一种镇痛药物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种镇痛药物及其应用。


背景技术：

2.疼痛是机体受到损伤时发生的一种不愉快的感觉和情绪性的体验，是一组复杂的病理、生理改变的临床表现，疼痛可以是局部的，也可以是全身性疾病的反映，人们把具有以上“疼痛”为主要症状的疾病总称为“痛症”。目前阿片类镇痛药与非甾体类抗炎药都是经典临床镇痛药，用于疼痛治疗的历史悠久。但其临床应用也存在了许多的缺陷和不足，不良反应也是令人生畏。如一些临床用于术后、创伤、癌症等所产生的重度疼痛的强阿片类镇痛药，在临床应用中容易产生依赖性，并且会产生一定程度的耐受性，一旦出现精神依赖性又将给临床用药带来新的更大的问题。
3.神经毒素(neurotoxin，nt)是蛇毒中一类重要的活性组分，主要分布在眼镜蛇科和海蛇科及蝰科的响尾蛇蛇毒中。纯化的微量眼镜蛇毒神经毒素具有类似吗啡的中枢镇痛作用，用于顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛的镇痛治疗。nt的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为效价高、持续时间长、无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。研究表明，nt的含量以眼镜蛇毒中含量较高，从眼镜蛇毒中分离出的nt具有长短链两种，其中以短链nt镇痛效果更好。
4.科博肽是从眼镜蛇蛇毒中分离提纯的低分子多肽，其化学名为蛇毒神经毒素。眼镜蛇毒神经毒素与n型乙酰胆碱受体有高度亲和力，能阻止神经肌肉接头神经冲动信号的传递。影响脑内乙酰胆碱的代谢，并能提高人、鼠脑内脑啡肽含量，产生镇痛作用。科博肽在临床上主要用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛、三叉神经痛、麻风反应神经痛等慢性疼痛的治疗，长期临床使用表明，科博肽具有良好的镇痛效果，具有无成瘾性、无耐受性，镇痛作用持久，对停药或禁戒海洛因后出现的各种生理和精神依赖症状均有一定疗效，应用范围广，尤其适用于慢性、顽固性、持续性疼痛治疗，出现疗效后可减量维持。但以科博肽为代表的眼镜蛇蛇毒，具有一定的毒性，在使用时需要严格控制剂量来控制毒性。
5.并且目前科博肽中存在多种不同成分，在未分离鉴别其中各种成分在使用时效果不佳，因此，将科博肽中不同成分分离后重新配组，以得到一种镇痛效果好，副作用小，并且可以根据需要调整具体配比的蛇毒神经毒素类镇痛药物，是目前需要解决的问题。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供蛇毒神经毒素及应用，具体是通过以下技术方案得以实现的：
7.一种镇痛药物，由如下三种蛇毒神经毒素组成：
8.p1：蛋白氨基酸序列为lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkngieinccttdrcnn的蛇毒神经毒素；
9.p2：蛋白氨基酸序列为lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrterg
cgcpsvkd(iso)gi einccttdrc nn的蛇毒神经毒素；
10.p3：蛋白氨基酸序列为lechnqqssq tptttgcsgg etncykkrwrdhrgyrterg cgcpsvkdgi einccttdrc nn的蛇毒神经毒素。
11.进一步的，如权利要求1所述的镇痛药物，其特征在于，所述三种蛇毒神经 毒素的具体比例为p1：p2：p3＝10-95％：1-80％：1-80％。
12.进一步的，所述三种蛇毒神经毒素的具体比例为p1：p2：p3＝22-80％：8-60％： 10-70％。
13.进一步的，所述三种蛇毒神经毒素的具体比例为p1：p2：p3＝40％：40％：20％。
14.进一步的，所述三种蛇毒神经毒素的具体比例为p1：p2：p3＝50％：30％：20％。
15.进一步的，所述三种蛇毒神经毒素的具体比例为p1：p2：p3＝60％：10％：30％。
16.进一步的，所述蛇毒神经毒素p1的分子量为6944.9925da。
17.进一步的，所述蛇毒神经毒素p2的分子量为6945.9770da。
18.进一步的，所述蛇毒神经毒素p3的分子量为6945.9678da。
19.进一步的，所述蛇毒神经毒素p2的蛋白氨基酸序列lechnqqssqtptttgcsgg etncykkrwr dhrgyrterg cgcpsvkd(iso)gieinccttdrc nn，其中第48位的d(iso)为异构天冬氨酸。
