-mds递送减少了神经炎症。图像显示了来自模拟物(仅mir和仅胶束(分别为左图和中图))和aso-mds处理的5xfad小鼠(右图)的冠状脑切片中的抗tnf-α(上图)和gfap(下图)的免疫组织化学染色。(
×
20)n＝3。
[0084]
图19b显示了图19a中的相同的数据的柱状图。左侧条柱为仅mir，中间条柱为仅胶束，右侧条柱为胶束 mir。
[0085]
图20a显示5xfad小鼠皮质中的aso-mds递送减少了神经炎症。图像显示了来自模拟物(仅mir和仅胶束(分别为左图和中图))和aso-mds处理的5xfad小鼠(右图)的冠状脑切片中的抗tnf-α(上图)和gfap(下图)的免疫组织化学染色。(
×
20)n＝3。
[0086]
图20b显示了图20a中的相同的数据的柱状图。左侧条柱为仅mir，中间条柱为仅胶束，右侧条柱为胶束 mir。
[0087]
图21a显示aso-mds递送减少了5xfad中的淀粉样蛋白斑块负荷。在模拟物(仅mir和仅胶束(分别为左图和中图))或aso-mds(右图)施用后海马体中的齿状回的免疫组织化学分析。脑切片中的弥漫性斑块被抗淀粉样蛋白β(克隆6e10)和细胞核染色。
[0088]
图21b显示了图21a中的相同的数据的柱状图。左侧条柱为仅mir，中间条柱为仅胶束，右侧条柱为胶束 mir。
[0089]
图22a显示bmd001的施用恢复了5xfad中的神经发生。在模拟物(仅mir和仅胶束(分别为左图和中图))或aso-mds(右图)施用后侧脑室的免疫组织化学分析。脑切片中的神经发生通过抗dcx染色来鉴定。图中显示了每mm2的dcx染色的细胞的平均数。上图通过抗dcx染色，即神经发生标志物来进行染色。下图显示了通过dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行的染色。
[0090]
图22b显示了图22a中所示的相同的数据的柱状图。
[0091]
图23a显示aso-mds递送改善了5xfad小鼠的认知功能(y迷宫)。
[0092]
图23b显示aso-mds递送改善了5xfad小鼠中的认知功能(被动回避测试)。图23a和图23b的y迷宫和被动回避测试在模拟物(仅mir和仅胶束(分别为左图和中图))和aso-mds注射的5xfad小鼠(右图)中进行(模拟物治疗8～10月龄5xfad小鼠，n＝5，bmd001注射的8～10月龄5xfad小鼠，n＝7)。
[0093]
图24显示了mirna 485-3p在阿尔茨海默氏病中的作用。
[0094]
图25显示了本公开的胶束递送系统的癌症靶向应用的示意图。本文公开的胶束系统是用于癌症治疗以及脑疾病的通用递送系统。多种癌症靶向配体可以应用于该载体系统以将治疗剂(例如，多核苷酸)递送至癌细胞。
[0095]
图26a显示了使用本公开的胶束递送系统在胰腺癌中的k-ras基因沉默功效。图26a显示了k-ras基因沉默功效的时间线。
[0096]
图26b显示了图26a中的k-ras基因沉默治疗后相对k-ras mrna的柱状图。对于图26a和26b两个图，能够抑制k-ras的寡核苷酸被负载到本公开的胶束递送系统中。为了靶向不同的组织，本公开的胶束递送系统与环状rgd肽(靶向α(v)β(3)整合素)或x(靶标)融合。
[0097]
图27比较了cy5.5标记的抗微rna(裸aso；左侧小鼠)和负载有cy5.5标记的抗微rna的胶束(aso-mds；右侧小鼠)在肌肉内注射后的生物分布。在两个样品注射至小鼠后，获得了最多120小时的全身荧光图像。
具体实施方式
[0098]
本公开涉及包含水溶性生物聚合物部分(例如，peg)和带电部分(例如，聚赖氨酸)的载体单元。在带电部分与带相反电荷的带电有效负载(例如，寡核苷酸)和相似或相同电荷负载(即，载体单元的带电部分上和带电有效负载上的电荷数相似或相同)之间发生静电相互作用时，载体单元的带电部分中的电荷和带电有效负载中的电荷相互抵消，产生载体单元:有效负载复合物。载体单元:有效负载复合物可以自缔合产生胶束，其中有效负载定位于胶束的核心，水溶性生物聚合物部分面向溶剂。在一些方面，载体单元包含可以与阴离子有效负载相互作用的阳离子带电部分。相反，载体单元可以包含可以与阳离子有效负载相互作用的阴离子带电部分。在本公开中显示了各个方面的非限制性实例。
[0099]
在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定组合物或过程步骤，并因此当然可以变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个个别方面具有离散的组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何所陈述的方法均可以以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
[0100]
本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将只由所附权利要求限制。
[0101]
因此，通过参考说明书整体，以下紧接着定义的术语得到更充分定义。
[0102]
i.定义
[0103]
为使本描述可更易于被理解，首先定义某些术语。额外定义遍及具体实施方式加以阐述。
[0104]
应注意术语“一个(种)(a/an)”实体是指一个(种)或多个(种)所述实体；例如“一个(种)核苷酸序列”应理解为表示一个(种)或多个(种)核苷酸序列。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。还应注意，权利要求可以被草拟为排除任何任选的元素。因此，对于与叙述权利要求要素结合使用的象“单独”、“只”等这样的排他性术语或所使用的“否定性”限制，这份说明书仅欲充当一个先行基础。
[0105]
此外，当在本文中使用时，“和/或”应视为特定公开两个指定特征或组分中的每一者，伴有或不伴有另一者。因此，如本文中诸如“a和/或b”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。类似地，在短语中使用的术语“和/或”诸如“a、b和/或c”意图涵盖以下方面中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
[0106]
应了解，每当在本文中以措辞“包含”描述各个方面的情况下，还提供了以“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”描述的另外类似方面。
[0107]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所相关领
域中的普通技术人员通常理解相同的含义。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei-show,第2版,2002,crc press；dictionary of cell and molecular biology,第3版,1999,academic press；和oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,修订板,2000,oxford university press，给普通技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。
[0108]
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(si)接受形式表示。数值范围包括界定范围的数值。在列举值的范围的情况下，应理解的是，还具体公开了在该范围的所列举的上限与下限之间的每个居间整数值及其每个分数，以及在此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限都可以独立地包括在该范围内或从该范围中排除，并且其中包括任一个限值、两个限值都不包括或包括两个限值的每个范围也涵盖于本公开中。因此，本文所列举的范围应理解为该范围内的所有值的简写形式，包括所列举的端点。例如，1至10的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。
[0109]
在明确列举值的情况下，应当理解，与所述值大致相同数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，还具体公开了该组合的元素的每个子组合，并且所述子组合在本公开的范围内。相反，在分别公开不同元素或元素组的情况下，也公开了其组合。在本公开的任何元素被公开为具有多个备选方案的情况下，在此还公开了其中每个备选方案被单独排除或与其他备选方案以任何组合被排除的该公开的实例；本公开的不止一个元素可以具有此类排除，并且由此公开了具有此类排除的元素的所有组合。
[0110]
核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。除非另外指示，否则核苷酸序列以5'至3'定向从左至右书写。核苷酸在本文中由其通常已知的由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。因此，
‘
a’表示腺嘌呤，
‘
c’表示胞嘧啶，
‘
g’表示鸟嘌呤，
‘
t’表示胸腺嘧啶，
‘
u’表示尿嘧啶。
[0111]
氨基酸序列以氨基至羧基定向从左至右书写。氨基酸可以在本文中由其通常已知的由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来表示。
[0112]
术语“约”在本文中用于意指近似、大致、约或在
……
左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过使边界延伸高于和低于阐述的数值来修饰那个范围。一般来说，术语“约”可通过向上或向下(升高或降低)变化例如10％来将数值修饰为高于和低于陈述值。
[0113]
术语“施用(administration、administering)”及其语法变型是指经由药学上可接受的途径将本公开的组合物(诸如胶束)引入受试者。将组合物，诸如本公开的胶束引入受试者是通过任何合适的途径，包括瘤内、口服、经肺、鼻内、肠胃外(静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内、鞘内、眼周或局部。施用包括自我施用和通过另外的人施用。合适的施用途径可使组合物或剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或剂引入受试者的静脉内来施用所述组合物。
[0114]
如本文中所使用，应用于一个或多个目标值的术语“约”是指与所陈述的参考值相似的值。在某些方面，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字将超过可能值的100％)，否则术语“约”是指落入陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值的范围。
[0115]
如本文中所用，术语“保守的”分别是指这样的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，所述核苷酸或氨基酸残基是在被比较的两个或更多个序列的相同位置上未
改变地存在的那些核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是与序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸相比，在更多相关序列中保守的核苷酸或氨基酸。
[0116]
在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有100％同一性，则称它们为“完全保守的”或“相同的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则它们被认为是“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性或约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则它们被认为是“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则它们被认为是“保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则它们被认为是“保守的”。序列的保守性可以应用于多核苷酸或多肽的全长，或者可以应用于其一部分、区域或特征。
[0117]
如本文所用，术语“衍生自”是指从特定分子或生物体或来自特定分子或生物体的信息(例如，氨基酸或核酸序列)分离或使用它们制备的组分。例如，衍生自第二核酸序列的核酸序列可以包括与第二核酸序列的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽的情况下，衍生的种类可以通过例如天然发生的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变获得。用于衍生核苷酸或多肽的诱变可以是有意定向的或有意随机的，或二者的混合。核苷酸或多肽的诱变以产生从第一者衍生的不同核苷酸或多肽可以是随机事件(例如，由聚合酶不保真引起)并且衍生的核苷酸或多肽的鉴定可以通过适当的筛选方法进行，例如，如本文所讨论。多肽的诱变通常需要对编码多肽的多核苷酸进行操作。在一些方面，衍生自第二核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列分别与第二核苷酸或氨基酸序列具有至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％的序列同一性，其中第一核苷酸或氨基酸序列保持第二核苷酸或氨基酸序列的生物活性。
[0118]
术语“互补的”和“互补性”是指通过沃森-克里克碱基配对规则彼此相关的两个或更多个寡聚体(即，每个包含核碱基序列)，或者在寡聚体和靶基因之间。例如，核碱基序列“t-g-a(5'
→
3')”与核碱基序列“a-c-t(3'
→
5')”互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则，一个给定核碱基序列的少于所有核碱基与另一个核碱基序列匹配。例如，在一些方面，一个给定核碱基序列与另一个核碱基序列之间的互补性可以是约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％。或者，在一个给定的核碱基序列和另一个核碱基序列之间可以存在“完全”或“完美”(100％)互补性以继续该实例。核碱基序列之间的互补程度对序列之间杂交的效率和强度有显著影响。
[0119]
术语“下游”是指定位于参考核苷酸序列的3'末端的核苷酸序列。在某些方面，下游核苷酸序列与转录起点之后的序列有关。例如，基因的翻译起始密码子定位于转录起始位点的下游。
[0120]
术语“赋形剂”和“载体”可互换使用，是指添加至药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。
[0121]
如本文中所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”表示两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性。
[0122]
在一些方面，如果聚合物分子中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的单体相同(完全相同的单体)或相似(保守置换)，则所述聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
[0123]
如本文中所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如，多肽分子或多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间的总体单体保守。无任何附加限定词的术语“相同”，例如蛋白质a与蛋白质b相同，意味着序列100％相同(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％相同”相当于将它们描述为具有例如“70％序列同一性”。
[0124]
例如，两个多肽或多核苷酸序列的同一性百分比的计算可以通过出于最佳比较目的而对两个序列进行的比对来进行(例如，可以在第一多肽或多核苷酸序列和第二多肽或多核苷酸序列中的一者或二者中引入空位以实现最佳比对，出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些方面，出于比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。然后比较相应氨基酸位置或就多核苷酸而言碱基处的氨基酸。
[0125]
当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是同一的。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以获得两个序列的最优比对的缺口的数目和每个缺口的长度的情况下，由序列共享的相同位置的数目的函数。可使用数学算法来实现序列比较以及确定两个序列之间的同一性百分比。
[0126]
合适的软件程序可从各种来源获得，并用于比对蛋白质和核苷酸序列。确定百分比序列同一性的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国立生物技术信息中心(u.s.government's national center for biotechnology information)blast网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的blast程序组(suite of program)的一部分。bl2seq使用blastn或blastp算法在两个序列之间进行比较。blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是，例如，needle、stretcher、water或matcher、生物信息学程序的emboss套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/tools/psa.上从欧洲生物信息学研究所(ebi)获得。
[0127]
序列比对可以使用本领域已知的方法诸如mafft、clustal(clustalw、clustal x或clustal omega)、muscle等进行。
[0128]
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶向序列内的不同区域
可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14被舍到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19被入到80.2。还要注意的是，长度值将始终是整数。
[0129]
在某些实施方案中，第一氨基酸序列(或核苷酸序列)与第二序列氨基酸(或核苷酸序列)的同一性百分比(id％)被计算成id％＝100x(y/z)，其中y为在第一序列与第二序列的比对(如通过目测或特殊的序列比对程序比对的)中被评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)数并且z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
[0130]
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比而产生的序列比对不限于仅通过一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应当理解，可通过整合序列数据与来自异源诸如结构数据(例如，结晶蛋白结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据的数据来产生序列比对。整合异源数据以产生多重序列对比的合适程序是从www.tcoffee.org获得并且或者例如从ebi获得的t-coffee。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动进行(curated)。
[0131]
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”、“提取的”及其语法变体可互换使用，是指本公开的所需组合物的制备物的状态，所述制备物已经经历了一个或多个纯化过程.在一些方面，本文所用的分离或纯化是从含有污染物的样品中除去、部分除去(例如，一部分)本公开的组合物的过程。在一些方面，分离的组合物不具有可检测非所需活性，或替代地，非所需活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其他方面，分离的组合物具有处于或高于可接受的量和/或浓度和/或活性的本公开的所需组合物的量和/或浓度。在其他方面，与获得组合物的起始材料相比，分离的组合物是富集的。与起始材料相比，这种富集可以富集至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。在一些方面，分离的制备物基本上不含残留的生物产物。在一些方面，分离的制备物100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留的生物产物可包括非生物材料(包括化学品)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢产物。
[0132]
如本文所用，术语“连接”是指第一氨基酸序列或多核苷酸序列分别与第二氨基酸序列或多核苷酸序列共价或非共价连接。第一氨基酸或多核苷酸序列可以直接连接或并列于第二氨基酸或多核苷酸序列，或者插入序列可以将第一序列共价连接至第二序列。术语“连接”不仅指第一多核苷酸序列在5'-末端或3'-末端与第二多核苷酸序列的融合，而且还包括整个第一多核苷酸序列(或第二多核苷酸序列)插入至第二多核苷酸序列(或分别第一多核苷酸序列)中的任意两个核苷酸。第一多核苷酸序列可以通过磷酸二酯键或接头连接至第二多核苷酸序列。接头可以是例如多核苷酸。
[0133]
术语“mirna”或“mir”或“微rna”可互换使用，是指在真核生物中存在的参与基于rna的基因调控的微rna分子。该术语将用于指从前体加工的单链rna分子。本文提供了与本公开相关的mirna的名称及其序列。微rna通过不完全碱基配对识别和结合靶标mrna，导致
靶标mrna的不稳定或翻译抑制，从而下调靶标基因表达。相反，通过包含mirna结合位点的分子(通常是包含与mirna的种子区互补的序列的分子)靶向mirna可以减少或抑制mirna诱导的翻译抑制，从而导致靶基因的上调。
[0134]
术语“错配(mismatch或mismatches)”是指根据碱基配对规则寡聚核碱基序列中的一个或多个核碱基(无论是连续的还是分开的)与靶标前mrna不配对。虽然通常需要完全互补性，但是一些方面可以包括一个或多个，但优选地6、5、4、3、2或1个与靶标前体mrna的错配。寡聚体内的任何位置的变化都包括在内。在某些方面，本公开的反义寡聚体包括末端附近的核碱基序列的变化、内部的变化，并且如果存在的话，通常在5'和/或3'末端的约6、5、4、3、2、或1个亚基内。在某些方面，一个、两个或三个核碱基可以被除去并且仍然提供中靶结合。
[0135]
如本文所用，术语“调节”、“修饰”及其语法变型，当应用于特定浓度、水平、表达、功能或行为时，通常指通过增加或减少，例如直接或间接促进/刺激/上调或干扰/抑制/下调特定浓度、水平、表达、功能或行为，例如，作为拮抗剂或激动剂来改变的能力。在一些情况下，相对于对照，或相对于通常可预期的平均活性水平，或相对于对照活性水平，调节剂可以增加和/或减少一定的浓度、水平、活性或功能。
[0136]“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”以及它们的语法变体可互换使用，是指单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“rna分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“dna分子”)的磷酸酯聚合物形成，或它们的任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。单链核酸序列是指单链dna(ssdna)或单链rna(ssrna)。双链dna-dna、dna-rna和rna-rna螺旋是可能的。术语核酸分子，尤其是dna或rna分子，仅指分子的一级和二级结构，并且不将其限制为任何特定的三级形式。因此，该术语包括特别是直链或环状dna分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋dna和染色体中存在的双链dna。在讨论特定的双链dna分子的结构中，本文可根据仅给出沿dna的非转录链(即该链具有与mrna同源的序列)5'至3'方向的序列的标准惯例来描述序列。“重组dna分子”是经过分子生物学操作的dna分子。dna包括但不限于cdna、基因组dna、质粒dna、合成dna、和半合成dna。本公开的“核酸组合物”包含一种或多种如本文所述的核酸。
[0137]
如本文所用，短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、和胸骨内注射和输注。
[0138]
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”及其语法变型涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于包括人在内的动物的任何试剂，以及不会导致产生以至于禁止将组合物施用于受试者的程度的不期望的生理效应并且不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的任何载体或稀释剂。包括可用于制备药物组合物且通常是安全、无毒和需要的赋形剂和载体。
[0139]
如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种其他化学组分混合或掺和或悬浮于一种或多种其他化学组分(诸如药学上可接受的载体和赋形剂)中的一种或多种本文所述的化合物，例如本公开的胶束。药物组合物的一个目的是促进将胶束的制备物施用于受试者。
[0140]
如本文中所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(包括核糖核苷酸、脱
氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物)的聚合物。所述术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链，双链和单链脱氧核糖核酸(“dna”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“rna”)。其还包括多核苷酸的经修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰的形式。
