一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法

1.本发明涉及雾霾颗粒物(pm
2.5
)毒性评价技术领域，具体涉及一种通过改变pm
2.5
的电荷及尺寸来鉴定pm
2.5
引发肺部慢性纤维化毒性来源的方法。


背景技术：

2.相当大的人类健康负担可归因于环境污染，包括空气、水、土壤、重金属和化学污染，其中空气污染是最主要的原因。空气中细颗粒物(pm
2.5
,动力学直径《2.5μm)，作为大气污染的主要成分之一，由于其能深入呼吸道，对肺部产生不良影响，在毒理学特性方面受到广泛关注。越来越多的证据表明，pm
2.5
可引起哮喘、慢性阻塞性肺疾病(copd)等一系列呼吸系统疾病，导致肺部炎症和纤维化。pm
2.5
的多种物理化学性质有可能是引起的毒性效应的来源，然而目前没有有效的方法能够确定这些毒性效应与理化性质的关联性。因此，开发有效的鉴定方法来确定pm
2.5
引发毒性的理化性质来源对于未来建立有效的人体健康防护手段有着重要意义。


技术实现要素：

3.本发明提高一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法，通过改造pm
2.5
的物理化学性质(电荷和尺寸)，评价其对于肺部慢性纤维化的影响，鉴定pm
2.5
的物理化学性质是否为其毒性来源。
4.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
5.一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法，包括以下步骤：
6.步骤一：获取pm
2.5
颗粒；
7.步骤二：对步骤一的pm
2.5
颗粒的物理化性质进行改造，所述的物理化性质包括pm
2.5
颗粒的电荷或尺寸，得到
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
；
8.步骤三：用
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
处理不同分化的thp-1细胞，采用elisa法检测il-1β的释放，鉴定炎性体的激活状态；
9.步骤四：通过口咽法使得小鼠吸入
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
，并进行massion染色，鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒物对肺部纤维化的影响。
10.优选的是，所述的步骤二中对pm
2.5
颗粒的电荷进行改造，具体包括：
11.将pm
2.5
水悬浮液与聚赖氨酸混合搅拌，得到的混合物离心，以去除多余的pll，将沉淀物冻干，保存，得到电荷改变后的
neutral
pm
2.5
。
12.优选的是，所述的pm
2.5
水悬浮液的浓度为250μg ml-1
，聚赖氨酸的浓度为2.5μg ml-1
。
13.优选的是，所述的pm
2.5
水悬浮液与聚赖氨酸的体积比为4:1。
14.优选的是，所述的步骤二中对pm
2.5
颗粒的尺寸进行改造，具体包括：
15.将pm
2.5
水悬浮液与pluronic f108(pf108)溶液混合，并在水浴中超声，然后，将悬浮液离心，以去除多余的pf108，将沉淀冻干，保存，得到尺寸改变后的
size
pm
2.5
。
16.优选的是，所述的pm
2.5
水悬浮液的浓度为1mg ml-1
，pluronic f108溶液的浓度为375μg ml-1
。
17.优选的是，所述的pm
2.5
水悬浮液与pluronic f108(pf108)溶液的体积比为1:4。
18.优选的是，所述的超声温度为25℃，超声时间为30-60min。
19.优选的是，所述的步骤三具体为：
20.步骤1、细胞培养：
21.thp-1细胞培养在包含10％的胎牛血清、100u ml-1
的青霉素和100mg ml-1
链霉素的rpmi1640培养基中，其培养条件是37℃和5％的co2且每隔一天更换培养基一次；
22.步骤2、elisa检测il-1β的释放：
23.将thp-1细胞以每孔3
×
104个细胞的密度，置于96孔板中，用100μl细胞培养基孵育16h，培养基中含有1μg ml-1
佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(pma)诱导thp-1细胞分化，然后，用
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
处理不同分化的thp-1细胞，在脂多糖(lps,10ng ml-1
)的存在下再处理24小时，收集细胞上清，采用elisa法检测il-1β。
24.优选的是，所述的步骤四具体为：
25.将8周龄雌性balb/c小鼠在标准的实验室条件下培养，动物暴露于pm
2.5
是通过niosh描述的口咽抽吸法进行的，50μl pbs包含400μg ml-1neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
被滴在小鼠的舌头后方，捏住鼻腔让其进入肺部，21天后处死小鼠，并收集肺组织，进行masson染色。
26.本发明的有益效果
27.本发明提供一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法，pm
2.5