20.进一步的，所述蛇毒神经毒素p3的蛋白氨基酸序列lechnqqssqtptttgcsgg etncykkrwr dhrgyrterg cgcpsvkdgi einccttdrcnn，其中第48位的d为非异构天冬氨酸。
21.所述的镇痛药物，在制备镇痛注射液中的应用。
22.本技术的蛇毒神经毒素分离及鉴定实验：
23.供试品
24.供试品名称供试品批号供试品状态科博肽20191101固体科博肽注射液20190801液体
25.实验仪器
26.1)高分辨质谱仪：xevo g2-xs qtof(waters)
27.2)超高效液相色谱：uplc(acquityuplc i-class)(waters)
28.3)高效液相色谱：lc-20ad，(shimadzu)
29.4)高分辨质谱仪：q-exactive plus，(thermo fisher)
30.5)超高效液相色谱：vanquish duo，(thermo fisher)
31.材料和试剂
32.1)乙腈(thermo fisher)
33.2)水(thermo fisher)
34.3)三氟乙酸(sigma)
35.4)色谱柱:symmetry shield
tm rp185μm(waters)
36.5)色谱柱:acquity peptide beh c18，1.7μm 2.1mm*150mm (waters)
37.6)trypsin(promega)
38.7)glu-c(wako)
39.8)lys-c(wako)
40.实验方法
41.1)分离收峰
42.流动相a：0.1％tfainh2o；流动相b：0.1％tfain 50％acn h2o；
43.样品制备：
44.称取适量的科博肽粉末，用水配置成20mg/ml。供试品首先采用高效液相 色谱系统(lc-20ad，shimadzu)进行分离。供试品进样量40ul，经色谱柱 分离，流速为1.5ml/min，紫外检测波长214nm，柱温45℃。相关液相色谱梯 度设置见下表1。
45.表1色谱梯度设置
46.时间/min流速ml/min流动相a％流动相b％0.01.59284.01.592834.01.5604038.01.5604038.11.5928451.5928
47.供试品经hplc分离后，根据不同出峰时间进行收集杂质。收集完成后统 一冻干，使用水复溶后置于-80℃备用。
48.2)酶解方法
49.还原酶解：取各馏分、科博肽和科博肽注射液适量，加入150mm tris-hcl ph 7.8调整至弱碱性(0.5μg/μl)，加入适量dtt使终浓度为10mm，37℃处 理约3h，完成后20mm iaa避光孵育3h，结束后稀释五倍(约0.1μg/μl)， 加入适量lysc 37℃酶解过夜。非还原酶解：取各馏分、科博肽和科博肽注射液 适量，加入150mm tris-hcl ph 7.8调整至弱碱性(0.15μg/μl)，加入适量 trypsin 37℃处理过夜，完成后一分为二，一份加入适量glu-c 37℃酶解6h； 另一份继续加入trypsin 37℃酶解6h。
50.3)液质联用
51.a)uplc-qtof
52.高分辨分子量：
53.采用uplc液相系统进行分离。流动相a为0.1％fa水溶液，b为0.1％ fa乙腈溶液。样品由自动进样器上样，再经色谱柱分离，流速为0.3ml/min，紫 外检测波长280nm，柱温80℃，分析时长15min。
54.表2 unifi参数设置
[0055][0056]
样品用xevog2-xs qtof质谱仪(waters)进行质谱分析。检测方式：正离 子，母离子扫描范围：300-2000m/z。采用unifi(1.8.2，waters)处理数据，参数 见表2。
[0057]
b)uplc-qe
[0058]
酶解样品采用uplc液相系统(vanquish duo)进行分离。a液为0.1％fa水 溶液，b液为0.1％fa乙腈溶液。酶解肽段经毛细管高效液相色谱分离后使用
[0059]
表3 biopharma finder查库参数
[0060][0061]
质谱仪(q-exactive plus)进行质谱检测分析。分析时长：80min，检测方式： 正离子，母离子扫描范围：300-2000m/z，一级质谱分辨率：70，000atm/z 200， 二级质谱分辨率：17，500at m/z 200。原始数据(.raw)文件用biopharma finderv1.0(thermo)软件进行数据检索分析查库参数见表3。
[0062]
实验结果
[0063]
1)供试品分离收峰
