一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法

1.本发明涉及植物快速繁殖领域，具体涉及一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法。


背景技术：

2.蜡梅(chimonanthus praecox(linn.)link)为蜡梅科蜡梅属多年生落叶灌木，具有色、香、形、姿的观赏价值，特别是其花黄如腊，花香怡人，开于寒冬时节，花清香四溢，是我国特有的珍贵花木，也是世界著名的园林观赏树种。同时，蜡梅花所提取的精油成分丰富，在国际市场上蜡梅芳香油的价格大大高于玫瑰油和茉莉芳香油，在精油市场具有较大的发展潜力。然而，缺乏优良品种及有效的良种规模化快繁技术已成为蜡梅产业发展的瓶颈问题。
3.目前，蜡梅主要通过播种方式进行繁殖，由于种子的杂合性，很难保存母本植株优良农艺性状；通过扦插、嫁接和分株等繁殖方式对蜡梅进行繁殖虽可以保持蜡梅母本植株的优良农艺性状，但存在繁殖材料有限，繁殖系数低，繁殖过程繁琐且繁殖受季节限制等问题，远不能满足市场对蜡梅优良种苗的需求。针对上述蜡梅繁育过程中所存在的诸多问题，发明人前期研发了一种蜡梅植株高效离体再生的方法(zl 201710305050.4)，以种子实生苗为外植体来源，利用组织培养技术实现了蜡梅植株的组培快繁。但发明人将该技术直接应用于野外多年生蜡梅优良株系快繁时发现：腋芽萌发后获得的茎段在再生过程中基部会产生大量的愈伤组织，严重影响营养物质的吸收，从而导致组培再生芽瘦小、黄化，严重影响了再生植株后期的生长。因此，针对这个问题急需开发一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于如何减轻蜡梅优良株系茎段组培再生过程中基部愈伤组织的形成，提高腊梅再生植株的移栽成活率。
5.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
6.一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
7.s1、以野外多年生蜡梅优良株系的当年生半木质化的带腋芽茎段为外植体；
8.s2、将s1中的外植体进行表面消毒，切成带腋芽的茎段，接种于腋芽诱导培养基中进行腋芽的萌发诱导；
9.s3、将s2中萌发后的腋芽切成切段，接种于添加有植物生长调节物质的培养基中进行不定芽的诱导和增殖培养；其中，所述添加有植物生长调节物质的培养基是指添加有0.2-0.5mg/l 6-ba、0.2-1.0mg/l zt、5-20mg/l agno3、20g/l蔗糖和8.0g/l琼脂的1/2dkw培养基；
10.s4、将增殖培养后的不定芽分离后进行瓶外生根培养获得完整的蜡梅再生植株。
11.以s2中萌发一定时间的腋芽为外植体，切成适宜大小的带腋芽的茎段，接种于添
加有植物生长调节物质的培养基中进行不定芽的诱导，然后再接种于添加有植物生长调节物质的培养基中进行增殖培养，进一步实现蜡梅优良株系的扩大培养，同时也避免了再生过程中茎段基部愈伤组织的诱导。
12.优选地，在s2中，将s1中的外植体进行表面消毒的方法包括以下步骤：将外植体剪切成5-7cm大小的切段，置于塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗15-25min，冲洗期间添加1-3ml洗手液；然后，用75％的无水乙醇擦拭1-3遍，置于无菌操作台中，用无菌水冲洗2-4遍，再用75％的无水乙醇消毒1-3次，每次消毒25-35s，然后用无菌水冲洗3-5遍，之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒1-2min，最后用无菌水冲洗5-7遍。
13.优选地，将s1中的外植体进行表面消毒的方法包括以下步骤：将外植体剪切成6cm大小的切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗20min，冲洗期间添加2ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍，再用75％的无水乙醇消毒2次，每次消毒30s，然后用无菌水冲洗4遍，之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍；消毒期间不停的摇动，消毒后吸干表面水分。
14.优选地，在s2中，所述腋芽诱导培养基的成分包括：1/2dkw、0.05-0.2mg/l 6-ba、0.05-0.5mg/l zt、20g/l蔗糖、8.0g/l琼脂。
15.优选地，在s3中，将s2中萌发45-90d后的腋芽切成适宜大小的带腋芽的切段。
16.优选地，在s3中，将s2中萌发60d后的腋芽切成适宜大小的带腋芽的切段。
17.优选地，所述带腋芽的切段长度为1.0cm。
18.优选地，在s3中，所述添加有植物生长调节物质的培养基是指添加有0.3mg/l 6-ba、1.0mg/l zt、10mg/l agno3、20g/l蔗糖和8.0g/l琼脂的1/2dkw培养基。
19.优选地，在s3中，在恒温培养室中进行不定芽的诱导和增殖培养；所述恒温培养室的温度为20
±
2℃，led红光：蓝光＝3：1，光周期为14/10h，光照强度为2000lx。
20.优选地，在s4中，所述瓶外生根培养所用的生根营养基质是经过添加有100-400mg/l k-iba和0.3％高锰酸钾的1/4霍格兰营养液喷施的营养基质。
21.优选地，所述营养基质为营养土、蛭石和珍珠岩的混合物，且营养土、蛭石、珍珠岩的体积比为2：2：1。