具有高的负电荷和大的聚集尺寸，0.1％的聚l-赖氨酸作为一种带正电荷的聚合物，对带负电荷的底物具有良好的生物相容性和高亲和力，本发明采用聚l-赖氨酸来中和pm
2.5
中的负电荷获得电荷接近中性的雾霾颗粒物
neutral
pm
2.5
。此外，pf108是由两个亲水的聚环氧乙烷(peo)链和一个分散的疏水的聚环氧丙烷(ppo)结构域组成的非离子型三嵌段共聚物，由于其两亲性和空间位阻效应，可以起到很好的分散作用，因此本发明选择了pluronic f108(pf108)作为分散剂促进pm
2.5
的分散，获得尺寸很小的雾霾颗粒物
size
pm
2.5
，通过对pm
2.5
物化性质的改造，来评价pm
2.5
的物化性质对巨噬细胞(如thp-1细胞)nlrp3炎性体激活和对小鼠肺部纤维化的形成的影响，由此鉴定物理化学性质(电荷和尺寸)是否为肺部慢性纤维化的来源。
28.实验结果表明：通过与巨噬细胞孵育并经酶联免疫反应检测确定，相比于未改造pm
2.5
(负电荷)，
neutral
pm
2.5
能够使得细胞白介素1β的释放水平显著提高，表明其激活炎性体的能力增强；而
size
pm
2.5
使得细胞白介素1β的释放水平降低，表明其激活炎性体的能力降低。进一步通过口咽法使得小鼠吸入改造或未改造雾霾颗粒物，在21天后收集肺组织并进行massion染色，发现
neutral
pm
2.5
导致更为严重的肺部纤维化水平，而
size
pm
2.5
减弱了这一纤维化水平，本发明通过对雾霾颗粒物理化性质的改造前后毒性水平的比较，鉴定了pm
2.5
引发肺部慢性纤维化的来源，pm
2.5
毒性理化性质来源的鉴定对于建立有效的人体健康防护措施以及慢性疾病的治疗有着重要的指导意义。
附图说明
29.图1为pm
2.5
的sem(a)和tem(b)表征照片；
30.图2为pm
2.5
的粒径分析图；
31.图3为pm
2.5
经pll改造前后电荷和粒径变化柱状图；
32.图4为pm
2.5
经pf108改造前后粒径变化曲线；
33.图5为pm
2.5
、
neutral
pm
2.5
和
positive
pm
2.5
所诱导的il-1β的产生柱状图；
34.图6为pm
2.5
和
size
pm
2.5
所诱导的il-1β的产生柱状图；
35.图7为pm
2.5
、
neutral
pm
2.5
和
size
pm
2.5
所诱导的小鼠肺部纤维化的形成照片。
具体实施方式
36.一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法，包括以下步骤：
37.步骤一：获取pm
2.5
颗粒；
38.步骤二：对步骤一的pm
2.5
颗粒的物理化性质进行改造，所述的物理化性质包括pm
2.5
颗粒的电荷或尺寸，得到
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
；
39.步骤三：用
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
处理不同分化的thp-1细胞，采用elisa法检测il-1β的释放，鉴定炎性体的激活状态；
40.步骤四：通过口咽法使得小鼠吸入
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
，并进行massion染色，鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒物对肺部纤维化的影响。
41.按照本发明，所述的pm
2.5
的获取，具体为：
42.采用anderson g1200采样器在硝酸纤维素过滤膜上以16.7l min-1
的流速采集pm
2.5
。采样器设置在约20m高的建筑屋顶上，通过刮刀小心地从滤膜上刮取pm
2.5
颗粒。
43.按照本发明，所述的步骤二中pm
2.5
颗粒的物理化性质进行改造包括对pm
2.5
颗粒的电荷或者尺寸进行改造，所述的pm
2.5
电荷的改造，具体包括：
44.将pm
2.5
水悬浮液与聚赖氨酸(pll)混合搅拌，所述的搅拌时间优选为30-60min，得到的混合物离心，所述的离心速率优选为10000-12000rpm，时间优选为20-60min，以去除多余的pll，将沉淀物冻干，保存，得到电荷改变后的
neutral
pm
2.5
。所述的pm
2.5
水悬浮液的浓度优选为250μg ml-1
，聚赖氨酸的浓度优选为2.5μg ml-1
，所述的pm
2.5
水悬浮液与聚赖氨酸的体积比优选为4:1。
45.本发明通过控制l-赖氨酸的浓度，逐步中和pm
2.5
的负电荷(-31.5mv)，获得电荷接近中性(-2.9mv)的雾霾细颗粒物(
neutral
pm
2.5
)。
46.按照本发明，所述的对pm
2.5
颗粒的尺寸进行改造，具体包括：
47.将pm
2.5
水悬浮液与pluronic f108(pf108)溶液混合，并在水浴中超声，所述的超声温度为25℃，超声时间优选为30-60min，然后，将悬浮液离心，所述的离心是在10000-32000g离心30-60min，以去除多余的pf108，将沉淀冻干，保存，得到尺寸改变后的
size
pm
2.5
。所述的pm
2.5
水悬浮液的浓度优选为1mg ml-1
，pluronic f108溶液的浓度优选为375μg ml-1
，所述的pm
2.5
水悬浮液与pluronic f108(pf108)溶液的体积比优选为1:4。
48.按照本发明，通过pluronic f108分散pm
2.5
，使得尺寸从849.5nm降为448.3nm,获得小尺寸的雾霾细颗粒物(
size