[0141]
具体而言，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)、聚核糖核苷酸(含有d-核糖)，包括trna、rrna、hrna、sirna和mrna，无论是剪接的还是未剪接的，任何其他类型的多核苷酸(它是嘌呤或嘧啶碱基的n-或c-糖苷)，以及其他含有正核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“pna”)和多吗啉聚合物，以及其他合成序列特异性核酸聚合物(前提条件是聚合物含有核碱基，所述核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆积，诸如存在于dna和rna中)。
[0142]
在本公开的一些方面，多核苷酸可以是例如寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。在一些方面，寡核苷酸是rna。在一些方面，rna是合成rna。在一些方面，合成rna包含至少一种非天然核碱基。在一些方面，某一类的所有核苷碱基已被非天然核苷碱基替代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷均可被非天然核苷碱基(例如，5-甲氧基尿苷)替代)。
[0143]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可包含经修饰的氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰(诸如与标记成分缀合)。该定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰苯丙氨酸、d-氨基酸和肌酸)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。如本文所用，术语“多肽”是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽，也可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可包含单链或多链多肽。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”的长度可以少于或等于50个氨基酸，例如，长度为约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸。
[0144]
如本文所用，术语“预防(prevent、preventing)”及其变型是指部分或完全延迟疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一个或多个症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一个或多个症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的进展；以及/或者降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。在一些方面，通过预防性治疗来实现预防结局。
[0145]
如本文所用，“预防性”是指用于预防疾病或疾患的发作，或者预防或延迟与疾病或疾患相关的症状的治疗或作用过程。
[0146]
如本文所用，“预防”是指为维持健康和预防或延迟出血发作的发病，或者预防或延迟与疾病或疾患相关的症状而采取的措施。
[0147]
如本文中所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此相似性百分比的计算可以以与计算同一性百分比相同的方式进行，不同之处在于相似性百分比的计算考虑了本领域已知的保守取代。应当理解，相似性的百分比取决于所使用的比较标准，即，是
否例如根据氨基酸的进化接近度、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性或其组合来比较氨基酸。
[0148]
术语“受试者”、“患者”、“个体”和“宿主”及其变型在本文中可互换使用，是指需要诊断、治疗或医治的任何哺乳动物受试者，包括但不限于人类、家畜(例如，狗、猫等等)、农场动物(例如，奶牛、绵羊、猪、马等等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等等)，特别是人类。本文描述的方法适用于人疗法和兽医应用。
[0149]
如本文所用，短语“有需要的受试者”包括将受益于本公开的胶束的施用例如以改善止血的受试者，诸如哺乳动物受试者。
[0150]
如本文所用，短语“全身施用(systemic administration、administered systemically)”、“外周施用(peripheral administration和administered peripherally)”是指除直接进入中枢神经系统之外的化合物、药物或其他物质的施用，从而使其进入患者的系统，因此受代谢和其他类似过程的影响，例如皮下施用。
[0151]
如本文所用，术语“治疗有效量”是足以对有需要的受试者产生期望的治疗效果、药理学和/或生理学效果的包含本公开的胶束的试剂或药物化合物的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
[0152]
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指例如疾病或疾患的严重度降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈疾病或疾患。该术语还包括疾病或疾患或其症状的防御或预防。在一个方面，术语“治疗(treating或treatment)”是指在受试者中诱导针对抗原的免疫反应。
[0153]
术语“上游”是指定位于参考核苷酸序列的5'末端的核苷酸序列。
[0154]
ii.载体单元
[0155]
本公开提供了可以自组装成胶束或掺入胶束的载体单元。本公开的载体单元包含水溶性生物聚合物部分(例如，peg)和带电载体部分。在一些方面，带电载体部分是阳离子的(例如，聚赖氨酸)，而在其他方面，带电载体部分是阴离子的(例如，聚谷氨酸)，如图1所示。
[0156]
本公开的载体单元可以用于递送带电有效负载(例如，治疗剂或诊断剂)。具有阳离子带电载体部分的载体单元可以用于递送阴离子有效负载，例如多核苷酸。具有阴离子带电载体部分的载体单元可以用于递送阳离子有效负载，例如带正电的小分子药物。参见图1。
[0157]
还可以使用本公开的载体单元通过使用衔接子(例如，如图2中描绘的阳离子或阴离子衔接子)来递送中性或疏水性有效负载。衔接子共价结合，例如，结合至疏水有效负载并且为此类有效负载提供合适的电荷负载，以便与本公开的载体单元的带电载体部分相互作用。因此，在一些方面，本公开的有效负载可以包含可以与本公开的载体单元的带电载体部分相互作用(例如，通过静电相互作用)的带电部分(“衔接子”部分)，以及生物活性部分(例如，治疗部分)。在一些方面，衔接子部分和生物活性部分直接连接，而在一些其他方面，它们可以通过接头连接。
[0158]
在
[0159]
(i)带电载体部分和
[0160]
(ii)带电有效负载(例如，核苷酸序列，例如，寡核苷酸、sirna、shrna等)或其带电部分(例如，衔接子部分)之间发生静电相互作用时，其中
[0161]
a.带电载体部分和带电有效负载或其带电部分具有不同的净电荷(即，一个是阳离子，另一个是阴离子)；并且
[0162]
b.净电荷负载相似或相同(即，载体单元的带电部分上和带电有效负载或其带电部分上的电荷数相似或相同)，
[0163]
带电部分中的电荷和带电有效负载或衔接子中的电荷相互抵消，产生载体单元:有效负载复合体。
[0164]
所得的载体单元:有效负载复合物是两亲性的，具有包含水溶性生物聚合物部分的亲水性“头部”和包含静电结合至有效负载的带电载体部分的疏水性“尾部”。
[0165]
载体单元:有效负载复合物可以单独或与其他两亲分子组合自缔合产生胶束，其中有效负载定位于胶束的核心，水溶性生物聚合物部分面向溶剂。术语“本公开的胶束”不仅涵盖经典胶束，而且还涵盖小颗粒、小胶束、胶束、棒状结构或聚合物囊泡。鉴于聚合物囊泡包含管腔空间，应当理解与经典胶束的“核心”相关的所有公开内容同样适用于包含本公开的载体单元的聚合物囊泡中的管腔空间。因此，在一些方面，本公开的胶束可以包含连接至本公开的载体单元的有效负载分子和胶束的管腔空间(例如，聚合物囊泡的腔)中的有效负载分子。在一些方面，连接至载体单元的有效负载和管腔空间中的有效负载是相同的。在一些方面，连接至载体单元的有效负载和管腔空间中的有效负载是不同的。
[0166]
本公开的载体单元还可以包含通过一个或多个任选的接头共价连接至水溶性生物聚合物部分的靶向部分。一旦形成胶束，靶向部分即可定位于胶束的表面上并且可以将胶束递送至特定的靶标组织、特定的细胞类型，和/或促进穿过生理屏障(例如，细胞质膜或bbb)的运输。在一些方面，本公开的胶束可以包含多于一种类型的靶向部分。
[0167]
本公开的载体单元还可以包含与带电载体部分共价连接的佐剂部分。佐剂部分可以起到双重作用：它可以为与有效负载的静电相互作用提供电荷和/或可以具有例如治疗、协同治疗作用，或者积极影响靶细胞或靶组织的稳态。
[0168]
如图1中的示意图形式所示，在一些方面，有效负载不与载体单元共价连接。然而，在其他方面，有效负载可以共价连接至载体单元，例如接头，诸如可切割接头。
[0169]
在本公开中显示了各个方面的非限制性实例。本公开特别涉及阳离子载体单元例如用于递送阴离子有效负载诸如核酸的用途。然而，对于本领域的普通技术人员显而易见的是，本公开可以通过反转载体部分和有效负载的电荷(即，使用载体单元中的阴离子载体部分来递送阳离子有效负载)，或者通过使用连接至阳离子或阴离子衔接子(所述阳离子或阴离子衔接子分别与阴离子或阳离子载体部分发生静电相互作用)的中性有效负载来等同地应用于阳离子有效负载的递送或中性有效负载的递送。
[0170]
因此，在一个方面，本公开提供了架构i或架构ii的阳离子载体单元
[0171]
[wp]-l1-[cc]-l2-[am]
ꢀꢀ
(架构i)
[0172]
[wp]-l1-[am]-l2-[cc]
ꢀꢀ
(架构ii)
[0173]
其中
[0174]
wp是水溶性生物聚合物部分(例如，peg)；
[0175]
cc是阳离子载体部分，例如聚赖氨酸；
[0176]
am是佐剂部分，例如维生素，例如维生素b3；以及，
[0177]
l1和l2是独立地任选的接头。
[0178]
本公开还提供了架构iii或架构iv的阴离子载体单元
[0179]
[wp]-l1-[ac]-l2-[am]
ꢀꢀꢀ
(架构iii)
[0180]
[wp]-l1-[am]-l2-[ac]
ꢀꢀꢀ
(架构iv)
[0181]
其中
[0182]
wp是水溶性生物聚合物部分(例如，peg)；
[0183]
ac是阴离子载体部分；
[0184]
am是佐剂部分；以及，
[0185]
l1和l2是独立地任选的接头。
[0186]
本公开还提供了架构v至viii的阳离子和阴离子载体单元
[0187]
[wp]-l1-[ac]-l2-[am]-l3-[p]
ꢀꢀ
(架构v)
[0188]
[wp]-l1-[am]-l2-[ac]-l3-[p]
ꢀꢀ
(架构vi)
[0189]
[wp]-l1-[ac]-l2-[am]-l3-[p]
ꢀꢀ
(架构vii)
[0190]
[wp]-l1-[am]-l2-[ac]-l3-[p]
ꢀꢀ
(架构viii)
[0191]
其中
[0192]
wp是水溶性生物聚合物部分(例如，peg)；
[0193]
ac是阴离子载体部分；
[0194]
cc是阳离子载体部分；
[0195]
am是佐剂部分；
[0196]
l1和l2是独立地任选的接头；
[0197]
l3是可切割的任选的接头；以及，
[0198]
p是有效负载。
[0199]
在上文所示的架构i至viii的构造的一些方面，[wp]组件可以连接至至少一个靶向部分，即[t]
n-[wp]-...其中n为整数，例如，1、2或3。
[0200]
图3显示了本公开的阳离子载体单元的示意图。为简单起见，图3中的单元已经以线性表示。然而，在某些方面，载体单元可以包含以支链支架排列组织的cc和am部分(参见图4和图5)，例如，聚合物cc部分包含带正电的单元，并且am在沿cc部分的一个或多个点处连接。在其他方面，cc和am可以连接至支架部分，如图5所示。
[0201]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0202][0203]
a是靶向部分，例如靶向lat1转运蛋白的分子，
[0204]
b是阳离子载体部分中的阳离子聚合物嵌段，
[0205]
其中，
[0206]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约
30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0207]
(ii)m是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；以及，
[0208]
(iii)n是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0209]
并且其中x是佐剂部分，例如维生素，例如，
[0210]
其中y1是c、n、o或s，y2是c、n o或s，n为1或2。在一些方面，x可以是-sh(例如，氢硫基、烷硫醇或烷基硫醇)。在一些方面，本公开的胶束包含一种类型的与维生素(例如，维生素b3)缀合的阳离子载体单元，和另一种类型的与氢硫基(例如，烷硫醇或烷基硫醇)缀合的阳离子载体单元。在一些方面，本公开的胶束包含第一类型的与维生素(例如，维生素b3)缀合的阳离子载体单元，第二类型的与氢硫基(例如，烷硫醇或烷基硫醇)缀合的阳离子载体单元；以及第三类型的作为游离碱的阳离子载体单元。
[0211]
当本公开的阳离子载体单元与阴离子有效负载(例如，核酸)以约1:约1的离子比混合时，即阴离子有效负载中的负电荷数和阳离子载体部分中的正电荷数大致相同，阴离子有效负载中的负电荷主要通过静电相互作用被阳离子载体部分中的正电荷中和，导致形成具有未改变的亲水部分(包括wp部分)和基本上更疏水的部分(由阳离子载体部分加上佐剂部分和阴离子有效负载之间的缔合产生)的阳离子载体单元:阴离子有效负载复合物。
[0212]
在一些方面，佐剂部分可以将其自身的正电荷贡献给阳离子载体部分的正电荷，所述正电荷将与阴离子有效负载的负电荷相互作用。应当理解，提及阳离子载体部分和阴离子有效负载之间的相互作用(例如，静电相互作用)还涵盖阳离子载体部分加上佐剂部分的电荷与阴离子有效负载的电荷之间的相互作用。
[0213]
由于阳离子载体单元的阳离子载体部分的正电荷通过与阴离子有效负载的负电荷的静电相互作用而中和，所述阳离子载体部分的疏水性产生两亲复合物。这种两亲复合物可以单独或与其他两亲组分组合而自组织成胶束。所得的胶束包含面向溶剂的wp部分(即，wp部分面向胶束的外表面)，而cc和am部分以及相关的有效负载(例如，核苷酸序列，例如，寡核苷酸、sirna、shrna、“antimir”或它们的任何组合)在胶束的核心中。
[0214]
在一些具体方面，阳离子载体单元包含：
[0215]
(a)wp部分，其中水溶性生物聚合物是式iii的聚乙二醇(peg)(参见下文)，其中n在约120至约peg 130之间(例如，peg是peg5000或peg6000)；
[0216]
(b)cc部分，其中阳离子载体部分包含例如约30至约40个赖氨酸(例如，线性聚(l-赖氨酸)n，其中n在约30和约40之间)、聚乙烯亚胺(pei)、或壳聚糖；以及，
[0217]
(c)am部分，其中佐剂部分具有约5至约10个维生素b3单元(例如，约5至约10个串
联的维生素b3单元)。
[0218]
在一些具体方面，阳离子载体单元包含：
[0219]
(a)wp部分，其中水溶性生物聚合物是式iii的聚乙二醇(peg)(参见下文)，其中n在约120至约peg 130之间(例如，peg是peg5000或peg6000)；
[0220]
(b)cc部分，其中阳离子载体部分包含例如约60至约100个赖氨酸(例如，线性聚(l-赖氨酸)n，其中n在约60和约100之间)(例如约70至90个赖氨酸、约80个赖氨酸)、聚乙烯亚胺(pei)、或壳聚糖；以及，
[0221]
(c)am部分，其中佐剂部分具有约10至约50个维生素b3单元(例如，约10至约50个串联的维生素b3单元，例如约20至40个单元，例如约30个单元)。
[0222]
在一些方面，阳离子载体单元还包含至少一个与阳离子载体单元的wp部分连接的靶向部分。在一些方面，胶束表面上显示的靶向部分的数量和/或密度可以通过使用具有靶向部分的阳离子载体单元与不具有靶向部分的阳离子载体单元的特定比率来调节。在一些方面，具有靶向部分的阳离子载体单元与不具有靶向部分的阳离子载体单元的比率为至少约1:5、至少约1:10、至少约1:20、至少约1:30、至少约1:40、至少约1:50、至少约1:60、至少约1:70、至少约1:80、至少约1:90、至少约1:100、至少约1:120、至少约1:140、至少约1:160、至少约1:180、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、至少约1:500、至少约1:600、至少约1:700、至少约1:800、至少约1:900、或至少约1:1000。
[0223]
在一些方面，阳离子载体单元包含
[0224]
(i)靶向转运蛋白lat1(例如，苯丙氨酸)的靶向部分(a)，
[0225]
(ii)水溶性聚合物，即peg，
[0226]
(iii)包含阳离子聚合物嵌段(即赖氨酸)的阳离子载体部分，以及(iv)两个或更多个佐剂部分，即维生素b3。
[0227]
在一些方面，阳离子载体单元包含
[0228]
(i)靶向转运蛋白lat1(例如，苯丙氨酸)的靶向部分(a)，
[0229]
(ii)水溶性聚合物，即peg，其中n＝100-200，例如100-150，例如120-130，
[0230]
(iii)包含阳离子聚合物嵌段(例如，聚赖氨酸)的阳离子载体部分，以及
[0231]
(iv)两个或更多个佐剂部分，例如维生素b3。
[0232]
在一些方面，阳离子载体单元包含
[0233]
(i)靶向转运蛋白lat1(例如，苯丙氨酸)的靶向部分(a)，
[0234]
(ii)水溶性聚合物，即peg，其中n＝100-200，例如100-150，例如120-130，
[0235]
(iii)包含阳离子聚合物嵌段(例如10-100个赖氨酸，例如10-50个赖氨酸，例如30-40个赖氨酸，例如70-80个赖氨酸)的阳离子载体部分，以及
[0236]
(iv)两个或更多个佐剂部分，例如维生素b3，例如25-30个维生素b3。
[0237]
在一些方面，阳离子载体单元包含
[0238]
(i)靶向转运蛋白lat1(例如，苯丙氨酸)的靶向部分(a)，
[0239]
(ii)水溶性聚合物，即peg，其中n＝100-200，例如100-150，例如120-130，
[0240]
(iii)包含阳离子聚合物嵌段(例如10-100个赖氨酸，例如10-50个赖氨酸，例如30-40个赖氨酸，例如70-80个赖氨酸)的阳离子载体部分，以及
[0241]
(iv)两个或更多个佐剂部分，例如5-50个维生素b3，例如5-30个维生素b3，例如5-20个维生素b3，例如5-15个维生素b3，例如5-10个维生素b3，例如25-30个维生素b3。
[0242]
如(架构i)中所示例，cc部分可以是包含多个b单元的聚合物(其中每个b单元可以是例如赖氨酸)，并且am部分可以是包含多个共价连接至cc部分上的侧链连接点的x单元(例如维生素单元)的非离散分子实体。因此，在一个具体方面，阳离子载体单元包含
[0243]
(i)靶向转运蛋白lat1(例如，苯丙氨酸)的靶向部分(a)，
[0244]
(ii)水溶性聚合物，即peg，其中n＝120-130，
[0245]
(iii)包含30-40、40-50、50-60、或70-80个b阳离子聚合物嵌段(即赖氨酸)的阳离子载体部分，以及
[0246]
(iv)5-10、10-20、20-25、或25-30个x佐剂部分，即维生素b3。
[0247]
在一些方面，本公开的阳离子载体单元与靶向mir-485-3p的反义寡核苷酸有效负载，例如agagaggagagccguguaugac(seq id no:18)相互作用。在一些方面，与有效负载复合的载体单元形成胶束。
[0248]
在一些方面，维生素b3单元被引入cc部分的侧链，例如，在合适的缀合试剂(例如，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs))存在下，通过赖氨酸中的nh2基团与维生素b3的cooh基团之间的偶联反应来进行。
[0249]
本公开提供了包含本公开的载体单元(例如，阳离子载体单元)的组合物。在其他方面，本公开提供了包含本公开的载体单元(例如，阳离子载体单元)的复合物，所述载体单元非共价连接至有效负载(例如，阴离子有效负载，例如核苷酸序列，例如寡核苷酸、sirna、shrna、“antimir”或它们的任何组合)，其中载体单元和有效负载发生静电相互作用。在其他方面，本公开提供了包含本公开的载体单元(例如，阳离子载体单元)的缀合物，所述载体单元共价连接至有效负载(例如，阴离子有效负载，例如核苷酸序列，例如寡核苷酸、sirna、shrna、“antimir”或它们的任何组合)，其中载体单元和有效负载发生静电相互作用。在一些方面，载体单元和有效负载可以通过可切割的接头连接。在一些方面，载体单元和有效负载除发生静电相互作用之外，还可以共价相互作用(例如，在发生静电相互作用之后，载体单元和有效负载可以通过二硫键或可切割的键“锁定”)。
[0250]
在一些具体方面，阳离子载体单元包含水溶性聚合物，所述水溶性聚合物包含具有约120至约130个单元的peg、包含具有约30个至大致赖氨酸单元的聚赖氨酸的阳离子载体部分、和包含约5至约10个维生素b3单元的佐剂部分。
[0251]
在一些方面，阳离子载体单元与带负电的有效负载(例如，核苷酸序列，例如寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)、sirna、shrna、“antimir”或它们的任何组合)相关，所述有效负载通过至少一个离子键(即，通过静电相互作用)与阳离子载体单元，与阳离子载体单元的阳离子载体部分相互作用。
[0252]
在一些方面，本公开的胶束可以根据图6所示的式构建。在一些方面，胶束的mb/(na mb)大于0且小于1，例如在约0..25和约1之间、在约0.3和约1之间、在约0.4和约1之间、在约0.5和约1之间、在约0.25和约0.9之间、在约0.3和约0.9之间、在约0.4和约0.9之间、在约0.5和约0.9之间、在约0.25和约0.8之间、在约0.3和约0.8之间、在约0.4和约0.8之间、在约0.5和约0.8之间、在约0.25和约0.75之间、在约0.3和约0.75之间、在约0.4和约0.75之间、在约0.5和约0.75之间、在约0.25和约0.7之间、在约0.3和约0.7之间、在约0.4和约0.7
之间、在约0.5和约0.7之间、在约0.25和约0.6之间、在约0.3和约0.6之间、在约0.4和约0.6之间、在约0.5和约0.6之间、在约0.45和约0.55之间、在约0.4和约0.65之间、或在约0.5和约0.65之间，
[0253]
其中na是mb是
[0254]
在一些方面，胶束的mb/(na mb)在约0.4和约0.6之间、在约0.5和约0.6之间、或在约0.4和约0.5之间，
[0255]
其中na是mb是在一些方面，胶束的mb/(na mb)为约0.5，
[0256]
其中na是mb是
[0257]
本公开的阳离子载体单元的具体组分在下文详细公开。
[0258]
a.水溶性生物聚合物
[0259]
在一些方面，本公开的阳离子载体单元包含至少一种水溶性生物聚合物。如本文所用，术语“水溶性生物聚合物”是指生物相容性、生物惰性、非免疫原性、无毒和亲水性聚合物，例如peg。
[0260]
在一些方面，水溶性聚合物包括聚(亚烷基二醇)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚磷腈、聚噁唑啉(“poz”)、聚(n-丙烯酰基吗啉)、或它们的任何组合。在一些方面，水溶性生物聚合物是直链的、支链的或树枝状的。
[0261]
在一些方面，水溶性生物聚合物包括聚乙二醇(“peg”)、聚甘油(“pg”)、或聚(丙二醇)(“ppg”)。ppg的毒性比peg小，所以现在很多生物制品都是用ppg代替peg生产的。
[0262]
在一些方面，水溶性生物聚合物包含peg，其特征在于式r
3-(o-ch
2-ch2)
n-或r
3-(0-ch
2-ch2)
n-o-，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n具有2至200的值。在一些方面，peg具有下式
[0263][0264]
其中n为1至1000。
[0265]
在一些方面，peg的n的值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、或200。
[0266]
在一些方面，n为至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、
至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约310、至少约320、至少约330、至少约340、至少约350、至少约360、至少约370、至少约380、至少约390、至少约400、至少约410、至少约420、至少约430、至少约440、至少约450、至少约460、至少约470、至少约480、至少约490、至少约500、至少约510、至少约520、至少约530、至少约540、至少约550、至少约560、至少约670、至少约580、至少约590、至少约600、至少约610、至少约620、至少约630、至少约640、至少约650、至少约660、至少约670、至少约680、至少约690、至少约700、至少约710、至少约720、至少约730、至少约740、至少约750、至少约760、至少约770、至少约780、至少约790、至少约800、至少约810、至少约820、至少约830、至少约840、至少约850、至少约860、至少约870、至少约880、至少约890、至少约900、至少约910、至少约920、至少约930、至少约940、至少约950、至少约960、至少约970、至少约980、至少约990、或约1000。
[0267]
在一些方面，n在约50和约100之间、在约100和约150之间、在约150和约200之间、在约200和约250之间、在约250和约300之间、在约300和约350之间、在约350和约400之间、在约400和约450之间、在约450和约500之间、在约500和约550之间、在约550和约600之间、在约600和约650之间、在约650和约700之间、在约700和约750之间、在约750和约800之间、在约800和约850之间、在约850和约900之间、在约900和约950之间、或在约950和约1000之间。
[0268]