[0064]
供试品科博肽(批号：20191101)hplc分离uv(紫外214nm)图与blank 对比见附图1，该条件下供试品可以得到较充分分离(分离度接近1.5，详见附 图2)。
[0065]
根据以上液质检测图谱，供试品科博肽(批号：20191101)被分离成3个主 要色谱峰p1、p2和p3，含量分别占比约58.6％、11.8％和28.6％(见附图2积分结 果)。具体收集过程需要避免高含量成分污染，这里p2与p3同时收集(见附图3)， p1另收集(见附图4)。馏分p1、p2和p3经冻干浓缩复溶之后纯度验证见附图5
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附图7，详细对比见表4。
[0066]
表4供试品科博肽(批号20191101)主要成分p1、p2和p3纯化前后纯度对比
[0067][0068]
2)高分辨分子量分析
[0069]
供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1、p2和p3经uplc-qtof检测，相 关鉴定结果见附图8-附图10，分子量对比见表5。
[0070]
表5供试品科博肽(批号:20191101)馏分p1、p2和p3高分辨分子量信息表
[0071][0072]
3)二硫键分析
[0073]
供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其 馏分(p1，p2，p3)经非还原trypsin/glu-c酶解，酶解产物经液质两用tic对比 见附图11，检测数据经软件分析，二硫键相关肽段的质谱鉴定图谱见附图12-附图 16，均鉴定到与理论二硫键配对方式相符的4对二硫键(见表6)。
[0074]
表6供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其馏分p1、p2和p3二硫键 鉴定表
[0075][0076]
4)翻译后修饰分析
[0077]
供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101)及其 馏分(p1，p2，p3)经还原lys-c酶解，酶解产物经液质两用tic对比见图17。
[0078]
鉴定到p2p3肽段ngieinccttdrcnn的n48位具有较高比例的脱酰胺修饰， 具体比
例见表7。
[0079]
表7供试品脱酰胺修饰位点分析
[0080][0081]
鉴定图谱见附图18-附图20。
[0082]
p2、p3具有相同的分子量以及相同的脱酰胺位点n48，但是p2、p3蛋白的出峰时间，p2(27.97min)早于p3(28.72min)见图2，脱酰胺肽段ngieinccttdrcnn出峰时间p2(25.07min)也早于p3(25.18min)，可以确认p2峰蛋白为n48位天冬酰胺脱酰胺后形成的天冬氨酸异构体蛋白，p3峰蛋白为n48位天冬酰胺脱酰胺后形成的天冬氨酸蛋白。
[0083]
本次试验采用液相色谱分离及液质联用检测的方法对供试品进行杂质分析，可以得到如下结论：
[0084]
1)供试品科博肽(批号：20191101)进行液相色谱分离分析主要检测到p1、p2和p3共计3个色谱峰，经收集后各馏分p1、p2和p3纯度均高于90％，详见表4。
[0085]
2)高分辨分子量分析：对供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1、p2和p3进行高分辨分子量分析，发现p1与科博肽理论分子量一致，为6944.9925da，杂质p2和p3为科博肽脱酰胺后产物，分子量分别为6945.9770da、6945.9678da。
[0086]
3)二硫键分析：经过二硫键检测分析，馏分p1、p2、p3与供试品科博肽(批号：20191101)及科博肽注射液(批号：20190801)均检测到了与理论一致的四对二硫键(表6)，二硫键无差异，都是cys3-cys24、cys17-cys41、cys43-cys54、cys55-cys60。
[0087]
4)翻译后修饰分析：通过翻译后修饰分析及液相色谱出峰时间的前后可以确定，杂质p2和p3脱酰胺均发生在第48位天冬酰胺上，且p2保留时间在p3之前。脱酰胺肽段形成的天冬氨酸有两种异构形式，异构天冬氨酸出峰时间在非异构天冬氨酸之前，确定杂质p2的第48位脱酰胺主要为异构天冬氨酸。
[0088]
5)综合可得：
[0089]
蛋白p1氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkngieinccttdrcnn.