pm
2.5
)。
49.按照本发明，所述的步骤三具体为：
50.步骤1、细胞培养：
51.thp-1细胞培养在包含10％的胎牛血清、100u ml-1
的青霉素和100mg ml-1
链霉素的rpmi1640培养基中，其培养条件是37℃和5％的co2且每隔一天更换一次培养基；
52.步骤2、elisa检测il-1β的释放：
53.将thp-1细胞以每孔3
×
104个细胞的密度，置于96孔板中，用100μl细胞培养基孵育16h，培养基中含有1μg ml-1
佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(pma)诱导thp-1细胞分化，然后，用
neutral
pm
2.5
，
size
pm
2.5
处理不同分化的thp-1细胞，在脂多糖(lps,10ng ml-1
)的存在下再处理24小时，收集pm
2.5
暴露的细胞上清，采用elisa法检测il-1β。
54.按照本发明，所述的步骤四具体为：
55.8周龄雌性balb/c小鼠购于北京维通利华动物科技有限公司，所有的动物都在标准的实验室条件下培养，动物暴露于pm
2.5
是通过niosh描述的口咽抽吸法进行的，50μl pbs含有400μg ml-1neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
被滴在小鼠的舌头后方，捏住鼻腔让其进入肺部，21天后处死小鼠，收集肺组织，进行masson染色。
56.下面结合附图对本发明做以详细说明。
57.实施例1
58.一种鉴定改变物理化性质后的雾霾颗粒毒性及对肺部纤维化影响的方法，具体步骤如下：
59.1.pm
2.5
的获取：
60.在中国长春，采用anderson g1200采样器在硝酸纤维素过滤膜上以16.7lmin-1的流速采集pm
2.5
。采样器设置在约20m高的建筑屋顶上，该建筑被认为是一个集住宅、交通、建筑和工业为一体的代表性区域。通过刮刀小心地从滤膜上刮取pm
2.5
颗粒，并通过sem(图1a)、tem(图1b)和dls对pm2.5的物化性质进行表征，如图1和图2所示。
61.2.pm
2.5
的电荷改造
62.将4ml 250μg ml-1
pm
2.5
水悬浮液(电荷：-31.5mv)与1ml 2.5μg ml-1
聚赖氨酸(pll)混合搅拌30min。得到的混合物在12000rpm离心20min，以去除多余的pll。将沉淀冻干，4℃保存。这个样本被命名为
neutral
pm
2.5
(电荷：-2.9mv)类似地，1ml 100μg ml-1
pll用于制备具有阳性电荷的雾霾颗粒物，命名为
positive
pm
2.5
(电荷： 29.8mv)，经pll改造前后电荷(图3a)和粒径(图3b)变化如图3所示。
63.3.pm
2.5
中颗粒物的分散
64.将11.6ml 1mg ml-1
pm
2.5
水悬浮液(尺寸：849.5nm)与46.4ml 375μg ml-1
pluronic f108(pf108)溶液混合，并在水浴中超声30min。然后，将悬浮液在32000g离心30min，以去除多余的pf108。将沉淀冻干，4℃保存。这个示例被命名为
size
pm
2.5
(尺寸：448.3nm)，其颗粒物分散效果如图4。
65.4.细胞培养：
66.thp-1细胞培养在包含10％的胎牛血清和100u ml-1的青霉素和100mg ml-1
链霉素的rpmi1640培养基中。其培养条件是37℃和5％的co2且每隔一天更换培养基一次。
67.5.elisa检测il-1β的释放：
68.将thp-1细胞以每孔3
×
104个细胞的密度，置于96孔板中，用100μl细胞培养基孵
育16h。培养基中含有1μg ml-1
的佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(pma)诱导thp-1细胞分化。然后，用
neutral
pm
2.5
、
size
pm
2.5
和pm
2.5
处理不同分化的thp-1细胞，在脂多糖(lps,10ng ml-1
)的存在下再处理24小时。收集pm
2.5
暴露的细胞上清，采用elisa法检测il-1β，探究其对il-1β释放的影响。如图5和图6所示，当显著性差异p《0.05时，被认为显著降低或升高了pm
2.5
的炎性体激活能力，图5和6说明，相比于未改造pm
2.5
(负电荷)，
neutral
pm
2.5
能够使得细胞白介素1β的释放水平显著提高，表明其激活炎性体的能力增强；而
size
pm
2.5
使得细胞白介素1β的释放水平降低，表明其激活炎性体的能力降低。
69.6.masson染色检测小鼠肺部纤维化的形成：
70.8周龄雌性balb/c小鼠购于北京维通利华动物科技有限公司，所有的动物都在标准的实验室条件下培养。动物暴露于pm
2.5
是通过niosh描述的口咽抽吸法进行的，50μlpbs含有400μg ml-1
pm
2.5
、
neutral
pm
2.5
或
size
pm
2.5
被滴在小鼠的舌头后方，捏住鼻腔让其进入肺部。21天后处死小鼠，收集肺组织，进行masson染色。如图7所示，小鼠经
neutral
pm
2.5
暴露后的肺部纤维化水平被认定为桥接窦周纤维化，经
size
pm
2.5
暴露后的肺部纤维化水平被认定为窦周纤维化，经pm
2.5
暴露后的肺部纤维化水平被认定为门静脉窦周纤维化，说明
neutral
pm
2.5
导致更为严重的肺部纤维化水平，而
size
pm
2.5
减弱了这一纤维化水平。