在一些方面，n为至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99、至少约100、至少约101、至少约102、至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140、至少约141、至少约142、至少约143、至少约144、至少约145、至少约146、至少约147、至少约148、至少约149、至少约150、至少约151、至少约152、至少约153、至少约154、至少约155、至少约156、至少约157、至少约158、至少约159、或至少约160。
[0269]
在一些方面，n为约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约130至约140、约140至约150、约150至约160、约85至约95、约95至约105、约105至约115、约115至约125、约125至约135、约135至约145、约145至约155、约155至约165、约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约85至约105、约105至约125、约125至约145、或约145至约165。
[0270]
在一些方面，n为约100至约150。在一些方面，n为约100至约140。在一些方面，n为约100至约130。在一些方面，n为约110至约150。在一些方面，n为约110至约140。在一些方面，n为约110至约130。在一些方面，n为约110至约120。在一些方面，n为约120至约150。在一些方面，n为约120至约140。在一些方面，n为约120至约130。在一些方面，n为约130至约150。
在一些方面，n为约130至约140。
[0271]
因此，在一些方面，peg是支链peg。支链peg具有三至十条从一个中央核心基团发出的peg链。在某些方面，peg部分是单分散聚乙二醇。在本公开的上下文中，单分散聚乙二醇(mdpeg)是具有单一的、确定的链长和分子量的peg。mdpeg通常通过色谱法从聚合混合物中分离产生。在某些式中，单分散peg部分被指定为缩写mdpeg。
[0272]
在一些方面，peg是星形peg。星形peg具有10至100条从一个中央核心基团发出的peg链。在一些方面，peg是梳状peg。梳状peg具有多个通常接枝到聚合物主链上的peg链。
[0273]
在某些方面，peg的摩尔质量在约1000g/mol和约2000g/mol之间、在约2000g/mol和约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol和约5000g/mol之间、在约5000g/mol和约6000g/mol之间、在约6000g/mol和约7000g/mol、或在7000g/mol和约8000g/mol之间。
[0274]
在一些方面，peg是peg
100
、peg
200
、peg
300
、peg
400
、peg
500
、peg
600
、peg
700
、peg
800
、peg
900
、peg
1000
、peg
1100
、peg
1200
、peg
1300
、peg
1400
、peg
1500
、peg
1600
、peg
1700
、peg
1800
、peg
1900
、peg
2000
、peg
2100
、peg
2200
、peg
2300
、peg
2400
、peg
2500
、peg
1600
、peg
1700
、peg
1800
、peg
1900
、peg
2000
、peg
2100
、peg
2200
、peg
2300
、peg
2400
、peg
2500
、peg
2600
、peg
2700
、peg
2800
、peg
2900
、peg
3000
、peg
3100
、peg
3200
、peg
3300
、peg
3400
、peg
3500
、peg
3600
、peg
3700
、peg
3800
、peg
3900
、peg
4000
、peg
4100
、peg
4200
、peg
4300
、peg
4400
、peg
4500
、peg
4600
、peg
4700
、peg
4800
、peg
4900
、peg
5000
、peg
5100
、peg
5200
、peg
5300
、peg
5400
、peg
5500
、peg
5600
、peg
5700
、peg
5800
、peg
5900
、peg
6000
、peg
6100
、peg
6200
、peg
6300
、peg
6400
、peg
6500
、peg
6600
、peg
6700
、peg
6800
、peg
6900
、peg
7000
、peg
7100
、peg
7200
、peg
7300
、peg
7400
、peg
7500
、peg
7600
、peg
7700
、peg
7800
、peg
7900
、或peg
8000
。在一些方面，peg是peg
5000
。在一些方面，peg是peg
6000
。在一些方面，peg是peg
4000
。
[0275]
在一些方面，peg是单分散的，例如，mpeg
100
、mpeg
200
、mpeg
300
、mpeg
400
、mpeg
500
、mpeg
600
、mpeg
700
、mpeg
800
、mpeg
900
、mpeg
1000
、mpeg
1100
、mpeg
1200
、mpeg
1300
、mpeg
1400
、mpeg
1500
、mpeg
1600
、mpeg
1700
、mpeg
1800
、mpeg
1900
、mpeg
2000
、mpeg
2100
、mpeg
2200
、mpeg
2300
、mpeg
2400
、mpeg
2500
、mpeg
1600
、mpeg
1700
、mpeg
1800
、mpeg
1900
、mpeg
2000
、mpeg
2100
、mpeg
2200
、mpeg
2300
、mpeg
2400
、mpeg
2500
、mpeg
2600
、mpeg
2700
、mpeg
2800
、mpeg
2900
、mpeg
3000
、mpeg
3100
、mpeg
3200
、mpeg
3300
、mpeg
3400
、mpeg
3500
、mpeg
3600
、mpeg
3700
、mpeg
3800
、mpeg
3900
、mpeg
4000
、mpeg
4100
、mpeg
4200
、mpeg
4300
、mpeg
4400
、mpeg
4500
、mpeg
4600
、mpeg
4700
、mpeg
4800
、mpeg
4900
、mpeg
5000
、mpeg
5100
、mpeg
5200
、mpeg
5300
、mpeg
5400
、mpeg
5500
、mpeg
5600
、mpeg
5700
、mpeg
5800
、mpeg
5900
、mpeg
6000
、mpeg
6100
、mpeg
6200
、mpeg
6300
、mpeg
6400
、mpeg
6500
、mpeg
6600
、mpeg
6700
、mpeg
6800
、mpeg
6900
、mpeg
7000
、mpeg
7100
、mpeg
7200
、mpeg
7300
、mpeg
7400
、mpeg
7500
、mpeg
7600
、mpeg
7700
、mpeg
7800
、mpeg
7900
、或mpeg
8000
。在一些方面，mpeg是mpeg
5000
。在一些方面，mpeg是mpeg
6000
。在一些方面，mpeg是mpeg
4000
。
[0276]
在一些方面，水溶性生物聚合物部分是以式((r3—o—(ch2—choh—ch2o)n—)描述的聚甘油(pg)，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n的值在3至200之间。在一些方面，水溶性生物聚合物部分是以式(r3—o—(ch2—chor5—ch2—o)n—)描述的支链聚甘油，其中r5是氢或以式(r3—o—(ch2—choh—ch2—o)n—)描述的直链甘油链，并且r3是氢、甲基或乙基。在一些方面，水溶性生物聚合物部分是以式(r3—o—(ch2—chor5—ch2—o)n—)描述的超支链聚甘油，其中r5是氢或以式(r3—o—(ch2—chor6—ch2—o)n—)描述的甘油链，其中r6是氢或以式(r3—o—(ch2—chor7—ch2—o)n—)描述的甘油链，其中r7是氢或以式(r3—o—
(ch2—choh—ch2—o)n—)描述的线性甘油链，并且r3是氢、甲基或乙基。超支链甘油及其合成方法在oudshorn等人(2006)biomaterials 27:5471-5479；wilms等人(20100acc.chem.res.43,129-41，以及其中引用参考文献中有所描述。
[0277]
在某些方面，pg的摩尔质量在约1000g/mol和约2000g/mol之间、在约2000g/mol和约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol和约5000g/mol之间、在约5000g/mol和约6000g/mol之间、在约6000g/mol和约7000g/mol、或在7000g/mol和约8000g/mol之间。
[0278]
在一些方面，pg是pg
100
、pg
200
、pg
300
、pg
400
、pg
500
、pg
600
、pg
700
、pg
800
、pg
900
、pg
1000
、pg
1100
、pg
1200
、pg
1300
、pg
1400
、pg
1500
、pg
1600
、pg
1700
、pg
1800
、pg
1900
、pg
2000
、pg
2100
、pg
2200
、pg
2300
、pg
2400
、pg
2500
、pg
1600
、pg
1700
、pg
1800
、pg
1900
、pg
2000
、pg
2100
、pg
2200
、pg
2300
、pg
2400
、pg
2500
、pg
2600
、pg
2700
、pg
2800
、pg
2900
、pg
3000
、pg
3100
、pg
3200
、pg
3300
、pg
3400
、pg
3500
、pg
3600
、pg
3700
、pg
3800
、pg
3900
、pg
4000
、pg
4100
、pg
4200
、pg
4300
、pg
4400
、pg
4500
、pg
4600
、pg
4700
、pg
4800
、pg
4900
、pg
5000
、pg
5100
、pg
5200
、pg
5300
、pg
5400
、pg
5500
、pg
5600
、pg
5700
、pg
5800
、pg
5900
、pg
6000
、pg
6100
、pg
6200
、pg
6300
、pg
6400
、pg
6500
、pg
6600
、pg
6700
、pg
6800
、pg
6900
、pg
7000
、pg
7100
、pg
7200
、pg
7300
、pg
7400
、pg
7500
、pg
7600
、pg
7700
、pg
7800
、pg
7900
、或pg
8000
。在一些方面，pg是pg
5000
。在一些方面，pg是pg
6000
。在一些方面，pg是pg
4000
。
[0279]
在一些方面，pg是单分散的，例如，mpg
100
、mpg
200
、mpg
300
、mpg
400
、mpg
500
、mpg
600
、mpg
700
、mpg
800
、mpg
900
、mpg
1000
、mpg
1100
、mpg
1200
、mpg
1300
、mpg
1400
、mpg
1500
、mpg
1600
、mpg
1700
、mpg
1800
、mpg
1900
、mpg
2000
、mpg
2100
、mpg
2200
、mpg
2300
、mpg
2400
、mpg
2500
、mpg
1600
、mpg
1700
、mpg
1800
、mpg
1900
、mpg
2000
、mpg
2100
、mpg
2200
、mpg
2300
、mpg
2400
、mpg
2500
、mpg
2600
、mpg
2700
、mpg
2800
、mpg
2900
、mpg
3000
、mpg
3100
、mpg
3200
、mpg
3300
、mpg
3400
、mpg
3500
、mpg
3600
、mpg
3700
、mpg
3800
、mpg
3900
、mpg
4000
、mpg
4100
、mpg
4200
、mpg
4300
、mpg
4400
、mpg
4500
、mpg
4600
、mpg
4700
、mpg
4800
、mpg
4900
、mpg
5000
、mpg
5100
、mpg
5200
、mpg
5300
、mpg
5400
、mpg
5500
、mpg
5600
、mpg
5700
、mpg
5800
、mpg
5900
、mpg
6000
、mpg
6100
、mpg
6200
、mpg
6300
、mpg
6400
、mpg
6500
、mpg
6600
、mpg
6700
、mpg
6800
、mpg
6900
、mpg
7000
、mpg
7100
、mpg
7200
、mpg
7300
、mpg
7400
、mpg
7500
、mpg
7600
、mpg
7700
、mpg
7800
、mpg
7900
、或mpg
8000
。
[0280]
在一些方面，水溶性生物聚合物包含聚(丙二醇)(“ppg”)。在一些方面，ppg的特征在于下式，其中n的值为1至1000。
[0281][0282]
在一些方面，ppg的n的值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、
191、192、193、194、195、196、197、198、199、或200。
[0283]
在一些方面，ppg的n为至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约310、至少约320、至少约330、至少约340、至少约350、至少约360、至少约370、至少约380、至少约390、至少约400、至少约410、至少约420、至少约430、至少约440、至少约450、至少约460、至少约470、至少约480、至少约490、至少约500、至少约510、至少约520、至少约530、至少约540、至少约550、至少约560、至少约670、至少约580、至少约590、至少约600、至少约610、至少约620、至少约630、至少约640、至少约650、至少约660、至少约670、至少约680、至少约690、至少约700、至少约710、至少约720、至少约730、至少约740、至少约750、至少约760、至少约770、至少约780、至少约790、至少约800、至少约810、至少约820、至少约830、至少约840、至少约850、至少约860、至少约870、至少约880、至少约890、至少约900、至少约910、至少约920、至少约930、至少约940、至少约950、至少约960、至少约970、至少约980、至少约990、或约1000。
[0284]
在一些方面，ppg的n在约50和约100之间、在约100和约150之间、在约150和约200之间、在约200和约250之间、在约250和约300之间、在约300和约350之间、在约350和约400之间、在约400和约450之间、在约450和约500之间、在约500和约550之间、在约550和约600之间、在约600和约650之间、在约650和约700之间、在约700和约750之间、在约750和约800之间、在约800和约850之间、在约850和约900之间、在约900和约950之间、或在约950和约1000之间。
[0285]
在一些方面，ppg的n为至少约80、至少约81、至少约82、至少约83、至少约84、至少约85、至少约86、至少约87、至少约88、至少约89、至少约90、至少约91、至少约92、至少约93、至少约94、至少约95、至少约96、至少约97、至少约98、至少约99、至少约100、至少约101、至少约102、至少约103、至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少110、至少约111、至少约112、至少约113、至少约114、至少约115、至少约116、至少约117、至少约118、至少约119、至少约120、至少约121、至少约122、至少约123、至少约124、至少约125、至少约126、至少约127、至少约128、至少约129、至少约130、至少约131、至少约132、至少约133、至少约134、至少约135、至少约136、至少约137、至少约138、至少约139、至少约140、至少约141、至少约142、至少约143、至少约144、至少约145、至少约146、至少约147、至少约148、至少约149、至少约150、至少约151、至少约152、至少约153、至少约154、至少约155、至少约156、至少约157、至少约158、至少约159、或至少约160。
[0286]
在一些方面，ppg的n为约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120、约120至约130、约130至约140、约140至约150、约150至约160、约85至约95、约95至约105、约105至约115、约115至约125、约125至约135、约135至约145、约145至约155、约155至约165、约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约85至约105、约105至约125、约125至约145、或约145至约165。
[0287]
因此，在一些方面，ppg是支链ppg。支链ppg具有三至十条从中央核心基团发出的ppg链。在某些方面，ppg部分是单分散聚乙二醇。在本公开的上下文中，单分散聚乙二醇
(mdppg)是具有单一的、确定的链长和分子量的ppg。mdpeg通常通过色谱法从聚合混合物中分离产生。在某些式中，单分散ppg部分被指定为缩写mdppg。
[0288]
在一些方面，ppg是星形ppg。星形ppg具有10至100条从中央核心基团发出的ppg链。在一些方面，ppg是梳状ppg。梳状ppg具有多条通常接枝到聚合物主链上的ppg链。
[0289]
在某些方面，ppg的摩尔质量在约1000g/mol和约2000g/mol之间、在约2000g/mol和约3000g/mol之间、在约3000g/mol至约4000g/mol之间、在约4000g/mol和约5000g/mol之间、在约5000g/mol和约6000g/mol之间、在约6000g/mol和约7000g/mol、或在7000g/mol和约8000g/mol之间。
[0290]
在一些方面，ppg是ppg
100
、ppg
200
、ppg
300
、ppg
400
、ppg
500
、ppg
600
、ppg
700
、ppg
800
、ppg
900
、ppg
1000
、ppg
1100
、ppg
1200
、ppg
1300
、ppg
1400
、ppg
1500
、ppg
1600
、ppg
1700
、ppg
1800
、ppg
1900
、ppg
2000
、ppg
2100
、ppg
2200
、ppg
2300
、ppg
2400
、ppg
2500
、ppg
1600
、ppg
1700
、ppg
1800
、ppg
1900
、ppg
2000
、ppg
2100
、ppg
2200
、ppg
2300
、ppg
2400
、ppg
2500
、ppg
2600
、ppg
2700
、ppg
2800
、ppg
2900
、ppg
3000
、ppg
3100
、ppg
3200
、ppg
3300
、ppg
3400
、ppg
3500
、ppg
3600
、ppg
3700
、ppg
3800
、ppg
3900
、ppg
4000
、ppg
4100
、ppg
4200
、ppg
4300
、ppg
4400
、ppg
4500
、ppg
4600
、ppg
4700
、ppg
4800
、ppg
4900
、ppg
5000
、ppg
5100
、ppg
5200
、ppg
5300
、ppg
5400
、ppg
5500
、ppg
5600
、ppg
5700
、ppg
5800
、ppg
5900
、ppg
6000
、ppg
6100
、ppg
6200
、ppg
6300
、ppg
6400
、ppg
6500
、ppg
6600
、ppg
6700
、ppg
6800
、ppg
6900
、ppg
7000
、ppg
7100
、ppg
7200
、ppg
7300
、ppg
7400
、ppg
7500
、ppg
7600
、ppg
7700
、ppg
7800
、ppg
7900
、或ppg
8000
。在一些方面，ppg是ppg
5000
。在一些方面，ppg是ppg
6000
。在一些方面，ppg是ppg
4000
。
[0291]
在一些方面，ppg是单分散的，例如，mppg
100
、mppg
200
、mppg
300
、mppg
400
、mppg
500
、mppg
600
、mppg
700
、mppg
800
、mppg
900
、mppg
1000
、mppg
1100
、mppg
1200
、mppg
1300
、mppg
1400
、mppg
1500
、mppg
1600
、mppg
1700
、mppg
1800
、mppg
1900
、mppg
2000
、mppg
2100
、mppg
2200
、mppg
2300
、mppg
2400
、mppg
2500
、mppg
1600
、mppg
1700
、mppg
1800
、mppg
1900
、mppg
2000
、mppg
2100
、mppg
2200
、mppg
2300
、mppg
2400
、mppg
2500
、mppg
2600
、mppg
2700
、mppg
2800
、mppg
2900
、mppg
3000
、mppg
3100
、mppg
3200
、mppg
3300
、mppg
3400
、mppg
3500
、mppg
3600
、mppg
3700
、mppg
3800
、mppg
3900
、mppg
4000
、mppg
4100
、mppg
4200
、mppg
4300
、mppg
4400
、mppg
4500
、mppg
4600
、mppg
4700
、mppg
4800
、mppg
4900
、mppg
5000
、mppg
5100
、mppg
5200
、mppg
5300
、mppg
5400
、mppg
5500
、mppg
5600
、mppg
5700
、mppg
5800
、mppg
5900
、mppg
6000
、mppg
6100
、mppg
6200
、mppg
6300
、mppg
6400
、mppg
6500
、mppg
6600
、mppg
6700
、mppg
6800
、mppg
6900
、mppg
7000
、mppg
7100
、mppg
7200
、mppg
7300
、mppg
7400
、mppg
7500
、mppg
7600
、mppg
7700
、mppg
7800
、mppg
7900
、或mppg
8000
。在一些方面，mppg是mppg
5000
。在一些方面，mppg是mppg
6000
。在一些方面，mppg是mppg
4000
。
[0292]
b.阳离子载体
[0293]
在一些方面，本公开的阳离子载体单元包含至少一个阳离子载体部分。术语“阳离子载体”是指包含多个正电荷的本公开的阳离子载体单元的部分或部份，所述正电荷可以与阴离子有效负载(或连接至有效负载的阴离子载体)相互作用和静电结合。在一些方面，阳离子载体上的正电荷或带正电基团的数量与阴离子有效负载(或连接至有效负载的阴离子载体)上的负电荷或带负电基团的数量相似。在一些方面，阳离子载体包含生物聚合物，例如肽(例如聚赖氨酸)。
[0294]
在一些方面，阳离子载体包含一个或多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或它们的组合)。在一些方面，阳离子载体包含至少约三、至少约四、至少约五、至少约六、至少约七、至少约八、至少约九、至少约十、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至
少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29、至少约30、至少约31、至少约32、至少约33、至少约34、至少约35、至少约36、至少约37、至少约38、至少约39、至少约40、至少约41、至少约42、至少约43、至少约44、至少约45、至少约46、至少约47、至少约48、至少约49、至少约50、至少约51、至少约52、至少约53、至少约54、至少约55、至少约56、至少约57、至少约58、至少约59、至少约60、至少约61、至少约62、至少约63、至少约64、至少约65、至少约66、至少约67、至少约68、至少约69、至少约70、至少约71、至少约72、至少约73、至少约74、至少约75、至少约76、至少约77、至少约78、至少约79、至少约80个碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、或它们的组合。
[0295]
在一些方面，阳离子载体单元包含至少约40个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约45个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约50个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约55个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约60个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约65个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约70个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约75个碱性氨基酸，例如赖氨酸。在一些方面，阳离子载体单元包含至少约80个碱性氨基酸，例如赖氨酸。
[0296]
在一些方面，阳离子载体单元包含约30至约1000、约30至约900、约30至约800、约30至约700、约30至约600、约30至约500、约30至约400、约30至约300、约30至约200、约30至约100、约40至约1000、约40至约900、约40至约800、约40至约700、约40至约600、约40至约500、约40至约400、约40至约300、约40至约200、或约40至约100个碱性氨基酸，例如赖氨酸。
[0297]
在一些方面，阳离子载体单元包含约30至约100、约30至约90、约30至约80、约30至约70、约30至约60、约30至约50、约30至约40、约40至约100、约40至约90、约40至约80、约40至约70、约40至约60、约70至约80、约75至约85、约65至约75、约65至约80、约60至约85、或约40至约500个碱性氨基酸，例如赖氨酸。
[0298]