[0090]
蛋白p2氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkd(iso)gieinccttdrcnn.
[0091]
蛋白p3氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkdgieinccttdrcnn.
[0092]
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
[0093]
(1)本发明利用反向hplc分离收集科博肽中的其他组分，分析鉴定后得到了多种蛇毒神经毒素，可以将其重新配伍得到新的镇痛药物。
[0094]
(2)本发明利用反向hplc分离收集科博肽中的其他组分，分析鉴定后得到了多种蛇毒神经毒素，将其按照特定比例进行配伍后，取得了一种镇痛效果好，副作用小，并且可以根据需要调整具体配比的蛇毒神经毒素类镇痛药物。
[0095]
(3)本发明得到的多成分复合蛇毒神经毒素镇痛药物，其毒性相较目前的科博肽
有了极大降低，安全性更高，镇痛作用效果接近，是一种比目前科博肽效 果更好，品质控制更精准，药效更明确的镇痛药物。
[0096]
(4)本发明得到的镇痛药物，在给药后1h明显起效，4h后镇痛作用最强， 6h后仍具有良好的镇痛作用，适宜作为低毒长效镇痛药物使用。
附图说明
[0097]
图1是供试品科博肽(批号：20191101)(上)和blank(下)uv对比 图谱。
[0098]
图2是供试品科博肽(批号：20191101)uv图谱(上、中)和积分表格 (下)。
[0099]
图3是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p2与p3收集uv保留时 间示意图。
[0100]
图4是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1收集uv保留时间示意 图。
[0101]
图5是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1纯度验证结果图。
[0102]
图6是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p2纯度验证结果图。
[0103]
图7是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p3纯度验证结果图。
[0104]
图8是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1高分辨分子量鉴定图谱 (上：uv鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([m h] ))。
[0105]
图9是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p2高分辨分子量鉴定图谱 (上：uv鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([m h] ))。
[0106]
图10是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p3高分辨分子量鉴定图谱 (上：uv鉴定图谱，中：一级质谱图谱，下：单同位素相对分子量([m h] ))。
[0107]
图11是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101) 及其馏分(p1，p2，p3)非还原trypsin/glu-c酶解产物tic对比图。
[0108]
图12是供试品科博肽(批号：20191101)二硫键鉴定图谱。
[0109]
图13是供试品科博肽注射液(批号：20190801)二硫键鉴定图谱。
[0110]
图14是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p1二硫键鉴定图谱。
[0111]
图15是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p2二硫键鉴定图谱。
[0112]
图16是供试品科博肽(批号：20191101)馏分p3二硫键鉴定图谱。
[0113]
图17是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101) 及其馏分(p1，p2，p3)还原lys-c酶解产物tic对比图。
[0114]
图18是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101) 及其馏分(p1，p2，p3)肽段lechnqqssq tptttgcsgg etncyk鉴定xic 对比图。
[0115]
图19是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101) 及其馏分(p1，p2，p3)肽段rwr dhrgyrterg cgcpsvk鉴定xic对比 图。
[0116]
图20是供试品科博肽注射液(批号：20190801)、科博肽(批号：20191101) 及其馏分(p1，p2，p3)肽段ngi einccttdrc nn鉴定xic对比图。
具体实施方式
[0117]
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保 护的范围不仅局限于所作的描述。
[0118]
实施例
[0119]
将分离得到的蛋白p1、p2、p3进行复配，并进行镇痛作用研究实验。
[0120]
实验材料
[0121]
受试样品：
[0122]
蛋白p1、p2、p3：
[0123]
蛋白p1氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkngieinccttdrcnn.
[0124]
蛋白p2氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkd(iso)gieinccttdrcnn.
[0125]
蛋白p3氨基酸序列为：lechnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtergcgcpsvkdgieinccttdrcnn.