在一些方面，阳离子载体单元包含约100至约1000、约100至约900、约100至约800、约100至约700、约100至约600、约100至约500、约100至约400、约100至约300、约100至约200、约200至约1000、约200至约900、约200至约800、约200至约700、约200至约600、约200至约500、约200至约400、约200至约300、约300至约1000、约300至约900、约300至约800、约300至约700、约300至约600、约300至约500、约300至约400、约400至约1000、约400至约900、约400至约800、约400至约700、约400至约600、约400至约500、约500至约1000、约500至约900、约500至约800、约500至约700、约500至约600、约600至约1000、约600至约900、约600至约800、约600至约700、约700至约1000、约700至约900、约700至约800、约800至约1000、约800至约900、或约900至约1000个碱性氨基酸，例如赖氨酸。
[0299]
在一些方面，碱性氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或它们的组合的数量，可以根据阴离子有效负载的长度进行调整。例如，具有更长序列的阴离子有效负载可以与更高数量的碱性氨基酸(例如赖氨酸)配对。在一些方面，可以计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约
1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、或约3。在一些方面，计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.3至约1.7，例如约1.5。在一些方面，计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.4。在一些方面，计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.6。在一些方面，计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.3。在一些方面，计算阳离子载体单元中的碱性氨基酸(例如赖氨酸)的数量，以使得聚合物中的质子化胺与阴离子有效负载(例如寡核苷酸，例如antimir)中的磷酸的摩尔比(n/p)为约1.7。
[0300]
本领域的技术人员将会理解，由于阳离子载体部分的作用是通过静电相互作用来中和有效负载上的负电荷(例如，反义寡核苷酸的磷酸骨架的负变化)，在一些方面(例如，当有效负载是核酸，诸如antimir时)，阳离子载体的长度、阳离子载体上的带正电基团的数量、以及存在于阳离子载体上的电荷的分布和方向将取决于有效负载分子上的长度和电荷分布。
[0301]
在其他方面，例如，当有效负载是多个小分子(例如，阴离子小分子药物)时，阳离子载体的长度和阳离子载体上的带正电基团的数量与所需的有效负载相关。例如，本公开的阳离子载体单元携带的小分子药物的数量将取决于阳离子载体部分中的电荷数量。
[0302]
在一些方面，阳离子载体包含在约5个和约10个之间、在约10个和约15个之间、在约15个和约20个之间、在约20个和约25个之间、在约25个和约30个之间、在约30个和约35个之间、在约35个和约40个之间、在约40个和约45个之间、在约45个和约50个之间、在约50个和约55个之间、在约55个和约60个之间、在约60个和约65个之间、在约和约70个之间、在约70个和约75个之间、或在约75个和约80个之间的碱性氨基酸。在一些具体方面，带正电的载体包含在30个和约50个之间的碱性氨基酸。在一些具体方面，带正电的载体包含在70个和约80个之间的碱性氨基酸。
[0303]
在一些方面，碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些方面，碱性氨基酸是d-氨基酸。在一些方面，碱性氨基酸是l-氨基酸。在一些方面，带正电的载体包含d-氨基酸和l-氨基酸。在一些方面，碱性氨基包含至少一个非天然氨基酸或其衍生物。在一些方面，碱性氨基酸是精氨酸、赖氨酸、组氨酸、l-4-氨基甲基-苯丙氨酸、l-4-胍-苯丙氨酸、l-4-氨基甲基-n-异丙基-苯丙氨酸、l-3-吡啶基-丙氨酸、l-反式-4-氨基甲基环己基-丙氨酸、l-4-哌啶基-丙氨酸、l-4-氨基环己基-丙氨酸、4-胍基丁酸、l-2-氨基-3-胍基丙酸、dl-5-羟基赖氨酸、吡咯赖氨酸、5-羟基-l-赖氨酸、甲基赖氨酸、羟腐胺赖氨酸、或它们的任何组合。在一个特定方面，带正电的载体包含约40个赖氨酸。在一个特定方面，带正电的载体包含约50个赖氨酸。在一个特定方面，带正电的载体包含约60个赖氨酸。在一个特定方面，带正电的载体包含约70个赖氨酸。在一个特定方面，带正电的载体包含约80个赖氨酸。
[0304]
在其他方面，阳离子载体包含烷基链，例如，c3至c
50
，所述烷基链包含至少三、至少
四、至少五、至少六、至少七、至少八、至少九、至少十、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少67、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、或至少80个阳离子基团(例如氨基)。在一些方面，阳离子载体包含烷基链，例如，c3至c
50
，所述烷基链包含在约5个和约10个之间、在约10个和约15个之间、在约15个和约20个之间、在约20个和约25个之间、在约25个和约30个之间、在约30个和约35个之间、在约35个和约40个之间、在约40个和约45个之间、在约45个和约50个之间、在约50个和约55个之间、在约55个和约60个之间、在约60个和约65个之间、在约65个和约70个之间、在约70个和约75个之间、或在约75个和约80个之间的阳离子基团(例如氨基)。在一些具体方面，阳离子载体包含烷基链，例如，c3至c
50
，所述烷基链包含在30个和约50个之间的阳离子基团(例如氨基)。在一些具体方面，阳离子载体包含烷基链，例如，c3至c
50
，所述烷基链包含在70个和约80个之间的阳离子基团(例如氨基)。
[0305]
在其他方面，阳离子载体包括聚合物或共聚物，所述聚合物或共聚物包含至少三、至少四、至少五、至少六、至少七、至少八、至少九、至少十、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、或至少80个阳离子基团(例如氨基)。在一些方面，阳离子载体包含聚合物或共聚物，所述聚合物或共聚物包含在约5个和约10个之间的阳离子基团、在约10个和约15个之间的阳离子基团、在约15个和约20个之间的阳离子基团、在约20个和约25个之间的阳离子基团、在约25个和约30个之间的阳离子基团、在约30个和约35个之间的阳离子基团、在约35个和约40个之间的阳离子基团、在约40个和约45个之间的阳离子基团、在约45个和约50个之间的阳离子基团、在约50个和约55个之间的阳离子基团、在约55个和约60个之间的阳离子基团、在约60个和约65个之间的阳离子基团、在约65个和约70个之间的阳离子基团、在约70个和约75个之间的阳离子基团、或在约45个和约50个之间的阳离子基团(例如氨基)。在一些具体方面，阳离子载体包含聚合物或共聚物，所述聚合物或共聚物包含在30个和约50个之间的阳离子基团(例如氨基)。在一些具体方面，阳离子载体包含聚合物或共聚物，所述聚合物或共聚物包含在70个和约80个之间的阳离子基团(例如氨基)。在一些方面，聚合物或共聚物是丙烯酸酯、多元醇或多糖。
[0306]
在一些方面，阳离子载体部分结合至单个有效负载分子。在其他方面，阳离子载体部分可以结合至多个有效负载分子，所述有效负载分子可以相同或不同。
[0307]
在一些方面，阳离子载体部分的正电荷和核酸有效负载的负电荷的离子比为约3:
1、约2.9:1、约2.8:1、约2.7:1、约2.6:1、约2.5:1、约2.4:1、约2.3:1、约2.2:1、约2:1、约2:1、约1.9:1、约1.8:1、约1.7:1、约1.6:1、约1.5:1、约1.4:1、约1.3:1、约1.2:1、约1.1:1、约1:1、约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、或约1:3。在一些方面，阳离子载体部分的正电荷和核酸有效负载的负电荷的电荷比为1:1。在一些方面，阳离子载体部分的正电荷和核酸有效负载的负电荷的电荷比为3:2。在一些方面，阳离子载体部分的正电荷和核酸有效负载的负电荷的电荷比为2:3。
[0308]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0309][0310]
其中a是色氨酸或苯丙氨酸，b是阳离子载体部分，例如赖氨酸，
[0311]
其中，
[0312]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0313]
(ii)m是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；以及，
[0314]
(iii)n是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0315]
其中x是其中y1是c、n、o、或s，y2是c、no、或s，并且n为1或2。在一些方面，x可以是-sh(例如，氢硫基、烷硫醇或烷基硫醇)。在一些方面，本公开的胶束包含一种类型的与维生素(例如，维生素b3)缀合的阳离子载体单元，和另一种类型的与氢硫基(例如，烷硫醇或烷基硫醇)缀合的阳离子载体单元。在一些方面，本公开的胶束包含第一类型的与维生素(例如，维生素b3)缀合的阳离子载体单元，第二类型的与氢硫基(例如，烷硫醇或烷基硫醇)缀合的阳离子载体单元；以及第三类型的作为游离碱的阳离子载体单元。
[0316]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0317][0318]
其中a是色氨酸或苯丙氨酸，b是阳离子载体部分，例如赖氨酸，
[0319]
其中，
[0320]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0321]
(ii)m是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；
[0322]
(iii)k是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；以及，
[0323]
(iii)n是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0324]
其中x1是其中y1是c、n、o、或s，y2是c、no、或s，并且n为1或2；其中x2是其中p＝0至5。在一些方面，p为0。在一些方面，x2是sh。
[0325]
在一些方面，阳离子载体部分具有游离末端，其中末端基团是反应性基团。在一些方面，阳离子载体部分具有游离末端(例如，聚赖氨酸阳离子载体部分中的c-末端)，其中末端基团是氨基(-nh2)。在一些方面，阳离子载体部分具有游离末端，其中末端基团是巯基。在一些方面，阳离子载体部分的反应性基团连接至佐剂部分，例如维生素b3佐剂部分。
[0326]
c.佐剂部分
[0327]
在一些方面，本公开的阳离子载体单元包含至少一个佐剂部分。如本文所用，术语“佐剂部分”是指这样的分子实体，所述分子实体可以例如(i)补充有效负载的治疗或预防活性，(ii)调节有效负载的治疗或预防活性，(iii)在靶组织或靶细胞中起到治疗和/或预防剂的作用，(iv)促进阳离子载体单元穿过生理屏障，例如bbb和/或质膜的运输，(v)改善靶组织或靶细胞的稳态，(vi)为阳离子载体部分贡献带正电的基团，或者(vii)它们的任何组合。
[0328]
在一些方面，佐剂部分能够调节例如免疫反应、炎症反应或组织微环境。
[0329]
在一些方面，能够调节免疫反应的佐剂部分可以包括例如酪氨酸或多巴胺。酪氨酸可以转化为l-dopa，然后通过2步酶促反应转化为多巴胺。通常，帕金森病患者的多巴胺
水平低。因此，在一些方面，酪氨酸是用于治疗帕金森病的阳离子载体单元中的佐剂部分。色氨酸可以转化为血清素，血清素是一种被认为在食欲、情绪、运动、认知、和自主神经功能中起作用的神经递质。因此，在一些方面，用于治疗与低血清素水平相关的疾病或疾患的本公开的阳离子载体单元包含作为佐剂部分的色氨酸。
[0330]
在一些方面，佐剂部分可以调节患有肿瘤的受试者的肿瘤微环境，例如，通过抑制或减轻肿瘤微环境中的缺氧。
[0331]
在一些方面，佐剂部分包括例如咪唑衍生物、氨基酸、维生素、或它们的任何组合。
[0332]
在一些方面，佐剂部分是包含下式的咪唑衍生物：
[0333][0334]
其中g1和g2中的每一个独立地是h、芳环、或1-10个烷基，或者g1和g2共同形成芳环，并且其中n为1-10。
[0335]
在一些方面，佐剂部分包括硝基咪唑。硝基咪唑起到抗生素的作用。硝基咪唑中的硝基杂环可以在缺氧细胞中被还原活化，然后进行氧化还原再循环或分解为细胞毒性产物。还原通常只发生在厌氧菌或缺氧组织中，因此对人体细胞或需氧细菌的影响相对较小。在一些方面，佐剂部分包括甲硝唑、替硝唑、尼莫唑、地美硝唑、普托马尼、奥硝唑、美格唑、阿扎硝唑、苄硝唑、硝基咪唑或它们的任何组合。
[0336]
在一些方面，佐剂部分包括氨基酸。在一些方面，佐剂部分包含
[0337][0338]
其中ar是以及
[0339]
其中z1和z2中的每一个是h或oh。
[0340]
在一些方面，佐剂部分能够抑制或减少炎症反应。
[0341]
在一些方面，佐剂部分是维生素。在一些方面，维生素包括环状环或环状杂原子环和羧基或羟基。在一些方面，维生素包含：
[0342][0343]
其中y1和y2中的每一个是c、n、o、或s，并且其中n为1或2。
[0344]
在一些方面，维生素选自由以下组成的组：维生素a(视黄醇)、维生素b1(氯化硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酰胺)、维生素b6(吡哆醛)、维生素b7(生物素)、维生
素b9(叶酸)、维生素b12(钴胺素)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d2、维生素d3、维生素e(生育酚)、维生素m、维生素h、它们的衍生物、以及它们的任何组合。
[0345]
在一些方面，维生素是维生素b3(也称为烟酸或尼克酸)。
[0346][0347]
在一些方面，佐剂部分包含至少约二、至少约三、至少约四、至少约五、至少约六、至少约七、至少约八、至少约九、至少约十、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29、或至少约30个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约10个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约7个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约8个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约9个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约10个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约11个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约12个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约13个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约14个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约15个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约20个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约25个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约30个维生素b3。
[0348]
在一些方面，佐剂部分包含约5个至约10个维生素b3、约10个至约15个维生素b3、约15个至约20个维生素b3、约20个至约25个维生素b3、约25个至约30个维生素b3、约30个至约35个维生素b3、约35个至约40个维生素b3、约40个至约45个维生素b3、约45个至约50个维生素b3。在一些方面，佐剂部分包含约10个至约20个维生素b3、约20个至约30个维生素b3、约30个至约40个维生素b3、约40个至约50个维生素b3、约5个至约15个维生素b3、约15个至约25个维生素b3、约25个至约35个维生素b3、约35个至约45个维生素b3、约45个至约55个维生素b3。
[0349]
烟酸是体内辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)的前体。在酶nad 激酶的存在下，nad通过磷酸化转化为nadp。nadp和nad是很多脱氢酶的辅酶，参与很多氢转移过程。nad在脂肪、碳水化合物、蛋白质和醇的分解代谢以及细胞信号传导和dna修复中很重要，nadp则主要在合成代谢反应(诸如脂肪酸和胆固醇合成)中很重要。高能量需求(脑)或高周转率(肠道、皮肤)器官通常最容易缺乏。
[0350]
烟酸通过活化niacr1在各种组织(包括脑、胃肠道、皮肤和血管组织)中产生显著的抗炎作用。烟酸已经被证明可以减轻神经炎症，并且可以对治疗神经免疫病症(诸如多发性硬化和帕金森病)有效。参见offermanns&schwaninger(2015)trends in molecular medicine21:245-266；chai等人(2013)current atherosclerosis reports 15:325；graff等人(2016)metabolism 65:102-13；和wakade&chong(2014)journal of the neurological sciences 347:34-8，这些文献以引用的方式整体并入本文。
[0351]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0352][0353]
其中x是维生素b3；
[0354]
a是靶向部分，以及
[0355]
b是阳离子载体部分，例如赖氨酸，以及
[0356]
其中，
[0357]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0358]
(ii)m是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；以及，
[0359]
(iii)n是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200。
[0360]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0361][0362]
其中x是维生素b3；
[0363]
a是靶向部分，以及
[0364]
b是阳离子载体部分，例如赖氨酸，以及
[0365]
其中，
[0366]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0367]
(ii)m是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；
[0368]
(iii)k是在1至150之间的整数，例如约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150；以及，
[0369]
(iii)n是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约30和约40、约40和约50、约50和约60、约60和约70、约70和约80、约80和约90、约90和约100、约100和约110、约110和约120、约120和约130、约130和约140、约140和约150、约150和约160、约160和约170、约170和约180、约180和约190、或约190和约200；
[0370]
其中x1是其中y1是c、n、o、或s，y2是c、no、或s，并且n为1或2；其中x2是其中p＝0至5。在一些方面，p为0。在一些方面，x2是sh。
[0371]
d.靶向部分
[0372]
在一些方面，所述阳离子载体单元包含靶向部分，所述靶向部分任选地通过接头连接至所述水溶性聚合物。如本文所用，术语“靶向部分”是指结合特定生物物质或位点的生物识别分子。在一些方面，靶向部分对某些靶分子(例如，靶向受体的配体、或靶向表面蛋白的抗体)、组织(例如，将胶束优先携带到特定器官或组织(例如，肝、脑或内皮细胞)的分子)具有特异性，或者促进通过生理屏障的运输(例如，可以促进跨过血脑屏障或质膜运输的肽或其他分子)。
[0373]
对于靶向根据本公开的有效负载(例如，核苷酸分子，例如结合至微rna的反义寡核苷酸)，靶向部分可以偶联至阳离子载体单元，因此偶联至胶束的外表面，而胶束将有效负载包埋在其核心内。
[0374]
在一些方面，靶向部分是能够使本公开的胶束靶向组织的靶向部分。在一些方面，组织是肝、脑、肾、肺、卵巢、胰腺、甲状腺、乳房、胃、或它们的任何组合。在一些方面，组织是癌组织，例如肝癌、脑癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌、或它们的任何组合。
[0375]
在一个具体方面，组织是肝。在一个具体方面，靶向肝的靶向部分是胆固醇。在其他方面，靶向肝的靶向部分是结合脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分的配体。在一些方面，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含galnac簇。在一些方面，galnac簇是单价、二价、三价、或四价galnac簇。
[0376]
在另一个方面，组织是胰腺。在一些方面，靶向胰腺的靶向部分包含靶向胰腺细胞上的αvβ3整合素受体的配体。在一些方面，靶向部分包含精氨酰甘氨酰天冬氨酸(rgd)肽序列(l-精氨酰-甘氨酰-l-天冬氨酸；arg-gly-asp)。
[0377]
在一些方面，组织是中枢神经系统中的组织，例如神经组织。在一些方面，靶向中枢神经系统的靶向部分能够被大型中性氨基酸转运蛋白1(lat1)转运。lat1(slc7a5)是摄取大型中性氨基酸和许多药物的转运蛋白。lat1可以转运药物，诸如l-dopa或加巴喷丁。
[0378]
在一些方面，靶向部分包含葡萄糖，例如d-葡萄糖，所述葡萄糖可以结合至葡萄糖转运蛋白1(或glut1)并且跨过bbb。glut1，也称为溶质载体家族2促进葡萄糖转运蛋白成员1(slc2a1)，是一种在人类中由slc2a1基因编码的单向转运蛋白。glut1促进葡萄糖跨过哺乳动物细胞的质膜的转运。该基因编码哺乳动物血脑屏障中的主要葡萄糖转运蛋白。
[0379]
在一些方面，靶向部分包含半乳糖，例如d-半乳糖，所述半乳糖可以结合至glut1转运蛋白以跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含谷氨酸，所述谷氨酸可以结合至乙酰胆碱
酯酶抑制剂(achei)和/或eaat抑制剂并且跨过bbb。乙酰胆碱酯酶是作为胆碱酯酶家族的主要成员的酶。乙酰胆碱酯酶抑制剂(achei)是抑制乙酰胆碱酯酶将乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸，从而增加中枢神经系统、自主神经节和神经肌肉连接(它们富含乙酰胆碱受体)中的神经递质乙酰胆碱的水平和作用持续时间的抑制剂。乙酰胆碱酯酶抑制剂是两种类型胆碱酯酶抑制剂之一；另一种是丁酰胆碱酯酶抑制剂。
[0380]
在一些方面，靶向部分是gaba，gaba可以结合至gaba受体以跨过bbb。gaba受体是一类对神经递质γ-氨基丁酸(gaba)产生反应的受体，gaba是成熟脊椎动物中枢神经系统中的主要抑制化合物。gaba受体有两类：gabaa和gabab。gabaa受体是配体门控离子通道(也称为离子移变型受体)；而gabab受体是g蛋白偶联受体，也称为代谢型受体。
[0381]
在一些方面，靶向部分包含酪氨酸，酪氨酸可结合至lat1并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含赖氨酸，赖氨酸可以结合至lat1并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含谷氨酰胺，谷氨酰胺可以结合至lat1并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含苯丙氨酸，苯丙氨酸可以结合至gaba受体、lat1、cns逆转录酶抑制剂和/或多巴胺(da)受体并且跨过bbb。多巴胺受体是一类在脊椎动物中枢神经系统(cns)中占主导地位的g蛋白偶联受体。多巴胺受体不仅通过g蛋白偶联活化不同的效应子，还通过不同的蛋白质(多巴胺受体相互作用蛋白)相互作用来进行信号传导。神经递质多巴胺是多巴胺受体的主要内源性配体。
[0382]
多巴胺受体与包括动机、愉悦、认知、记忆、学习和精细运动控制以及神经内分泌信号传导的调节在内的很多神经过程有关。异常的多巴胺受体信号传导和多巴胺能神经功能与若干神经精神病症有关。因此，多巴胺受体是常见的神经药物靶标；抗精神病药通常是多巴胺受体拮抗剂，而精神兴奋剂通常是多巴胺受体的间接激动剂。
[0383]
在一些方面，靶向部分包含缬氨酸，缬氨酸可以结合至cns逆转录酶抑制剂并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含色氨酸，色氨酸可以结合至gaba受体和/或cns逆转录酶抑制剂并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含亮氨酸，亮氨酸可以结合至gaba受体和/或cns逆转录酶抑制剂并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含甲硫氨酸，甲硫氨酸可以结合至gaba受体和/或cns逆转录酶抑制剂并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含组氨酸，组氨酸可以结合至gaba受体并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含异亮氨酸，异亮氨酸可以结合至cns逆转录酶抑制剂并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含谷胱甘肽，谷胱甘肽可以结合至gsh转运蛋白并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含谷胱甘肽-met，谷胱甘肽-met可以结合至gsh转运蛋白并且跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含尿素/硫脲，尿素/硫脲可以结合至一氧化氮合酶(nos)并且结合至bbb。在一些方面，靶向部分包含nad /nadh，nad /nadh能够通过氧化还原机制跨过bbb。在一些方面，靶向部分包含嘌呤并且可以跨过bbb。用于cns靶向的靶向部分的其他实例在sutera等人(2016):small endogenous molecules as moiety to improve targeting of cns drugs,expert opinion on drug delivery,doi:10.1080/17425247.2016.1208651中有所展示，该文献以引用的方式整体并入本文。
[0384]
在一些方面，靶向部分靶向的组织是骨骼肌。在一些方面，靶向骨骼肌的靶向部分能够被大型中性氨基酸转运蛋白1(lat1)转运。
[0385]
它在多种细胞类型中表达，包括t细胞、癌细胞和脑内皮细胞。lat1在脑微血管内皮细胞中始终以高水平表达。作为主要定位于bbb中的溶质载体，使本公开的胶束靶向lat1
允许通过bbb进行递送。在一些方面，使本公开的胶束靶向lat1转运蛋白的靶向部分是氨基酸，例如支链或芳族氨基酸。在一些方面，氨基酸是缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸。在一些方面，氨基酸是色氨酸和/或酪氨酸。在一些方面，氨基酸是色氨酸。在其他方面，氨基酸是酪氨酸。
[0386]
在一些方面，靶向部分是选自以下的lat1配体：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甲状腺素、美法仑、l-dopa、加巴喷丁、3,5-i-二碘酪氨酸、3-碘-i-酪氨酸、芬克洛宁、阿西维辛、亮氨酸、bch、甲硫氨酸、组氨酸、缬氨酸、或它们的任何组合。
[0387]
在一些方面，lat1配体是[1]l-苯丙氨酸、[2]邻溶肉瘤素、[3]间溶肉瘤素、[4]美法仑、[5]2-氨基-2-降冰片烷甲酸(bch)、[6](
±
)-2-氨基-1,2,3,4-四氢-2-萘甲酸、[7]dl-2-nam-5、[8]dl-2-nam-6、[9]dl-2-nam-7、[10]dl-2-nam-8、[11]dl-脱氯-nam、[12]dl-1-nam-7、[13](
±
)-2-氨基茚满-2甲酸、[14](
±
)-2-氨基苯并-双环-[2.2.1]庚烷-2'-外-甲酸、[15](
±
)-2-氨基-(双-2-氯乙基)-5-氨基茚满-2-甲酸、[16](
±
)-2-内-氨基-双(2-氯乙基)-7'-氨基苯并双环[2.2.1]庚烷-2-外-甲酸、[17]l-6-重氮-5-氧代-正亮氨酸(l-don)、[18]阿西维辛、[19]重氮丝氨酸、[20]丁硫氨酸硫酸亚胺(bso)、[21]l-1-萘丙氨酸、[22]邻苄基-l-酪氨酸、[23]l-2-氨基-壬酸、[24]l-酪氨酸、[25]α-甲基酪氨酸、[26]l-dopa、[27]α-甲基多巴、[28]3-邻甲基多巴、[29]屈昔多巴、[30]卡比多巴、[31]多巴胺、[32]酪胺、[33]α-甲基苯丙氨酸、[34]n-甲基苯丙氨酸、[35]苯丙氨酸甲酯、[36]加巴喷丁、[37]3,3
’‑
二碘甲状腺原氨酸、[38]l-t3、[39]3’,5’,3-三碘甲状腺原氨酸(r l-t3)、或[40]l-t4、或它们的任意组合，如下文所示。
[0388]
[0389][0390]
或它们的任何组合。
[0391]
在一些方面，lat1配体是如下文所示的靶向lat1的前药。
[0392][0393]
或它们的任何组合。
[0394]
参见singh&ecker(2018)“insights into the structure,function,and ligand discovery of the large neutral amino acid transporter 1,lat1,”int.j.mol.sci.19:1278；geier等人(2013)“structure-based ligand discovery for the large-neutral amino acid transporter 1,lat-1,”proc.natl.acad.sci.usa 110:5480-85；和chien等人(2018)“reevaluating the substrate specificity of the l-type amino acid transporter(lat1),”j.med.chem.61:7358-73，这些文献以引用的方式整体并入本文。
[0395]
在一些方面，本公开的载体单元包含：
[0396][0397]
其中a是色氨酸或苯丙氨酸，b是阳离子载体部分，例如赖氨酸。
[0398]
其中，
[0399]
(i)l是在约1和约200之间的整数；例如，约2和约10、约10和约20、约20和约30、约
是其中p＝0至5。在一些方面，p为0。在一些方面，x2是sh。
[0412]
靶向部分的非限制性实例如下文所描述。
[0413]
i.配体
[0414]
配体作为一类被定义为对另一种物质具有选择性(或特异性)亲和力的可选择性结合材料的靶向部分。配体通常但不一定被大型特异性结合体或“结合配偶体”或“受体”识别和结合。适用于靶向的配体的实例是抗原、半抗原、生物素、生物素衍生物、凝集素、半乳糖胺和岩藻糖胺部分、受体、底物、辅酶和辅因子等。
[0415]
当应用于本公开的胶束时，配体包括能够被相应的抗体或其级分结合或者结合至相应的抗体或其级分的抗原或半抗原。还包括病毒抗原或血凝素和神经氨酸酶和核衣壳，包括以下：任何dna和rna病毒、aids、hiv和肝炎病毒、腺病毒、甲病毒、沙粒病毒、冠状病毒、黄病毒、疱疹病毒、粘病毒、致癌rna病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小rna病毒、痘病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、鼻病毒、披膜病毒、和类病毒；任何细菌抗原，包括以下：革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、不动杆菌属(acinetobacter)、无色杆菌属(achromobacter)、拟杆菌属(bacteroides)、梭菌属(clostridium)、衣原体属(chlamydia)、肠道细菌、嗜血杆菌属(haemophilus)、乳杆菌属(lactobacillus)、奈瑟菌属(neisseria)、葡萄球菌属(staphyloccus)或链球菌属(streptoccocus)；任何真菌抗原，包括以下：曲霉属(aspergillus)、念珠菌属(candida)、球孢子菌属(coccidiodes)、真菌病病原、藻状菌纲和酵母；任何支原体抗原；任何立克次氏体抗原；任何原生动物抗原；任何寄生虫抗原；任何人类抗原，包括以下：血细胞、病毒感染细胞、遗传标记、心脏病、癌蛋白、血浆蛋白、补体因子、类风湿因子。包括癌症和肿瘤抗原，诸如甲胎蛋白、前列腺特异性抗原(psa)和cea、癌症标志物和癌蛋白等。
[0416]
可以用作靶向本公开的胶束的配体的其他物质是某些维生素(即，叶酸、b
12
)、类固醇、前列腺素、碳水化合物、脂质、抗生素、药物、地高辛、杀虫剂、麻醉剂、神经递质以及已使用或已修饰以使它们起到配体作用的物质。
[0417]
在一些方面，靶向部分包含蛋白质或蛋白质片段(例如，激素、毒素)以及具有细胞亲和力的合成或天然多肽。配体还包括对通过重组dna、遗传和分子工程产生的连接子具有选择性亲和力的各种物质。除非另有说明，否则本公开的配体还包括如美国专利号3,817,837中定义的配体，该专利以引用的方式整体并入本文。
[0418]
ii.连接子
[0419]
连接子作为本公开定义为特异性结合体或“配偶体”或“受体”的一类靶向部分，所述特异性结合体或“配偶体”或“受体”通常但不一定大于其可结合的配体。出于本公开的目的，它可以是能够与特定配体选择性亲和结合的特定物质或材料或化学物质或“反应物”。连接子可以是蛋白质，诸如抗体、非蛋白质结合体或“特定反应子”。
[0420]
当应用于本公开时，连接子包括抗体，所述抗体被定义为包括所有类别的抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、fab级分、它们的片段和衍生物。术语“抗体”涵盖不论天然或部分或全部以合成方式产生的免疫球蛋白及其片段。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单
克隆抗体和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人类单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人类单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(诸如scfv、scfab、(scfab)2、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段)、双体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。在本公开的一些方面，靶向部分是抗体或包含其抗原结合片段的分子。在一些方面，抗体是纳米体。在一些方面，抗体是adc。术语“抗体-药物缀合物”和“adc”可互换使用，并且是指例如与治疗剂(在本文中有时称为剂、药物或活性药物成分)或剂共价连接的抗体。在本公开的一些方面，靶向部分是抗体-药物缀合物。
[0421]
在某些条件下，本公开也适用于使用其他物质作为连接子。例如，适用于靶向的其他连接子包括天然存在的受体、任何血凝素和细胞膜和核衍生物，它们与激素、维生素、药物、抗生素、癌症标志物、遗传标记、病毒和组织相容性标志物特异性结合。另一组连接子包括任何rna和dna结合物质，诸如聚乙烯亚胺(pei)和多肽或蛋白质，诸如组蛋白和鱼精蛋白。
[0422]
其他连接子还包括酶，尤其是细胞表面酶，诸如神经氨酸酶、血浆蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、抑素、穴状物、甲状腺球蛋白、内因子、球蛋白、螯合剂、表面活性剂、有机金属物质、葡萄球菌蛋白a、蛋白g、核糖体、噬菌体、细胞色素、凝集素、某些树脂和有机聚合物。
[0423]
靶向部分还包括各种物质，诸如对通过重组dna、遗传和分子工程产生的任何细胞、组织或微生物的表面具有亲和力的任何蛋白质、蛋白质片段或多肽。因此，在一些方面，靶向部分将本公开的胶束引导至特定组织(即，肝组织或脑组织)、特定类型的细胞(例如，某些类型的癌细胞)、或细胞生理隔室或生理屏障(例如，bbb)。
[0424]
e.接头
[0425]
如上文所述，本文公开的阳离子载体单元可以包括如例如图3所示的一个或多个接头。如本文所用，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或者主要功能是连接本文公开的阳离子载体单元中的两个部分的非肽接头。在一些方面，本公开的阳离子载体单元可以包含至少一个将组织特异性靶向部分(tm)与水溶性聚合物(ws)连接的接头、至少一个将水溶性生物聚合物(wp)与阳离子载体(cc)或佐剂部分(am)连接的接头、至少一个将阳离子载体(cc)与佐剂部分(am)连接的接头、或它们的任何组合。在一些方面，两个或更多个接头可以串联连接。
[0426]
当本文公开的阳离子载体单元中存在多个接头时，每个接头可以相同或不同。通常，接头为阳离子载体单元提供灵活性。接头通常不被切割；然而，在某些方面，此类切割可以是期望的。因此，在一些方面，接头可包含一个或多个蛋白酶可切割位点，其可以位于接头序列内或接头序列任一端的接头侧翼。
[0427]
在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些方面，所述肽接头可包含至少约二个、至少约三个、至少约四个、至少约五个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个或至少约100个氨基酸。
[0428]
在一些方面，肽接头可以包含至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190个或至少约200个氨基酸。
[0429]
在其他方面，肽接头可以包含至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、至少约850、至少约900、至少约950、或至少约1,000个氨基酸。
[0430]
肽接头可以包含1个至约5个氨基酸、1个至约10个氨基酸、1个至约20个氨基酸、约10个至约50个氨基酸、约50个至约100个氨基酸、约100个至约200个氨基酸、约200个至约300个氨基酸、约300个至约400个氨基酸、约400个至约500个氨基酸、约500个至约600个氨基酸、约600个至约700个氨基酸、约700个至约800个氨基酸、约800个至约900个氨基酸或约900个至约1000个氨基酸。
[0431]
肽接头的实例是本领域熟知的。在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面，肽接头是根据式[(gly)n-ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，并且m为1至100的任何整数。在其他方面，甘氨酸/丝氨酸接头是根据式[(gly)x-sery]z(seq id no:1)的接头，其中x为1至4的整数，y为0或1，z为1至50的整数。在一个方面，肽接头包含序列gn，其中n可为1至100的整数。在一个具体方面，肽接头的序列是gggg(seq id no:2)。
[0432]
在一些方面，肽接头可以包含序列(glyala)n(seq id no:3)，其中n为在1和100之间的整数。在其他方面，肽接头可以包含序列(glyglyser)n(seq id no:4)，其中n为在1和100之间的整数。
[0433]
在其他方面，肽接头包含序列(gggs)n(seq id no:5)。在另外其他方面，肽接头包含序列(ggs)n(ggggs)n(seq id no:6)。在这些情况下，n可以是1-100的整数。在其他情况下，n可以是一至20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
[0434]
接头的实例包括但不限于ggg、sggsggs(seq id no:7)、ggsggsggsggsggg(seq id no:8)、ggsggsggggsggggs(seq id no:9)、ggsggsggsggsggsggs(seq id no:10)或ggggsggggsggggs(seq id no:11)。在其他方面，接头是多聚g序列(gggg)n(seq id no:12)，其中n可以是1-100的整数。
[0435]
在一个方面，肽接头是合成的，即，非天然存在的。在一个方面，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合的氨基酸序列，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，一方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含诸如添加、取代或缺失等的突变)。在另一个方面，肽接头可以包含非天然存在的氨基酸。在另一个方面，肽接头可包含天然存在的氨基酸，其存在于不存在于自然界的线性序列中。在又一个方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
[0436]
在一些方面，接头包括非肽接头。在其他方面，接头由非肽接头组成。在一些方面，非肽接头可以是例如马来酰亚胺基己酰基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(mp)、甲氧基聚乙二醇(mpeg)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(smcc)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺基酯(smpb)、n-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(siab)、6-[3-(2-吡啶基二硫)-丙酰
胺]己酸琥珀酰亚胺基酯(lc-spdp)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(smpt)等(参见，例如，美国专利号7,375,078)。
[0437]
使用本领域已知的技术(例如，化学偶联、重组技术或肽合成)可以将接头引入多肽序列。可通过dna序列分析确定修饰。在一些方面，使用重组技术可引入接头。在其他方面，使用固相肽合成可引入接头。在某些方面，本文公开的阳离子载体单元可以同时含有已使用重组技术引入的一个或多个接头和已使用固相肽合成或本领域已知的化学缀合方法引入的一个或多个接头。在一些方面，接头包含切割位点。
[0438]
iii.有效负载
[0439]
如本文所用，术语“有效负载”是指生物活性分子，例如治疗剂或者可以自身或通过接头与本公开的阳离子载体单元相互作用并且包含在本公开的胶束核心内的生物活性分子。本公开中考虑的有效负载包括但不限于治疗药物，例如前药、抗癌药物、抗肿瘤药物、抗真菌药物、抗细菌药物、抗病毒药物、心脏药物、以及神经系统药物；生物碱、抗生素、生物活性肽、类固醇、类固醇激素、多肽激素、干扰素、白介素、麻醉剂、核酸(包括反义寡核苷酸)、杀虫剂和前列腺素。生物活性分子还包括任何毒素，所述毒素包括黄曲霉毒素、蓖麻毒素、金环蛇毒素、伊立替康、更昔洛韦、呋塞米、吲哚美辛、氯丙嗪、氨甲蝶呤、西芬胺衍生物和类似物(包括瑟瓦定、地撒定和藜芦定)等。
[0440]
生物活性分子还包括但不限于各种黄酮衍生物和类似物，包括二羟基黄酮(白杨素)、三羟基黄酮(芹菜素)、五羟基黄酮(桑黄素)、六羟基黄酮(杨梅素)、黄盐、槲皮素、非瑟酮；各种抗生素，包括衍生物和类似物，诸如青霉素衍生物(即氨苄青霉素)、蒽环(即多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌)、布康唑、喜树碱、查耳霉素、教酒菌素、金黄霉素(v和m)、氯霉素、氯四环素、氯四环素、环孢菌素、玫瑰树碱、菲律宾菌素、制霉色基素、灰黄霉素、灰绿菌素、胍甲四环素、大环内酯(即两性霉素、氯丝菌素)、甲氧苯青霉素、制霉菌素、chrymutasin、依拉霉素、吉渥卡辛、近灰霉素、兰卡杀菌素类抗生素(即兰卡霉素)、丝裂霉素、土霉素、四环素、渥曼青霉素；各种抗微生物剂，包括利血平、螺内酯、磺胺醋酰钠、磺胺、甲砜氯霉素、硫藤黄素；各种嘌呤和嘧啶衍生物和类似物，包括5'-氟尿嘧啶、5'-氟-2'-脱氧尿苷、和别嘌呤醇；各种光敏剂物质，尤其是用于形成可用于光动力疗法的单线态和三线态氧的物质(van lier,j.e.in“photodynamic therapy of neoplastic disease”；kessel,d.编,crc press,boca raton,fl,1990,第1卷)，包括中二氢卟吩e6单乙二胺(mce6)、酞菁、卟啉、以及它们的衍生物和类似物；各种甾体化合物，诸如可的松、雌二醇、氢化可的松、睾酮、泼尼松龙、孕酮、地塞米松、倍氯米松和其他米松衍生物、其他甾体衍生物和类似物(包括胆固醇、毛地黄毒苷、地高辛、洋地黄毒苷)；各种香豆素衍生物和类似物，包括二羟基香豆素(七叶香素)、双香豆素、柯桠素、大黄酸、大黄素、黑麦酮酸；各种多巴、衍生物和类似物，包括多巴、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素(降正肾上腺素)；各种抗肿瘤剂或细胞生长抑制剂，诸如顺铂和紫杉烷(包括紫杉醇和多西他赛)；各种巴比妥类药物，包括苯巴比妥、阿莫巴比妥、别巴比妥、戊巴比妥和其他巴比妥衍生物；各种苯衍生物，包括氨基苯甲酸、溴苯甲酸、苯佐卡因、苯二氮类、苄硫噻嗪、对氨基苯甲酸丁酯；各种多肽衍生物；各种羧酸衍生物，诸如溴异戊脲、苯基丁酸、苯基戊酸、或它们的任何组合。
[0441]
其他生物活性分子包括但不限于二苯乙内酰脲、阿地芬、茴香脑、阿司匹林、偶氮丙唑酮、苄环庚烷、氯醛、苯丁酸氮芥、氯丙嗪、绿原素、肉桂酸、氯贝特、辅酶a、邻氨基苯甲
酸环己酯、地西泮、氟芬那酸、氟西奈德、氟比洛芬、愈创甘油醚、布洛芬、尿蓝母、吲哚美辛、碘、酮洛芬、甲凡那酸、甲萘醌、甲硝唑、硝西泮、苯妥英、对羟基苯甲酸丙酯、前西拉丁、喹诺酮、沙利度胺、二月桂基硫酸硫胺素、硫喷妥、氟羟氢泼尼松、维生素a、d3、e、k3、华法林、或它们的任何组合。
[0442]
其他生物活性分子是抗病毒药物、核酸和其他抗病毒物质，包括抗以下的物质：任何dna和rna病毒、aids、hiv和肝炎病毒、腺病毒、甲病毒、沙粒病毒、冠状病毒、黄病毒、疱疹病毒、粘病毒、致癌rna病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小rna病毒、痘病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、鼻病毒、披膜病毒、和类病毒；任何抗细菌药物、核酸和其他抗细菌物质，包括抗以下的物质：革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、不动杆菌属、无色杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、衣原体属、肠道细菌、嗜血杆菌属、乳杆菌属、奈瑟菌属、葡萄球菌属或链球菌属；任何抗真菌药物、核酸和其他抗真菌物质，包括抗以下的物质：曲霉属、念珠菌属、球孢子菌属、真菌病病原、藻状菌纲和酵母；任何抗支原体和立克次氏体的药物、核酸和其他物质；任何抗原生动物药物、核酸和其他物质；任何抗寄生虫药物、核酸和其他物质；任何治疗心脏病、肿瘤和病毒感染细胞等的药物、核酸和其他物质。
[0443]
(a)核酸
[0444]
在一些方面，生物活性分子(有效负载)是核酸，例如rna或dna。适用于使用本公开的胶束递送的核酸活性剂包括所有类型的rna和所有类型的dna，还包括用于聚合酶链式反应(pcr)、杂交或dna测序的寡核苷酸，诸如探针和引物。在一些方面，所述核酸包括mrna、mirna、mirna海绵、坚韧诱饵mirna(td)、antimir(antagomir)、小rna、rrna、sirna、shrna、gdna、cdna、pdna、pna、bna、反义寡核苷酸(aso)、适体、环状二核苷酸、或它们的任何组合。
[0445]
在一些方面，生物活性分子(有效负载)包括短干扰rna(sirna)，它是一种双链rna，可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而降低甚至抑制基因表达。例如，sirna可以在sirna和靶标rna之间的序列同一性区域内触发同源rna分子(诸如mrna)的特异性降解。非限制性示例性sirna在wo 02/44321中有所公开，该专利以引用的方式整体并入。
[0446]
在一些方面，生物活性分子(有效负载)包括短发夹rna(shrna)。在一些方面，生物活性分子包括mirna或mirna抑制剂(antimir)。在一些方面，生物活性分子(有效负载)的长度可以为10-30个核苷酸，例如长度为14-25个核苷酸。在一些方面，生物活性分子(有效负载)的长度为16-30个核苷酸、18-25个核苷酸，特别是18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸。
[0447]
mirna的序列可公开获得，例如，通过mirbase注册库(griffiths-jones等人,nucleic acids res.,36(database issue):d154-d158(2008)；griffiths-jones等人,nucleic acids res.,36(database issue):d140-d144(2008)；griffiths-jones等人,nucleic acids res.,36(database issue):d109-d111(2008))以及其他可公开访问的数据库获得。
[0448]
在一些方面，mirna抑制剂是核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)或其修饰的寡聚体或聚合物。在一些方面，mirna拮抗剂是antimir。antimir是一类特定的mirna抑制剂，例如在授予stoffel等人的us2007/0213292中有所描述。antimir是rna样寡核苷酸，它含有针对rna酶保护和药理性质，诸如增强的组织和细胞摄取的各种修饰。antimir与正常rna的不同之处在于糖、硫代磷酸骨架和3'-末端的胆固醇部分具有完全2'-o-甲基化。
[0449]
antimir和其他mirna抑制剂的非限制性实例在wo2009/020771、wo2008/091703、wo2008/046911、wo2008/074328、wo2007/090073、wo2007/027775、wo2007/027894、wo2007/021896、wo2006/093526、wo2006/112872、wo2007/112753、wo2007/112754、wo2005/023986、或wo2005/013901中有所描述，所有这些专利据此以引用的方式并入。
[0450]
在一些方面，核酸是磷酸二酯反义寡核苷酸，以及其中糖-磷酸“骨架”已经被“骨架类似物”(诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯或甲基膦酸酯键)衍生化或替代的任何寡核苷酸。在一些方面，核酸活性剂是反义寡核苷酸，以及具有非磷骨架类似物(诸如氨基磺酸酯、3'-硫代甲缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)(mmi)、3'-n-氨基甲酸酯或吗啉氨基甲酸酯)的任何寡核苷酸或寡脱氧核苷酸。
[0451]
在一些方面，生物活性分子(有效负载)是antimir。如本文所用，术语“antimir”、“抗微rna”、“抗mirna”及其变体是指用于中和细胞中的微rna(mirna)功能以获得所需反应的分子(例如，合成产生的分子)。mirna是与mrna互补的序列(大约20-22bp)，它涉及rna的切割或翻译的抑制。通过控制调节细胞中的mrna的mirna，antimir(也称为抗mirna寡核苷酸、amo或antagomir)可以用于进一步调节以及治疗某些细胞病症。这种调节可以通过空间阻断机制以及与mirna的杂交进行。
[0452]
antimir和mirna之间的这些体内相互作用可以用于治疗发生过表达/低表达或mirna异常导致编码问题的病症。人类遇到的一些与mirna相关的病症包括癌症、肌肉疾病、自身免疫性病症和病毒。
[0453]
antimir的各种组分可以被操纵以影响antimir的结合亲和力和效力。antimir的2'-糖可以被修饰以被氟和各种甲基取代，几乎所有这些都使结合亲和力增加。然而，这些修饰的2'-糖antimir中的一些会导致对细胞生长的负面影响。已知将5'-3'磷酸二酯骨架连键修饰为硫代磷酸酯(p-s)骨架连键也会对靶标亲和力产生影响。据发现，使用p-s突变会降低寡核苷酸的tm，从而产生较低的靶标亲和力。antimir的最后一个要求是错配特异性和长度限制。由于相同家族中的mirna共有“种子”(共有)序列，并且仅有几个另外的核苷酸不同；一个antimir可能靶向多个mirna序列。下表显示了一个或多个antimir或mirna序列的实例。
[0454]
表1.