[0126]
按照如下比例配置复合镇痛药物及对比实验组药物：
[0127][0128]
受试动物：
[0129]
昆明种小鼠，雌性，体重18-22g。由贵州医科大学实验动物中心提供。动物合格证号:scxk(黔)2018-0001。小鼠每笼6只，由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温18～25c，相对湿度50～70％，实验室和洁净动物饲养柜均按常规定期消毒。动物于该环境饲养3天，用于实验。
[0130]
主要仪器及其他试剂
[0131]
智能热板仪，yls-6b型，安徽耀坤生物科技有限公司。单道可调移液器，100-1000
μl型，德国eppendorf公司。单道可调移液器，10-100μl型，德国 eppendorf公司。电子天平，ab104-s型，mettlertoledo公司。盐酸吗啡， 国营东北第六制药厂，批号:610902。0.9％氯化钠注射液(生理盐水)，贵州科伦药 业有限公司，批号:e120091503。
[0132]
实验方法
[0133]
筛选
[0134]
取雌性昆明种小鼠若干，逐一放置于热板仪上检测小鼠的痛阙值。具体方法 为:热板仪温度调至55℃，待仪器预热后将小鼠逐一放置于热板仪上，在小鼠足 底接触到热板仪台面的同时开始计时，接着观察小鼠出现添后足的表现，在小鼠 出现添后足的瞬间停止计时，记录到的时间即为小鼠的痛阈值。根据测试结果， 筛选出5s《痛阈值《30s的小鼠，并剔除在热板仪上容易出现跳跃反应的小鼠，即 为合格小鼠。
[0135]
分组
[0136]
取筛选合格的小鼠120只，按体重随机分成12个组，分别为:对照组、阳性组(吗 啡组)、科博肽组、复合药物1-9组，每组10只小鼠。
[0137]
给药
[0138]
对照组给生理盐水，吗啡组给吗啡10mg/kg，科博肽组及各复合药物实验组 均按照23.3ug/kg给药。给药途径为肌肉注射，给药容积均为5ml/kg。
[0139]
指标检测
[0140]
各组动物给药前(给药0h)先测1次痛阈值作对照,即记录将小鼠置于55％c热 板仪上出现舔后足的时间。再于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h分别测定各组小鼠 痛阈值。若小鼠在60s内仍未出现添后足反应，则应取出小鼠，其痛阈值计为60s。 根据结果绘制各组小鼠给药前及给药后不同时间痛阈值变化曲线(药效-时间曲 线)，并按下列公式计算痛阈提高百分率。
[0141][0142]
统计学分析
[0143]
实验数据用spss 26.0统计软件进行统计与分析，所有数据均为计量资料,以 均值士标准差(x s)表示，当数据符合正态分布和方差齐性时，组间对照采用t 检验，不满足正态分布采用非参数检验，p《0.05表示差异有统计学意义。
[0144]
实验结果
[0145]
各组小鼠给药前及给药后不同时间痛阀值如表8所示，给药后不同时间痛阀 提高百分率如表9所示。
[0146]
表8
[0147]
[0148][0149]
表9
[0150]
[0151][0152]
通过与自身给前对照，发现科博肽组及各复合药物组小鼠给药后1h～6h的痛 阈值较自身给药前明显延长(p《0.01)。通过与对照组(生理盐水组)的比较，发 现:科博肽组及各复合药物组小鼠给药后2h、4h、6h时的痛阈值较对照组明显延长。
[0153]
使用复合药物组1按23.3ug/kg剂量给小鼠肌肉注射后，10只小鼠全部死亡， 说明其副作用较大，并且无法得到实验结果。
[0154]
由上可知，将科博肽中不同成分分离后重新配组，可以得到多种镇痛效果好， 副作用小，并且可以根据需要调整具体配比的蛇毒神经毒素类镇痛药物，当p1： p2：p3＝40％：40％：20％、p1：p2：p3＝60％：10％：30％、p1：p2：p3＝50％： 30％：20％时镇痛效果较好，并且当三种蛇毒神经毒素的具体比例为p1：p2：p3＝40％：40％：20％时整体效果最佳，副作用也较小。
[0155]
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明 的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能 从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。