[0455][0456]
在一些方面，有效负载是包含长度为5至30个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。在一些方面，核苷酸序列的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。
3'(seq id no:67)、5'-ccgtgtatgac-3'(seq id no:68)、5'-gccgtgtatgac-3'(seq id no:69)、5'-agccgtgtatgac-3'(seq id no:70)、5'-gagccgtgtatgac-3'(seq id no:71)、5'-agagccgtgtatgac-3'(seq id no:72)、5'-gagagccgtgtatgac-3'(seq id no:73)、5'-ggagagccgtgtatgac-3'(seq id no:74)、5'-aggagagccgtgtatgac-3'(seq id no:75)、5'-gaggagagccgtgtatgac-3'(seq id no:76)、5'-agaggagagccgtgtatgac-3'(seq id no:77)、或5'-gagaggagagccgtgtatgac-3'(seq id no:78)。
[0460]
在一些方面，有效负载(例如，antimir)是靶向hsa-mir-204(例如，has-mir-204-5p)的核苷酸序列。has-mir-204-5p在表1中显示为uucccuuugucauccuaugccu(seq id no:13)。在一些方面，有效负载(例如，antimir)是包含aggcauaggaugacaaagggaa(seq id no:15)、基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列，其中u可以是任选地t。在一些方面，有效负载(例如，antimir)是包含aggcauaggaugacaaagggaa(seq id no:15)、基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列，其中u可以是任选地t，并且其中所述核苷酸序列具有一个错配、两个错配、三个错配、或四个错配。在一些方面，有效负载(例如，antimir)是包含aggcauaggaugacaaagggaa(seq id no:15)、基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列，其中u可以是任选地t，并且其中所述核苷酸序列具有一个或两个错配。在其他方面，有效负载(例如，antimir)是靶向has-mir-204-5p(ucccuuu；seq id no:21)的种子序列的核苷酸序列。在一些方面，有效负载(例如，antimir)是包含aaaggga(seq id no:22)(种子的互补序列)的核苷酸序列，其中u可以是任选地t，并且其中所述核苷酸序列的长度为约10个核苷酸至30个核苷酸(例如，10至25、10至24、10至23、10至22、10至21、10至20、10至19、或10至18个核苷酸)。在一些方面，有效负载(例如，antimir)是包含aaaggga(seq id no:22)的核苷酸序列(种子的互补序列)，其中所述核苷酸序列在种子序列的互补序列的5'末端包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核酸，和/或在种子序列的互补序列的3'末端包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核酸。
[0461]
i.经化学修饰的多核苷酸
[0462]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)包含至少一个经化学修饰的核苷和/或核苷酸。当本公开的多核苷酸被化学修饰时，多核苷酸可以被称为“经修饰的多核苷酸”。
[0463]“核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。
[0464]“核苷酸”是指包含磷酸基团的核苷。经修饰的核苷酸可以通过任何有用的方法合成，例如，化学、酶促或重组，以包括一种或多种修饰的或非天然的核苷。
[0465]
多核苷酸可以包含连接核苷的一个或多个区域。这种区域可以具有可变的骨架连键。连键可以是标准磷酸二酯键，在这种情况下多核苷酸将包含核苷酸区域。
[0466]
本文公开的经修饰的多核苷酸可以包含各种不同的修饰。在一些方面，经修饰的多核苷酸包含一个、两个或更多个(任选地不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些方面，与未经修饰的多核苷酸相比，经修饰的多核苷酸可以表现出一种或多种期望的性质，例如，改善的热稳定性或化学稳定性、降低的免疫原性、减少的降解、增加与靶标微rna的结合、减少与其他微rna或其他分子的非特异性结合。
[0467]
在一些方面，本公开的多核苷酸是经化学修饰的。如本文所用，关于多核苷酸的术语“化学修饰”或适当的“经化学修饰的”是指关于腺苷(a)、鸟苷(g)、尿苷(u)、胸苷(t)或胞苷(c)核糖或脱氧核糖核苷在其位置、模式、百分比或群体中的一者或多者的修饰，包括但不限于其核碱基、糖、骨架、或它们的任何组合。
[0468]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir)可以具有所有或任何相同核苷类型的均一化学修饰，或者在所有或任何相同核苷类型中通过向下滴定相同起始修饰产生的修饰群体，或者所有任何相同核苷类型的化学修饰但具有随机掺入的测量百分比。在另一个方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir)在整个多核苷酸中可以具有两个、三个或四个相同核苷类型的均一化学修饰(诸如，所有尿苷和/或所有胞苷等以相同方式修饰)。
[0469]
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶、或鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许非标准碱基和标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间形成氢键。这种非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核碱基肌苷和腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。可以将碱基/糖或接头的任何组合掺入本公开的多核苷酸中。
[0470]
技术人员将理解，除非另有说明，否则本技术中列出的多核苷酸序列将在代表性dna序列中引用“t”，但当序列表示rna时，“t”将被替换为“u”。例如，本公开的td可以作为rna、作为dna、或作为包含rna和dna单元的杂交分子施用。
[0471]
在一些方面，多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485 antimir)包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20个或更多个)经修饰的核碱基的组合。
[0472]
在一些方面，多核苷酸(例如，antimir，例如mir485 antimir)中的核碱基、糖、骨架连键、或它们的任何组合被修饰至少约5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％。
[0473]
1.碱基修饰
[0474]
在某些方面，化学修饰在本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485 antimir)中的核碱基处。在一些方面、至少一种经化学修饰的核苷是经修饰的尿苷(例如，假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2u)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)或5-甲氧基-尿苷(mo5u))、经修饰的胞嘧啶(例如，5-甲基-胞苷(m5c))、经修饰的腺苷(例如，1-甲基-腺苷(m1a)、n6-甲基-腺苷(m6a)或2-甲基-腺嘌呤(m2a))、经修饰的鸟苷(例如，7-甲基-鸟苷(m7g)或1-甲基-鸟苷(m1g))、或它们的组合。
[0475]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)针对特定修饰而均一修饰(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)。例如，多核苷酸可以用相同类型的碱基修饰来均一修饰，例如5-甲基-胞苷(m5c)，这意味着多核苷酸序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5c)替代。类似地，多核苷酸可以针对序列中存在的任何类型的核苷残基通过用诸如上述任何那些的经修饰的核苷替换来均一修饰。
[0476]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)包含至少
两个(例如，2、3、4个或更多个)经修饰的核碱基的组合。在一些方面，至少约5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％的本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485 antimir)中的核碱基类型是经修饰的核碱基。
[0477]
2.骨架修饰
[0478]
在一些方面，有效负载可以包含“本公开的多核苷酸”(例如包含antimir，例如mir485 antimir)，其中所述多核苷酸包括对核苷之间的连键的任何有用的修饰。可用于本公开的组合物的此类连键，包括骨架修饰，包括但不限于以下：3'-亚烷基膦酸酯、3'-氨基氨基磷酸酯、含烯烃的骨架、氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、-ch
2-o-n(ch3)-ch
2-、-ch
2-n(ch3)-n(ch3)-ch
2-、-ch
2-nh-ch
2-、手性膦酸酯、手性硫代磷酸酯、甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架、亚甲基(甲基亚氨基)、亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼骨架、吗啉代连键、-n(ch3)-ch
2-ch
2-、具有杂原子核苷间连键的寡核苷、次膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸核苷间连键、硫代磷酸酯、磷酸三酯、pna、硅氧烷骨架、氨基磺酸酯骨架、硫化亚砜和砜骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硫代氨基磷酸酯。
[0479][0480]
在一些方面，上文公开的骨架连键的存在增加了本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485 antimir)的稳定性(例如，热稳定性)和/或对降解(例如，酶降解)的耐性。在一些方面，与无修饰的对应的多核苷酸(参考或对照多核苷酸)相比，经修饰的多核苷酸的稳定性和/或对降解的耐性增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％。
[0481]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)中的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％的骨架连键是经修饰的(例如，它们都是硫代磷酸酯)。
[0482]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个骨架连键是经修饰的(例如，硫代磷酸酯)。
[0483]
在一些方面，骨架包含选自由以下组成的组的连键：磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲
基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、以及它们的组合。
[0484]
3.糖修饰
[0485]
可以掺入本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485 antimir)中的经修饰的核苷和核苷酸可以在核酸的糖上进行修饰。因此，在一些方面，有效负载包含核酸，其中所述核酸包含至少一个核苷类似物(例如，具有糖修饰的核苷)。
[0486]
在一些方面，糖修饰增加了多核苷酸与其靶标mirna的结合亲和力。在多核苷酸中掺入亲和力增强的核苷酸类似物诸如lna或2'-取代的糖可以允许减少多核苷酸的长度，并且还可以在发生非特异性或异常结合之前减少多核苷酸的大小上限。
[0487]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)中的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％的核苷酸包含糖修饰(例如，lna)。
[0488]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22个核苷酸单元是经糖修饰的(例如，lna)。
[0489]
通常，rna包含糖基核糖，它是具有氧的5元环。示例性、非限制性经修饰核苷酸包括核糖中的氧的替代(例如，被s、se或亚烷基，诸如亚甲基或亚乙基替代)；双键的添加(例如，用环戊烯基或环己烯基替代核糖)；核糖的环缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，形成具有另外的碳原子或杂原子的6或7元环，诸如对于另外具有氨基磷酸酯骨架的脱水己糖醇、阿曲糖醇、甘露糖醇、环己基、环己烯基和吗啉)；多环形式(例如，三环；和“未锁定”形式，诸如乙二醇核酸(gna)(例如，r-gna或s-gna，其中核糖被连接至磷酸二酯键的二醇单元替代)、苏糖核酸(tna，其中核糖被α-l-苏呋喃糖基-(3'
→
2')取代)和肽核酸(pna，其中2-氨基-乙基-甘氨酸连键取代核糖和磷酸二酯骨架)。糖基团还可以包含一个或多个碳，所述碳的立体化学构型与核糖中相应碳的立体化学构型相反。因此，多核苷酸分子可以包括含有以例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
[0490]
核糖的2'羟基(oh)可以被许多不同的取代基修饰或取代。2'-位的示例性取代包括但不限于h、卤素、任选取代的c
1-6
烷基；任选取代的c
1-6
烷氧基；任选取代的c
6-10
芳氧基；任选取代的c
3-8
环烷基；任选取代的c
3-8
环烷氧基；任选取代的c
6-10
芳氧基；任选取代的c
6-10
芳基-c
1-6
烷氧基、任选取代的c
1-12
(杂环基)氧基；糖(例如，核糖、戊糖或本文所述的任何糖)；聚乙二醇(peg)、-o(ch2ch2o)nch2ch2or，其中r是h或任选取代的烷基，并且n为0至20的整数(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16、和4至20)；“锁”核酸(lna)，其中2'-羟基通过c
1-6
亚烷基或c
1-6
杂亚烷基桥连接至相同核糖的4'-碳，其中示例性桥包括亚甲基、亚丙基、醚、氨基桥、氨基烷基、氨基烷氧基、氨基、和氨基酸。
[0491]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)中存在的核苷类似物包括例如2'-o-烷基-rna单元、2'-ome-rna单元、2'-o-烷基-sna、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、lna单元、阿拉伯核酸(ana)单元、2'-氟-ana单元、hna单元、ina(嵌入核酸)单元、2'moe单元、或它们的任何组合。在一些方面，lna是例如氧代-lna(诸如β-d-氧
代-lna或α-l-氧代-lna)、氨基-lna(诸如β-d-氨基-lna或α-l-氨基-lna)、硫代-lna(诸如β-d-硫代0-lna或α-l-硫代-lna)、ena(例如β-d-ena或α-l-ena)、或它们的任何组合。
[0492]
在一些方面，本公开的多核苷酸中存在的核苷类似物包括锁核酸(lna)；2'-0-烷基-rna；2'-氨基-dna；2'-氟-dna；阿拉伯糖核酸(ana)；2'-氟-ana、己糖醇核酸(hna)、嵌入核酸(ina)、受约束乙基核苷(cet)、2'-0-甲基核酸(2'-ome)、2'-0-甲氧基乙基核酸(2'-moe)、或它们的任何组合。
[0493]
在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，antimir，例如，mir485antimir)可以包含经修饰的rna核苷酸类似物(例如，lna)和dna单元。在一些方面，本公开的多核苷酸是缺口聚体。参见，例如，美国专利号8,404,649；8,580,756；8,163,708；9,034,837；所有这些专利均以引用的方式整体并入本文。在一些方面，本公开的多核苷酸是微mir。参见美国专利申请公开号us20180201928，该专利申请以引用的方式整体并入本文。
[0494]
iv.胶束
[0495]
本公开还提供了包含本公开的阳离子载体单元的胶束。本公开的胶束包含本公开的阳离子载体单元和带负电的有效负载，其中所述带负电的有效负载和阳离子载体单元彼此缔合。在一些方面，缔合包括共价键(参见图1)。在其他方面，缔合不包括共价键(参见图1)。在其他方面，缔合通过离子键，即通过静电相互作用。在一些方面，带负电的有效负载(例如，dna和/或rna)不通过共价键缀合至阳离子载体单元，和/或带负电的有效负载仅通过离子相互作用与阳离子载体单元的阳离子载体部分相互作用。
[0496]
在一些方面，本公开的阳离子载体单元和胶束保护有效负载(例如，dna和/或rna)免受降解(例如，被dna酶和/或rna酶降解)。首先，阳离子载体单元能够通过静电相互作用保护有效负载。其次，胶束将有效负载隔离至胶束的核心，即在dna酶和/或rna酶的范围之外。在一些方面，与游离的有效负载相比，保护有效负载免受循环酶(例如，核酸酶)的影响可以增加带负电的有效负载(例如，dna和/或rna)的半衰期。在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以使有效负载的血浆半衰期增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍、至少约22倍、至少约23倍、至少约24倍、至少约25倍、至少约26倍、至少约27倍、至少约28倍、至少约29倍、或至少约30倍。
[0497]
在一些方面，当在溶液中与带负电的有效负载(例如，核酸)混合时，阳离子载体单元的正电荷，特别是阳离子载体部分的电荷足以形成胶束，其中阳离子载体单元，特别是其阳离子载体部分，与带负电的有效负载(例如，核酸)之间的总离子比为约1:1。在一些方面，阳离子载体单元，特别是其阳离子载体部分，与带负电的有效负载(例如，核酸)之间的总离子比大于1:1，即，使用过量的阳离子载体单元。在一些方面，阳离子载体单元，特别是其阳离子载体部分，与带负电的有效负载(例如，核酸)之间的总离子比小于1:1，即，使用过量的带负电的有效负载。
[0498]
在一些方面，在与合适的缓冲液(例如，pbs)组合时，在本公开的阳离子载体单元和有效负载(例如，反义寡核苷酸，诸如antimir)之间形成的复合物自组织以产生胶束。参见图5。
[0499]
胶束是由一个或多个两亲分子组成的水溶性或胶体结构或聚集体。两亲分子是包
含至少一个亲水(极性)部分和至少一个疏水(非极性)部分的分子。“经典胶束”具有单个、中心和主要为疏水性的区域或“核心”，它被亲水层或“壳”包围。在水溶液中，胶束与周围溶剂所接触的两亲分子的亲水“头部”区域形成聚集体，从而将两亲分子的疏水单尾区域隔离在胶束核心中。胶束的形状近似为球形。其他形状，例如椭圆体、圆柱体、棒状结构、或聚合物囊泡也是可能的。所公开的胶束的形状和尺寸以及因此负载能力可以通过改变水溶性生物聚合物(例如，peg)和阳离子载体(例如，聚赖氨酸)之间的比率来改变。根据比率，载体单元可以组织为小颗粒、小胶束、胶束、棒状结构或聚合物囊泡(参见图6)。因此，术语“本公开的胶束”不仅涵盖经典胶束，而且还涵盖小颗粒、小胶束、胶束、棒状结构或聚合物囊泡。
[0500]
本公开的胶束可以由包含疏水和亲水部分的单个单分子聚合物或包含许多两亲(即表面活性剂)分子(在等于或大于临界胶束浓度(cmc)时在极性(即水性)溶液中形成)的聚集混合物组成。胶束由一个或多个两亲分子自组装而成，其中部分被定向以提供主要疏水性内核和主要亲水性外部。
[0501]
本公开的胶束的尺寸范围可以为5至约2000纳米。在一些方面，胶束的直径在约10nm和约200nm之间。在一些方面，胶束的直径在约1nm和约100nm之间、在约10nm和约100nm之间、在约10nm和约90nm之间、在约10nm和约80nm之间、在约10nm和约70nm之间、在约20nm和约100nm之间、在约20nm和约90nm之间、在约20nm和约80nm之间、在约20nm和约70nm之间、在约30nm和约100nm之间、在约30nm和约90nm之间、在约30nm和约80nm之间、在约30nm和约70nm之间、在约40nm和约100nm之间、在约40nm和约90nm之间、在约40nm和约80nm之间、或在约40nm和约70nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约30nm和约60nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约15nm和约90nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约15nm和约80nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约15nm和约70nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约15nm和约60nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约15nm和约50nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约20nm和约60nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约20nm和约50nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约20nm和约40nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径在约25nm和约35nm之间。在一些方面，本公开的胶束的直径为约32nm。胶束尺寸的示例性分布显示在图9中。
[0502]
在一些方面，胶束可以包含单一类型的antimir，例如mir485antimir。在其他方面，胶束可以包含多于一种类型的antimir，例如，(i)具有靶向相同mirna的不同构造的antimir；(ii)具有靶向不同mirna的不同构造的antimir；(iii)具有靶向相同mirna的相同构造的antimir；或，(iv)它们的组合。
[0503]
在一些方面，本公开的胶束包含单一类型的阳离子载体单元。在其他方面，本公开的胶束包含多于一种类型的阳离子载体单元(例如，靶向靶细胞表面上的不同受体)。在一些方面，本公开的胶束可以包含具有不同靶向部分、不同阳离子载体部分(例如，以容纳不同有效负载)和/或不同佐剂单元的阳离子载体单元。
[0504]
为了形成具有有效负载的胶束，可以将不同类型的阳离子或阴离子载体单元组合在一起。例如，为了靶向血脑屏障，本公开的胶束可以包含连接至靶向部分的阳离子(或阴离子)载体单元和不连接至靶向部分的阳离子(或阴离子)载体单元。在一些方面，胶束包含约50至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约50至约150、约50至约140、约50至约130、约50至约120、约50至约110、或约50至约100个阳离子或阴离子载体单
元。在一些方面，胶束包含约60至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约60至约150、约60至约140、约60至约130、约60至约120、约60至约110、约60至约100、约60至约90、约60至约80、或约60至约70个阳离子或阴离子载体单元。在一些方面，胶束包含约70至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约70至约150、约70至约140、约70至约130、约70至约120、约70至约110、约70至约100、约70至约90、或约70至约80个阳离子或阴离子载体单元。在一些方面，胶束包含约80至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约80至约150、约80至约140、约80至约130、约80至约120、约80至约110、约80至约100、或约80至约90个阳离子或阴离子载体单元。在一些方面，胶束包含约90至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约90至约150、约90至约140、约90至约130、约90至约120、约90至约110、或约90至约100个阳离子或阴离子载体单元。在一些方面，胶束包含约100至约200个阳离子或阴离子载体单元。在其他方面，胶束包含约100至约150、约100至约140、约100至约130、约100至约120、约100至约110、或约100至约100个阳离子或阴离子载体单元。
[0505]
本公开还包括这样的胶束，所述胶束包含(i)核苷酸序列(例如，长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个核苷酸的寡核苷酸)，和(ii)本文所述的阳离子载体单元。在一些方面，本公开涉及这样的胶束，所述胶束包含(i)核苷酸序列，例如mirna或mirna抑制剂(例如，长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个核苷酸的寡核苷酸)，和(ii)约80至约120个(例如，约85至约115、约90至约110、约95至约105个)本文所述的阳离子载体单元，例如，tm-wp-cc-am、wp-cc-am、或它们的组合(参见图3)。在一些方面，胶束包含(i)核苷酸序列，例如mirna或mirna抑制剂(例如，长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个核苷酸的寡核苷酸)，和(ii)约80至约120个(例如，约80、约85、约90、约95、约100、约105、或约110个)本文所述的阳离子载体单元，例如，任选的tm-wp-cc-am(参见图3)。在一些方面，胶束包含(i)核苷酸序列，例如mirna或mirna抑制剂(例如，长度为约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个核苷酸的寡核苷酸)，和(ii)约90至约110个，例如约100个阳离子载体单元，其中(a)约45至约55个，例如约50个阳离子载体单元包含tm-wp-cc-am，以及(b)约45至约55个，例如约50个阳离子载体单元包含wp-cc-cm，其中tm是苯丙氨酸，wp是(peg)
5000
，并且cc是约40至约50个赖氨酸，例如约45、约46、约47、约48、约49、或约50个赖氨酸，并且其中约5至约15个赖氨酸、约10个赖氨酸中的每一个与维生素b3(烟酰胺)融合。
[0506]
在一些方面，本公开的胶束包含(i)核苷酸序列，例如mir485-3p抑制剂，例如5'-agagaggagagccguguaugac-3’(seq id no:18)，和(ii)约100个阳离子载体单元，其中(a)约50个阳离子载体单元包含tm-wp-cc-am，以及(b)约50个阳离子载体单元包含wp-cc-cm，其中tm是苯丙氨酸，wp是(peg)
5000
，并且cc是约47个赖氨酸，并且其中约10个赖氨酸中的每一个与维生素b3(烟酰胺)融合。
[0507]
在一些方面，胶束可以包含单个有效负载(例如，单个寡核苷酸，例如antimir)。在其他方面，胶束可以包含多于一个有效负载(例如，多个寡核苷酸，例如多个antimir)。
[0508]
v.制造方法
[0509]
本公开还提供了制备本公开的阳离子载体单元和胶束的方法。一般而言，本公开提供了一种制备本公开的阳离子载体单元的方法，所述方法包括合成如例如在实施例部分中所述的阳离子载体单元。如本文所用，术语“合成”是指使用本领域已知的方法组装阳离
子载体单元。例如，可以重组制备蛋白质组分(例如，抗体靶向部分)并且随后缀合至阳离子载体单元的其他组分。在一些方面，阳离子载体单元的每一种组分可以使用本领域已知的方法例如重组蛋白生产、固相肽或核酸合成、化学合成、酶促合成或它们的任何组合制备，并且所得的组分可以使用本领域已知的化学和/或酶促方法缀合。
[0510]
可以纯化本公开的阳离子载体单元以除去污染物。在一些方面，阳离子载体单元包括均匀的阳离子载体单元群体。然而，在其他方面，阳离子载体单元可以包含多种种类(例如，它们中的一些包含靶向部分，而另一些则包含其余部分但无靶向部分)。在一些方面，本公开的阳离子载体单元的制造包括冻干或适合复原的任何其他形式的干燥储存。在一些方面，干燥形式的阳离子载体单元的制备发生在阳离子载体单元与有效负载(例如，核酸)组合之后。
[0511]
在一些方面，制备本公开的胶束的方法包括将阳离子载体单元与带负电的有效负载(例如，核酸，如反义寡核苷酸，例如antimir)以1:1的离子比混合。在一些方面，阳离子载体单元和带负电的有效负载在溶液中组合。在一些方面，在阳离子载体和带负电的有效负载在溶液中组合之后，将所得的溶液冻干或干燥。在一些方面，阳离子载体和带负电的有效负载的组合以干燥形式进行。
[0512]
如图图6所示，水溶性聚合物(a，例如peg)的单体单元的数量n与阳离子载体部分(b，例如聚赖氨酸)中的单体单元(例如，赖氨酸)的数量m之比会影响所得的胶束的尺寸和形状，其中在每种情况下单元n或m的数量最多可达1,000个单元。在mb/(na mb)比率为0.5时，所得的胶束是经典胶束。如果mb/(na mb)大于0.5，则所得的胶束是棒状胶束或聚合物囊泡。如果mb/(na mb)小于0.5，则所得的胶束是小胶束或小颗粒。
[0513]
本公开的胶束可以使用本领域已知的任何技术产生，例如涡旋、挤出、或超声处理。胶束的形成取决于大于包含本公开的阳离子载体单元的溶液的临界胶束浓度(cmc)的应用条件。在达到一定浓度值后，表面活性剂开始结合并且组织成更复杂的单元，诸如胶束。包含本公开的阳离子载体的溶液的cmc可以通过在cmc周围显示出明显转变的任何物理性质(例如，表面张力)来确定。
[0514]
据熟知的smith-ewart理论预测，导致在cmc上方形成胶束的成核颗粒的数量与表面活性剂(在本公开中，与阴离子有效负载复合或缔合的阳离子载体单元)浓度成比例，幂为0.6。这是因为对于给定的表面活性剂，形成的胶束数量通常随着表面活性剂浓度的增加而增加。
[0515]
在一些方面，本公开的胶束可以是纯化的，例如以除去污染物和/或产生均匀的胶束群体(例如，具有相同尺寸的胶束，或具有相同有效负载或相同靶向部分的胶束)。
[0516]
vi.药物组合物
[0517]
本公开还提供了适合施用于受试者的包含本公开的阳离子载体单元和/或胶束(即，包含本公开的阳离子载体单元的胶束)的药物组合物。如上所述，本公开的胶束可以是同质的(即，所有胶束包含相同类型的阳离子载体单元，具有相同的靶向部分和相同的有效负载)。然而，在其他方面，胶束可以包含多个靶向部分、多个有效负载等。
[0518]
药物组合物通常包含本公开的阳离子载体单元和/或胶束以及适合施用于受试者的形式的药学上可接受的赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂或载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。
[0519]
存在多种合适的包含本公开的胶束的药物组合物的制剂(参见，例如，remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.第18版(1990))。药物组合物通常被配制为无菌的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(gmp)规定。在一些方面，药物组合物包含一个或多个本文所述的胶束。
[0520]
在某些方面，本文所述的胶束与一种或多种其他治疗剂在药学上可接受的载体中共施用。在一些方面，包含本文所述的胶束的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其他方面，包含本文所述的胶束的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在其他方面，包含本文所述的胶束的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
[0521]
在一些方面，药物载体在胶束形成后添加。在其他方面，药物载体在胶束形成前添加。
[0522]
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0523]
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药学活性物质的用途在本领域中众所周知。除非任何常规介质或化合物与本文公开的阳离子载体单元或胶束不相容，否则考虑其在组合物中的使用。
[0524]
补充治疗剂也可以掺入本公开的组合物中。通常，将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。本文所述的胶束可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、透皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌肉内途径或作为吸入剂施用。在某些方面，本文所述的药物组合物胶束静脉内施用，例如通过注射。本文所述的胶束可以任选地与在治疗本文所述的胶束所针对的疾病、病症或疾患方面至少部分有效的其他治疗剂组合施用。
[0525]
溶液或悬浮液可以包括以下组分：诸如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂的无菌稀释剂；诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌化合物；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸(edta)的螯合化合物；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲剂；以及诸如氯化钠或右旋糖的用于调整张力的化合物。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节ph。所述制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0526]
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf,parsippany,n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。所述组合物通常是无菌的，并且是流体以达到容易注射的程度。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多
元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂等的包衣，在分散体的情况下通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。防止微生物的作用可通过各种抗细菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来达成。如果需要，可将等渗化合物，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠添加到组合物中。可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延长吸收。
[0527]
本公开的药物组合物可以通过常规的、熟知的灭菌技术进行灭菌。可将水性溶液进行包装以期使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水溶液混合。
[0528]
根据需要，可以通过将本文所述的胶束以有效量并且在适当的溶剂中与本文列举的一种成分或成分的组合一起掺入来制备无菌注射用溶液。通常，通过将本文所述的胶束掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和任何所需要的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其预先无菌过滤的溶液中产生活性组分加上任何另外的所需组分的粉末。本文所述的胶束可以以贮库注射剂或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以允许本文所述的胶束持续或脉冲式释放的方式配制。
[0529]
包含本文所述胶束的组合物的全身施用也可以通过经粘膜方式进行。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用例如鼻喷雾剂来完成。
[0530]
在某些方面，将包含本文所述胶束的药物组合物静脉内施用于将受益于所述药物组合物的受试者。在某些方面，例如通过淋巴管内注射或通过结节内注射(参见例如senti等人,pnas 105(46):17908(2008))或通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射至胸腺中或至肝脏中来将组合物施用至淋巴系统。
[0531]
在某些方面，包含本文所述的胶束的药物组合物作为液体混悬剂施用。在某些方面，将药物组合物以能够在施用后形成贮库的制剂的形式施用。在某些优选的方面，贮库缓慢地将本文所述的胶束释放到循环中，或保持贮库形式。
[0532]
通常，药学上可接受的组合物被高度纯化为不含污染物，是生物相容的并且无毒，并且适合于向受试者施用。如果水是载体的成分，则将水高度纯化并处理成不含污染物(例如，内毒素)。
[0533]
药学上可接受的载体可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。
[0534]
本文所述的药物组合物包含本文所述的胶束和任选地药物活性剂或治疗剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。
[0535]
提供了包含本文所述的胶束的剂型。在一些方面，剂型被配制为液体悬浮液以用于静脉内注射。
[0536]
本文公开的胶束或包含胶束的药物组合物可以与其他药物同时使用。具体而言，本公开的胶束或药物组合物可以与诸如激素治疗剂、化学治疗剂、免疫治疗剂、抑制细胞生
长因子或细胞生长因子受体的作用的药物等的药物一起使用。
[0537]
vii.治疗和使用方法
[0538]
本公开还提供了治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括将本公开的胶束或其组合施用于受试者，例如哺乳动物，诸如人类受试者。在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的神经退行性病症或癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本公开的胶束或本公开的药物组合物施用于受试者。
[0539]
在一些方面，本公开的胶束可以通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注施用。
[0540]
在一些方面，本公开的胶束可以与适用于治疗本文公开的疾病和疾患的其他药物或治疗同时使用。
[0541]
本公开还提供了包封用于递送的有效负载的方法，所述方法包括将有效负载，例如阴离子有效负载，诸如核酸(例如，antimir)掺入本公开的胶束中。
[0542]
本公开还提供了增加有效负载对降解(例如，核酸酶介导的降解)的耐性的方法，所述方法包括将有效负载，例如阴离子有效负载，诸如核酸(例如，antimir)掺入本公开的胶束中。
[0543]
在一些方面，本公开提供了跨过血脑屏障(bbb)的方法，所述方法包括施用本文公开的胶束，例如包含作为靶向部分的色氨酸和/或酪氨酸的胶束。如图7所示，负载有抗mirna的本公开的胶束可以靶向bbb受体，例如lat1，如上文所公开。一旦胶束通过受体介导的转胞吞作用跨过bbb并且被脑细胞(例如，神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞)摄取，有效负载(例如，antimir)即可释放并且与胞内靶标相互作用(例如，antimir可以与靶标微rna结合并且触发rna酶h介导的降解)。
[0544]
在一些方面，与游离的有效负载(即，不在胶束中，例如，在溶液中游离)相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载对降解的耐性至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％。
[0545]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载对降解的耐性至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍、至少约22倍、至少约23倍、至少约24倍、至少约25倍、至少约26倍、至少约27倍、至少约28倍、至少约29倍、或至少约30倍。
[0546]
本公开还提供了在施用期间(例如，在受试者的血流中)增加有效负载的稳定性的方法，所述方法包括将有效负载，例如阴离子有效负载，诸如核酸(例如，antimir)掺入本公开的胶束中。
[0547]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载的稳定性(例如，增加对核酸酶的耐性)至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至
少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％。
[0548]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载的稳定性(例如，增加对核酸酶的耐性)至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍、至少约22倍、至少约23倍、至少约24倍、至少约25倍、至少约26倍、至少约27倍、至少约28倍、至少约29倍、或至少约30倍。
[0549]
本公开还提供了增加有效负载的血浆半衰期的方法，所述方法包括将有效负载，例如阴离子有效负载，诸如核酸(例如，antimir)掺入本公开的胶束中。
[0550]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载的血浆半衰期至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％、至少约1100％、至少约1200％、至少约1300％、至少约1400％、至少约1500％、至少约1600％、至少约1700％、至少约1800％、至少约1900％、或至少约2000％。
[0551]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以使有效负载的血浆半衰期增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍、至少约22倍、至少约23倍、至少约24倍、至少约25倍、至少约26倍、至少约27倍、至少约28倍、至少约29倍、或至少约30倍。
[0552]
在一些方面，与游离的antimir的血浆半衰期相比，包封的有效负载是本文公开的antimir，例如seq id no:18的反义寡核苷酸，或其变体或衍生物(例如，与seq id no:18的反义寡核苷酸具有至少约70％同一性的寡核苷酸)，其中antimir包封在本公开的胶束中增加antimir的血浆半衰期至少约10倍、至少约12倍、至少约14倍、至少约16倍、至少约18倍、或至少约20倍。在一个特定方面，与游离的antimir的血浆半衰期相比，包封的有效负载是本文公开的antimir，例如seq id no:18的反义寡核苷酸，或其变体或衍生物(例如，与seq id no:18的反义寡核苷酸具有至少约70％同一性的寡核苷酸)，其中antimir包封在本公开的胶束中增加antimir的血浆半衰期至少约20倍。在一些方面，包封在本公开的胶束中的antimir的血浆半衰期为至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟、至少约60分钟、至少约70分钟、至少约80分钟、至少约90分钟、至少约100分钟、或至少约120分钟。在一个特定方面，包封在本公开的胶束中的antimir(例如，seq id no:18的反义寡核苷酸)的血浆半衰期为至少约90分钟。
[0553]
本公开还提供了增加有效负载通过生理屏障例如bbb或质膜的渗透、递送、转运或运输的方法，所述方法包括将有效负载，例如阴离子有效负载，诸如核酸(例如，antimir)掺入本公开的胶束中。
[0554]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载通过生理屏障(例如bbb或质膜)的渗透、递送、转运或运输至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％。
[0555]
在一些方面，与游离的有效负载相比，有效负载包封在本公开的胶束中可以增加有效负载通过生理屏障(例如bbb或质膜)的渗透、递送、转运或运输至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约21倍、至少约22倍、至少约23倍、至少约24倍、至少约25倍、至少约26倍、至少约27倍、至少约28倍、至少约29倍、或至少约30倍。
[0556]
在一些方面，本公开的胶束可以用于靶向干细胞，例如递送治疗性分子(例如，治疗性多核苷酸)或基因治疗组分。在其他方面，本公开的胶束可以用于治疗癌症。例如，本公开的胶束可以靶向对特定类型的癌症(例如，胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌或宫颈癌)具有特异性的标志物，并且将治疗性分子(例如，治疗性多核苷酸、肽或小分子)作为有效负载携带。
[0557]
在特定方面，本公开的胶束可以用于治疗胰腺癌。在一些方面，将本公开的胶束引导至胰腺组织的靶向部分是环状rgd肽。在其他方面，将本公开的胶束引导至胰腺组织的靶向部分是主要或专门在正常或癌性胰腺细胞表面上表达的生物标志物。在一些方面，本公开的胶束的有效负载是靶向k-ras的寡核苷酸，其中将有效负载递送至胰腺组织有效地减少了k-ras的表达。
[0558]
在一些方面，本公开的胶束可以用于治疗或改善神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病的症状。在一些方面，本公开的胶束包含有效负载，例如antimir，所述有效负载靶向在阿尔茨海默氏病神经元组织中过表达的分子，例如mirna-485-3p。因此，在一些方面，将本公开的胶束(例如，包含lat1靶向部分(使胶束有效地转运跨过bbb)和靶向mirna-485-3p的antimir有效负载的胶束)施用于阿尔茨海默氏病患者可以预防或改善阿尔茨海默氏病的症状，诸如细胞凋亡、线粒体功能丧失、或炎症。参见图24。
[0559]
在一些方面，本公开提供了一种减轻患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者的炎症(例如，神经炎症)的方法，所述方法包括将治疗有效量的本公开的胶束施用于受试者，其中所述胶束包含能够有效减轻受试者的炎症(例如，神经炎症)的治疗剂。在一些方面，神经炎症是皮层炎症。在一些方面，神经炎症是海马体炎症。在一些方面，治疗剂是靶向mirna-485-3p的antimir(例如，seq id no:18的antimir或其片段或变体)，其中所述antimir可以降低受试者的mirna-485-3p的水平。
[0560]
在一些方面，与未用本公开的胶束治疗的受试者或受试者群体中观察到的神经炎症的水平相比，将本公开的胶束施用于患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者可以降低神经炎症的水平至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％的神经炎症。
[0561]
在一些方面，本公开提供了一种减少患有阿尔茨海默氏病的受试者的淀粉样蛋白斑块负荷的方法，所述方法包括将治疗有效量的本公开的胶束施用于受试者，其中所述胶束包含能够有效减少受试者的淀粉样斑块负荷的治疗剂。在一些方面，治疗剂是靶向mirna-485-3p的antimir(例如，seq id no:18的antimir或其片段或变体)，其中所述antimir可以降低受试者的mirna-485-3p的水平。
[0562]
在一些方面，与未用本公开的胶束治疗的受试者或受试者群体中观察到的淀粉样蛋白斑块负荷相比，将本公开的胶束施用于患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者可以降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％的淀粉样蛋白斑块负荷。
[0563]
在一些方面，本公开提供了一种恢复和/或诱导患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者的神经发生的方法，所述方法包括将治疗有效量的本公开的胶束施用于受试者，其中所述胶束包含能够有效恢复和/或诱导受试者的神经发生的治疗剂。在一些方面，治疗剂是靶向mirna-485-3p的antimir(例如，seq id no:18的antimir或其片段或变体)，其中所述antimir可以降低受试者的mirna-485-3p的水平。
[0564]
在一些方面，与未用本公开的胶束治疗的受试者或受试者群体中观察到的神经发生的水平相比，将本公开的胶束施用于患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者可以恢复和/或诱导受试者的神经发生至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％。
[0565]
在一些方面，本公开提供了一种改善患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者的认知功能的方法，所述方法包括将治疗有效量的本公开的胶束施用于受试者，其中所述胶束包含能够有效改善受试者的认知功能的治疗剂。在一些方面，治疗剂是靶向mirna-485-3p的antimir(例如，seq id no:18的antimir或其片段或变体)，其中所述antimir可以降低受试者的mirna-485-3p的水平。
[0566]
在一些方面，与未用本公开的胶束治疗的受试者或受试者群体中观察到的认知功能相比，将本公开的胶束施用于患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的受试者可以增加受试者的认知功能至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％。
[0567]
viii.药盒
[0568]
本公开还提供了药盒或制造产品，所述药盒或制造产品包括本公开的阳离子载体单元、胶束或药物组合物和任选地使用说明。在一些方面，药盒或制造产品包括在一个或多个容器中的本公开的阳离子载体单元、胶束、或药物组合物。在一些方面，药盒或制造产品包括本公开的阳离子载体单元、胶束、或药物组合物以及小册子。在一些方面，药盒或制造产品包括本公开的阳离子载体单元、胶束或药物组合物以及使用说明。本领域的技术人员
将容易地认识到，本公开的阳离子载体单元、胶束或药物组合物，或它们的组合，可以容易地掺入本领域熟知的已建立的药盒形式之一中。
[0569]
在一些方面，药盒或制造产品包含在容器(例如，玻璃小瓶)中呈干燥形式的本公开的阳离子载体单元，以及任选地具有适合于水合干燥的阳离子载体单元的溶剂的小瓶，以及任选地关于阳离子载体单元的水合和胶束形成的说明。在一些方面，药盒或制造产品还包括至少一个另外的容器(例如，玻璃小瓶)，所述容器具有胶束的阴离子有效负载(例如，反义寡核苷酸)。在一些方面，药盒或制造产品在同一容器或不同容器中包含干燥形式的本公开的阳离子载体单元和同样干燥形式的胶束的阴离子有效负载。在一些方面，药盒或制造产品在同一容器或不同容器中包含在溶液中的本公开的阳离子载体单元和同样在溶液中的胶束的阴离子有效负载。在一些方面，药盒或制造产品包含在溶液中的本公开的胶束以及使用说明。在一些方面，药盒或制造产品包含干燥形式的本公开的胶束以及使用说明(例如，复原和施用的说明)。
[0570]
***
[0571]
除非另外指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术人员的技术之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术。文献中详尽地说明了此类技术。参见，例如，sambrook等人，编辑(1989)molecular cloning alaboratory manual(第2版，cold spring harbor laboratory press)；sambrook等人，编辑(1992)molecular cloning:a laboratory manual,(cold springs harbor laboratory,ny)；d.n.glover编辑，(1985)dna cloning，第i卷和第ii卷；gait，编辑(1984)oligonucleotide synthesis；mullis等人美国专利第4,683,195号；hames和higgins，编辑(1984)nucleic acid hybridization；hames和higgins，编辑(1984)transcription and translation；freshney(1987)culture of animal cells(alan r.liss,inc.)；immobilized cells and enzymes(irl press)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning；the treatise,methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)；miller和calos编辑(1987)gene transfer vectors for mammalian cells,(cold spring harbor laboratory)；wu等人，编辑，methods in enzymology，第154卷和第155卷；mayer和walker，编辑(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press,london)；weir和blackwell，编辑，(1986)handbook of experimental immunology，第i-iv卷；manipulating the mouse embryo,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,(1986)；)；crooke,antisense drug technology:principles,strategies and applications，第2版crc press(2007)以及在ausubel等人(1989)current protocols in molecular biology(john wiley和sons,baltimore,md.)中。
[0572]
上文引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献全文以引用的方式并入本文。
[0573]
以下实施例通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。
[0574]
实施例
[0575]
实施例1
[0576]
(a)炔改性酪氨酸的合成：生成炔改性酪氨酸作为合成阳离子载体单元的组织特
异性靶向部分(tm，参见图3)的中间体，以将本公开的胶束引导至bbb中的lat1转运蛋白。
[0577]
将n-(叔丁氧基羰基)-l-酪氨酸甲酯(boc-tyr-ome)(0.5g，1.69mmol)和k2co3(1.5当量，2.54mmol)在乙腈(4.0ml)中的混合物逐滴添加至炔丙基溴(1.2当量，2.03mmol)中。将反应混合物在60℃加热过夜。在反应后，使用水:乙酸乙酯(ea)萃取反应混合物。然后，使用盐水溶液洗涤有机层。通过快速柱(在己烷中的ea 10％)纯化粗物质。接着，将所得的产物溶解在1,4-二噁烷(1.0ml)和6.0m hcl(1.0ml)中。将反应混合物在100℃加热过夜。接下来，除去二噁烷并通过ea萃取。向混合物中添加naoh(0.5m)水溶液直至ph值变为7。反应物通过蒸发器浓缩并在0℃下以12,000rpm离心。沉淀物用去离子水洗涤并冻干。
[0578]
(b)聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸)(peg-pll)的合成：该合成步骤产生了本公开的阳离子载体单元的水溶性生物聚合物(wp)和阳离子载体(cc)(参见图3)。
[0579]
聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸)通过lys(tfa)-nca的开环聚合反应来合成，单甲氧基peg(meo-peg)作为大分子引发剂。简而言之，将meo-peg(600mg，0.12mmol)和lys(tfa)-nca(2574mg，9.6mmol)分别溶解在含有1m硫脲和dmf(或nmp)的dmf中。通过微注射器将lys(tfa)-nca溶液滴入meo-peg溶液中，并且将反应混合物在37℃下搅拌4天。反应瓶用氩气和真空吹扫。所有反应均在氩气气氛中进行。在反应后，将混合物沉淀到过量的乙醚中。将沉淀物重新溶解在甲醇中并且再次沉淀到冷乙醚中。然后过滤，真空干燥后得到白色粉末。对于peg-pll(tfa)中的tfa基团的脱保护，进行下一步。
[0580]
将meo-peg-pll(tfa)(500mg)溶解在甲醇(60ml)中，并且在搅拌下将1n naoh(6ml)滴入聚合物溶液中。将混合物在搅拌下在37℃下保持1天。将反应混合物对10mm hepes透析4次，并对蒸馏水透析。在冻干后得到peg-pll白色粉末。
[0581]
(b)叠氮基-聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸)(n
3-peg-pll)的合成：该合成步骤产生了本公开的阳离子载体单元的水溶性生物聚合物(wp)和阳离子载体(cc)(参见图3)。
[0582]
叠氮基-聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸)通过lys(tfa)-nca与叠氮基-peg(n
3-peg)的开环聚合反应来合成。简而言之，将n
3-peg(300mg，0.06mmol)和lys(tfa)-nca(1287mg，4.8mmol)分别溶解在含有1m硫脲和dmf(或nmp)的dmf中。通过微注射器将lys(tfa)-nca溶液滴入n
3-peg溶液中，并且将反应混合物在37℃下搅拌4天。反应瓶用氩气和真空吹扫。所有反应均在氩气气氛中进行。在反应后，将混合物沉淀到过量的乙醚中。将沉淀物重新溶解在甲醇中并且再次沉淀到冷乙醚中。然后过滤，真空干燥后得到白色粉末。对于peg-pll(tfa)中的tfa基团的脱保护，进行下一步。
[0583]
将n
3-peg-pll(500mg)溶解在甲醇(60ml)中，并且在搅拌下将1n naoh(6ml)滴入聚合物溶液中。将混合物在搅拌下在37℃下保持1天。将反应混合物对10mm hepes透析4次，并对蒸馏水透析。在冻干后得到n
3-peg-pll白色粉末。
[0584]
(c)(甲氧基或)叠氮基-聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸/烟酰胺/巯基丙酰胺)(n
3-peg-pll(nic/sh))的合成：在该步骤中，组织特异性佐剂部分(am，参见图3)连接至本公开的阳离子载体单元的wp-cc组分。用于阳离子载体单元的组织特异性佐剂部分(am)是烟酰胺(维生素b3)。该步骤将产生图3中描绘的阳离子载体单元的wp-cc-am组分。
[0585]
叠氮基-聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸/烟酰胺/巯基丙酰胺)(n
3-peg-pll(nic/sh))在存在edc/nhs的情况下通过n
3-peg-pll和烟酸的化学修饰来合成。将n
3-peg-pll(372mg，25.8μmol)和烟酸(556.7mg，1.02当量peg-pll的nh2)分别溶解于去离子水和甲醇
(1:1)的混合物中。将edc
·
hcl(556.7mg，1.5当量n
3-peg-pll的nh2)添加至烟酸溶液中，并且将nhs(334.2mg，1.5当量peg-pll的nh2)逐步添加至混合物中。
[0586]
将反应混合物添加至n
3-peg-pll溶液中。将反应混合物在搅拌下在37℃下保持16小时。在16小时后，将3,3'-二硫代二丙酸(36.8mg，0.1当量)溶解于甲醇中，将edc
·
hcl(40.3mg，0.15当量)和nhs(24.2mg，0.15当量)分别溶解于去离子水中。然后，将nhs和edc
·
hcl添加至3,3'-二硫代二丙酸溶液中。在添加粗n
3-peg-pll(nic)溶液后，将混合物溶液在37℃下搅拌4小时。
[0587]
对于纯化，将混合物对甲醇透析2小时，添加dl-二硫苏糖醇(dtt，40.6mg，0.15当量)，然后活化30分钟。
[0588]
对于除去dtt，将混合物依次对甲醇、去离子水中的50％甲醇、去离子水透析。
[0589]
(d)苯丙氨酸-聚(乙二醇)-b-聚(l-赖氨酸/烟酰胺/巯基丙酰胺)(phe-peg-pll(nic/sh))的合成：在该步骤中，组织特异性靶向部分(tm)连接至上一步合成的wp-cc-am组分。通过步骤(a)中产生的中间体与步骤(c)的产物的反应产生tm组分(苯丙氨酸)。
[0590]
为了靶向血管中的脑内皮组织，作为lat1靶向氨基酸，在铜催化剂存在下，通过n
3-peg-pll(nic/sh)和炔烃改性酪氨酸之间的点击反应来引入苯丙氨酸。简而言之，将n
3-peg-pll(nic/sh)(130mg，6.5μmol)和炔烃改性苯丙氨酸(5.7mg，4.0当量)溶解于去离子水(或50mm磷酸钠缓冲液)中。然后，将cuso4
·
h2o(0.4mg，25mol％)和三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta，3.4mg，1.2当量)溶解于去离子水中，并且添加n
3-peg-pll(nic/sh)溶液。然后，将抗坏血酸钠(3.2mg，2.5当量)添加至混合物溶液中。反应混合物在室温下保持搅拌16小时。在反应后，将混合物转移到透析膜(mwco＝7,000)中，并且对去离子水透析1天。在冻干后获得最终产物。图4显示了载体单元的1h-nmr表征。
[0591]
实施例2
[0592]
聚离子复合物(pic)胶束制备
[0593]
一旦如实施例1中所述产生本公开的阳离子载体单元，即产生胶束。本实施例中描述的胶束包含与反义寡核苷酸有效负载组合的阳离子载体单元。
[0594]
通过混合meo-或phe-peg-pll(nic)和mirna来制备纳米尺寸的pic胶束。peg-pll(nic)以0.5mg/ml的浓度溶解于hepes缓冲液(10mm)中。然后将在无rna酶水中的mirna溶液(22.5μm)与聚合物溶液以2:1(v/v)的mirna与聚合物的比率混合。
[0595]
聚合物与抗mirna的混合比，即聚合物(本公开的载体)中的胺与抗mirna(有效负载)中的磷酸之间的比率，通过优化胶束形成条件来确定。聚合物(载体)和抗mirna(有效负载)的混合物通过3000rpm的多涡旋剧烈混合90秒，并且在室温下保持30分钟以稳定胶束。
[0596]
粒度分布和散射光强度(sli)由zeta-sizer测量，波长为634nm。图9显示了在pbs中的负载有mirna的聚离子复合胶束的粒度分布。负载有抗mirna的胶束显示出《60nm的粒度，以及低pdi分布，这表明复合物是同质颗粒。如图9所示，分布的峰值在32纳米处。
[0597]
胶束(10μm抗mirna浓度)在使用前储存在4℃下。meo-或phe-胶束使用相同的方法制备，并且另外在胶束制备过程中通过混合两种聚合物制备不同量的含phe胶束(25％～75％)。
[0598]
实施例3
[0599]
使用lat1和苯丙氨酸来靶向脑
[0600]
选择lat1作为驱动本公开的胶束跨过bbb的靶分子。如图10所示，在人体中，lat1优先地在脑中表达。图11显示了在小鼠中lat1也优先地在脑组织中表达。
[0601]
为了研究使用lat1蛋白跨过血脑屏障的可能性，将cy 5.5染料或cy 5.5标记的苯丙氨酸施用于小鼠(n＝3)的脑室内，并在注射1小时后分析脑裂解物的荧光强度。对于测量，cy 5.5通过与炔烃改性酪氨酸和n
3-cy 5.5的点击反应来标记。
[0602]
cy 5.5标记的苯丙氨酸或n
3-cy 5.5(20μg cy5.5浓度)分别通过脑室内注射施用，并且还注射相同体积的pbs作为对照。在注射后一小时，处死所有小鼠(n＝3)并用5ml pbs洗涤剩余的血液以进行灌注。使用探针型超声仪提取小鼠脑并用裂解缓冲液匀浆。将裂解物样品转移到96孔板中，并通过ex/em＝650/690的多板读取器测量荧光强度。
[0603]
靶向脑的荧光(cy5.5)标记的载体单元确实能够与在脑实质中表达的lat1结合，并且显示出比非靶向cy5.5分子更高的积聚水平。参见图12。
[0604]
与非靶向胶束相比，靶向lat1的负载有抗mirna的聚离子复合胶束(即，本公开的胶束)能够跨过bbb并且在脑中显著积聚。
[0605]
实施例4
[0606]
本公开的胶束的体内稳定性
[0607]
通过测量全身注射胶束后的血液循环行为来评估本文公开的胶束的体内稳定性。将cy5.5标记的负载有mirna胶束和裸cy 5.5标记的mirna(20μg mirna浓度)全身注射到小鼠体内，并在所需时间从尾静脉采集120μl血液。将血样以2,500rpm离心，将上清血浆样品转移到96孔板中。血浆的剩余荧光强度通过ex/em＝650/690的多板读取器进行分析。
[0608]
抗微rna有效负载包封在本公开的胶束中导致稳定性增加。参见图8。在对照条件下，抗微rna(antimir)的血浆半衰期小于5分钟。然而，在本公开的胶束中掺入抗mirna后，血浆半衰期增加至80-120分钟。胶束的稳定性不受不同抗mirna负载的影响。载体单元不含antimir的胶束是稳定的，因为那些胶束的25％或50％的载体单元与antimir复合。
[0609]
实施例5
[0610]
阿尔茨海默氏病模型的实验
[0611]
(i)材料和方法
[0612]
(a)小鼠：5xfad app转基因小鼠(库存编号：34840-jax)购自杰克逊实验室。研究中使用tg和年龄匹配的野生型(wt)同窝仔。所有动物都被单独关在笼子里，以12/12小时的光照/黑暗循环，控制温度和湿度、食物和水饲养。5xfad小鼠，也称为app/ps1、tg6799或tg-5xfad，是阿尔茨海默氏病的动物模型系统。5xfad小鼠表达人类app和psen1转基因，共有五个ad相关突变：app中的瑞典(k670n/m671l)、佛罗里达(i716v)和伦敦(v717i)突变，以及psen1中的m146l和l286v突变。最初产生三个品系：tg6799、tg7031和tg7092。tg6799品系表达最高水平的突变app，是三个中研究得最多的。这些广泛使用的小鼠重现了很多ad相关表型，并且具有相对早期和侵袭性表现。
[0613]
淀粉样斑块伴随神经胶质增生出现在两月龄的小鼠中。雌性的淀粉样蛋白病理比雄性更严重。神经元丧失发生在多个脑区域，从约6个月的淀粉样变性最明显的区域开始。小鼠表现出一系列认知和运动缺陷。
[0614]
携带三个人类转基因app(swe)、ps1(m146v)和tau(p301l)的3xtg-ad小鼠购自杰克逊实验室。3xtg-ad小鼠在c57bl6/129svj杂合体背景下产生。小鼠每笼饲养4-5只，保持
12小时的光照/黑暗循环，并且随意获取食物和水。过度表达的转基因的翻译似乎仅限于中枢神经系统，特别是在阿尔茨海默氏病相关区域，包括海马和大脑皮层。该小鼠品系的初步特征表明淀粉样蛋白β肽沉积逐渐增加，早在3-4个月就在某些脑区域检测到细胞内免疫反应性。6月龄小鼠的突触传递和长时程增强明显受损。在12-15个月之间，在海马体中检测到构象改变和过度磷酸化的tau聚集体。这种突变小鼠表现出与突触功能障碍相关的斑块和缠结病理，这些性状类似于在阿尔茨海默氏病患者中观察到的性状。
[0615]
(b)aso-mds治疗(静脉内注射)：对于静脉内(iv)注射，制备本公开的胶束(aso-mds)或阴性对照(仅mir和仅胶束)中的mir-485-3pantagomir(antimir)。8月龄5xfad小鼠的所有治疗都通过在第7、14、21和28天静脉内注射1.5mg/kg aso-mds来实现。参见图17。
[0616]
(c)免疫组织化学：对于免疫组织化学，移除脑，进行后固定并包埋于石蜡中。使用切片机切割穿过梗塞的冠状切片(10-μm厚)并安装在载玻片上。移除石蜡，用pbs-t洗涤切片，用10％牛血清白蛋白封闭2小时。其后，施用以下一抗：兔抗β淀粉样蛋白(1-42)(cell signaling technology,cat#14974)、小鼠抗gfap(merck,cat#mab360)、兔抗il-1β(abcam,cat#9722)、小鼠抗tnf-a(santa cruz,cat#sc-52746)抗肌动蛋白(santa cruz,cat#sc-47778)。在行为测试后，从h/i小鼠身上解剖海马区和皮层区，并将脑组织在含有蛋白酶抑制剂的冰冷ripa缓冲液中匀浆。使匀浆物在4℃下以12,000rpm离心30分钟，收集上清液。使用增强化学发光系统使结果可视化，并通过光密度分析(image j软件，nih)进行定量。所有实验至少独立进行三次。
[0617]
(d)行为测试(y-迷宫和被动回避)：y迷宫由三个彼此成120
°
的黑色不透明塑料臂(30cm
×
8cm
×
15cm)组成。5xfad小鼠放置在中心，并被允许探索所有三个臂。记录臂进入的次数和试验次数(移动次数的标准是距中心10cm，进入三个独立的臂。)以计算交替百分比。进入被定义为进入y迷宫臂的全部三个耳。交替行为被定义为三项的数量除以臂进入的数量减去2再乘以100。被动回避室分为白色(光照)和黑色(黑暗)隔室(41cm
×
21cm
×
30cm)。光照隔室装有一盏60w电灯。(黑暗)隔室的地板包含很多(2mm)不锈钢棒，间距为5mm。测试进行3天。
[0618]
第一天，允许小鼠在光照区适应5分钟。第二天是由2个步骤组成的训练阶段。第一步，将每只小鼠放置于光照区并移至黑暗区两次。在第一步后一小时，将每只小鼠放置于光照隔室中。在30秒后，打开分隔两个隔室的门。一旦小鼠进入黑暗隔室，门就会关闭，电脚电击(0.3ma/10g)通过网格地板传递3秒。如果小鼠超过5分钟未进入黑暗区，则认为已经学会，最多进行5次训练。在训练试验后二十四小时，将小鼠放置于光照室中进行测试。延迟被定义为分隔两个隔室的门打开后，小鼠进入黑暗室所需的时间。小鼠进入黑暗区和退出光照区所需的时间被定义为tdc(在黑暗隔室中消耗的时间)。
[0619]
(e)数据分析：所有数据均表示为平均值
±
sd。使用prism 8进行事后比较(student-newman-keuls检验)。行为测试通过非参数统计程序进行评估。通过mann-whitney u检验分析三个组(对照(仅mir和仅胶束)与hi-485-3p)的比较。
[0620]
(ii)结果
[0621]
mirna-485-3p可以在阿尔茨海默氏病患者中升高，导致例如炎症、线粒体功能变化和细胞凋亡。参见图23。因此，将负载有靶向mirna-485-3p的antimir的本公开的胶束施用于阿尔茨海默氏病的小鼠模型。这些包含抗mir-485-3p的胶束在图中和本技术全文中称
5.5标记的负载有抗微rna的胶束(aso-mds)。移除培养基，用pbs洗涤两次，每孔添加100μl pbs。使用具有ex 650/em 690波长的微孔板读板器测量细胞的剩余荧光强度。
[0637]
靶标胶束处理的细胞的剩余荧光强度比非靶胶束细胞的荧光强度高大约3倍，这表明当aso-mds胶束靶向lat1时，cy5.5标记的抗微rna的摄取有所增加。
[0638]
当用lat1抑制剂对靶向或非靶向aso-mds处理的细胞进行预孵育时，cy5.5标记的抗微rna的细胞摄取无显著差异(图14)。这表明，当lat1被苯丙氨酸抑制时，aso-mds胶束靶向lat1不足以增加细胞对cy5.5标记的抗微rna的摄取。换句话说，lat1介导的对包封在本公开的胶束中的有效负载的摄取取决于lat1的功能状态，其中所述胶束靶向lat1。
[0639]
实施例9
[0640]
负载有抗微rna的胶束的生物分布
[0641]
使用ivis活体动物成像台测量抗微rna的生物分布。为了比较裸抗微rna和负载有抗微rna的胶束(aso-mds)的抗微rna分布的时间依赖性差异，通过尾静脉内注射将两种样品(25μg的rna浓度)施用于小鼠。使用ivis活体动物成像台在所需时间获得小鼠的荧光图像，并观察16小时。
[0642]
用裸抗微rna治疗的小鼠的剩余荧光强度显示快速定位到肾中，信号在4小时内几乎消失。对于负载有抗微rna的胶束(aso-mds)，荧光强度主要定位于脑、肝和肾。肾中的荧光逐渐增加，直到6小时，并随时间推移而减少。这些结果表明，由于分子的小尺寸，裸抗微rna通过尿液迅速(在4小时内)清除。在另一个方面，负载有抗微rna的胶束(aso-mds)显示出循环延长并且在脑部位积聚直到16小时，剩余的抗微rna通过尿液清除。参见图15。
[0643]
实施例10
[0644]
体外吞噬作用测定(elisa和免疫细胞化学)
[0645]
将原代混合神经胶质细胞(2
×
105个细胞)或人类原代小胶质细胞(2
×
105个细胞)在6孔板中涂铺过夜。细胞用aso-mds和faβ处理4小时，最终浓度为1μm。根据制造商的说明，使用人类aβ42elisa试剂盒(invitrogen,cat#khb3441)来测量上清液中的人类aβ(1-42)的水平。
[0646]
此外，荧光显微镜证实了人类原代小胶质细胞的吞噬作用。盖玻片用8
×
104个人类原代小胶质细胞/盖玻片来涂铺，放置在24孔板的孔中过夜。人类原代小胶质细胞用aso-mds处理，并且与未标记的faβ一起孵育4小时，最终浓度为1μm。在4小时后，用冷pbs洗涤细胞。对于aβ摄取测量，然后将原代神经胶质细胞用100％甲醇在-20℃下固定1小时，用pbs-t洗涤，并在4℃下用小鼠抗淀粉样蛋白β1-16或兔抗iba-1抗体孵育。
[0647]
为了评估aso-mds在神经胶质细胞中的吞噬作用，通过在37℃下孵育aβ单体(100μm)24小时，然后用细胞培养基稀释肽储液来制备aβ聚集体。原代混合神经胶质细胞用aso-mds处理，并用1μm纤维状aβ(faβ)共处理4小时。与对照经转染的细胞相比，在aso-mds转染细胞中，条件培养基中的aβ水平逐渐降低。参见图18a。
[0648]
与上述结果一致，aso-mds剂量依赖性地增加了人类原代小胶质细胞摄取aβ的能力。参见图18b。
[0649]
这些结果表明，aso-mds增强了神经胶质细胞中的aβ吞噬作用。为了进一步探索神经胶质细胞的作用，我们使用iba1和6e10抗体进行免疫细胞计量分析，以共定位人类小胶质细胞和aβ斑块。免疫细胞计量学显示，在aso-mds处理的人类原代小胶质细胞中，神经胶
质细胞中的aβ表达显著升高。参见图18c。
[0650]
实施例11
[0651]
负载有抗微rna的胶束的生物分布
[0652]
使用ivis活体动物成像台测量抗微rna的生物分布。为了比较裸rna和负载有rna的胶束(aso-mds)之间的时间依赖性抗微rna分布，通过肌内注射将两种样品(10μg的rna浓度)施用于小鼠。使用ivis活体动物成像台在所需时间获得小鼠的荧光图像，并观察直到120小时。
[0653]
裸抗微rna的剩余荧光强度显示快速定位到肾中，信号在6小时内几乎消失。就负载有抗微rna的胶束(aso-mds)而言，荧光强度主要定位于骨骼肌部位。这些结果表明，由于分子的小尺寸，裸rna在6小时内通过尿液迅速清除。在另一个方面，负载有抗微rna的胶束在注射部位显示出持续的荧光强度，并且在淋巴结处部分增加了荧光行为，这表明抗微rna从负载有抗微rna的胶束持续释放。
[0654]
参见图27
[0655]
***
[0656]
应当理解，具体实施方式部分，而不是发明内容和摘要部分，旨在用于解释权利要求。发明内容和说明书摘要部分可以阐明如发明人所构想的本发明的一个或多个但非所有的示例性方面，并且因此，并不意图通过任何方式对本公开和所附权利要求书进行限制。
[0657]
上面已经借助于说明指定功能的实现及其关系的功能构建块描述了本公开。为了描述的方便，这些功能构建块的边界在本文中被任意界定。只要适当地执行指定的功能及其关系，就可以界定替代边界。
[0658]
特定实施方案的前述描述将如此充分地揭示本公开的一般性质，以至于在不脱离本公开的一般概念的情况下，其他人可以通过应用本领域的技术人员的知识而容易地修改和/或改编此类特定实施方案的各种应用，而无需过度实验。因此，基于本文所呈现的教导内容以及指导内容，此类改编以及修改意图在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语目的在于说明而非限制，因此技术人员将会根据教导内容以及指导内容来对本说明书的术语或措词进行解释。
[0659]
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。
再多了解一些
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