22.优选地，s2中所述腋芽的萌发诱导和s4中所述瓶外生根培养的培养条件均为：温度为22
±
2℃、led白光，光强度为2000lx，光照周期为14/10h。
23.优选地，在s4中，待增殖培养的不定芽长至3-6cm并伴有4-8片叶子时将不定芽分离。
24.优选地，在s2中，切成长度为1.5cm带腋芽的茎段。
25.优选地，s2中腋芽的萌发诱导以及s3中不定芽的诱导和增殖培养均在培养瓶中进行。
26.本发明所述0.1％的氯化汞溶液、0.3％高锰酸钾、20％次氯酸钠溶液、10％过氧化氢溶液中的百分比％均是指质量百分比。
27.本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用植物组织培养技术提供一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法，主要是以蜡梅多年生优良株系的当年生半木质化茎段为外植体，通过瓶内不定芽诱导结合瓶外生根技术，开发一种能够简化蜡梅组培繁育步骤、缩短生产周期、降低生产成本、减轻再生过程中愈伤组织形成且能提高蜡梅再生
植株移栽成活率的高效繁育技术；
28.本发明的优点在于：
29.(1)本发明以野外多年生蜡梅优良株系当年生半木质化茎段为外植体，通过直接不定芽诱导实现蜡梅植株的离体再生，具有取材方便、材料丰富，且能保持蜡梅母本株系的优良性状的特点；
30.(2)本发明涉及的再生方法可以有效的减轻茎段再生过程中愈伤组织的形成，有效的提高了再生植株的质量；
31.(3)本发明将蜡梅不定芽的生根过程与驯化过程结合到一起，即将蜡梅不定芽分离后直接定植于营养基质中于温室中进行生根成苗；一方面简化了瓶内生根和瓶外驯化移栽的环节，简化了整个繁育过程，缩短了育苗周期；另一方面也提高了组培苗的移栽成活率和生产效率，加快了育苗繁殖速度，节约了生产成本，为蜡梅的工厂化繁殖提供了更可靠、操作性更强的技术依据。
附图说明
32.图1为本发明采用的野外蜡梅优良株系的半木质化茎段图；
33.图2是本发明采用的野外蜡梅优良株系的茎段腋芽诱导萌发图；
34.图3是对比例1中蜡梅组培茎段不定芽诱导图；
35.图4是对比例1中蜡梅组培茎段不定芽增殖图；
36.图5是本发明实施例1中蜡梅组培茎段不定芽诱导图；
37.图6是本发明实施例1中蜡梅组培茎段不定芽增殖图；
38.图7是本发明实施例1中蜡梅组培茎段不定芽瓶外生根定植图；
39.图8是本发明实施例1中蜡梅丛生芽瓶外生根诱导培养10d图。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
42.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
43.对比例1
44.一种蜡梅优良株系茎段组培再生的方法，具体操作如下：
45.(1)取材：以如图1所示的野外多年生蜡梅优良株系的当年生半木质化茎段为外植体；
46.(2)表面消毒与腋芽萌发诱导：
47.将步骤(1)中蜡梅优良株系的当年生半木质化茎段剪切成6cm大小切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗20min，冲洗期间添加2ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍；再用75％的无水乙醇
消毒2次，每次消毒30s；然后用无菌水冲洗4遍；之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动，消毒后吸干表面水分，切成1.5cm长的带腋芽的茎段，接种于含有1/2dkw、0.05mg/l 6-ba、0.2mg/l zt、20g/l蔗糖、7.5g/l琼脂的培养基中，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室中进行茎段腋芽的萌发诱导培养，培养20d后如图2所示，其茎段污染率为2.0％；腋芽萌发率为89.8％。
48.(3)扩大培养：
49.以步骤(2)中萌发45d后的腋芽为外植体来源，切成长度为1.0cm且带有腋芽的切段，接种于发明人前期研发的一种蜡梅植株高效离体再生的方法(zl 201710305050.4)所涉及的蜡梅腋芽萌发诱导的诱导培养基(dkw、0.1mg/l ga3、1.0mg/l kt、12.5mg/l vc、30g/l蔗糖、7.0g/l琼脂)中进行不定芽的诱导；光照培养4周后，茎段腋芽萌发但茎段基部形成大量的愈伤组织，如图3所示；将上述腋芽萌发后的茎段去除基部愈伤组织后转接于发明专利(zl 201710305050.4)所涉及的增殖和伸长培养基(dkw、2.0mg/l kt、0.1mg/l tdz、1.0mg/l iba、12.5mg/l vc、30g/l蔗糖、7.0g/l琼脂)中，于温度为22
±
2℃，led白光，光强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行增殖培养，光照培养4周后，腋芽虽增殖，且平均每个外植体产生3.1个不定芽，但茎段基部形成大量的愈伤组织，如图4所示，致使不定芽黄化坏死，严重影响不定芽质量。
50.(4)不定芽的瓶外生根：
51.将步骤(3)中形成的高3-6cm，伴有4-8片叶子的丛生芽从芽体分离，清洗后将其定植于经过添加有100mg/l k-iba和0.3％高锰酸钾的1/4霍格兰营养液喷施的营养基质中，其中，所述营养基质由体积比为2：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩组成，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行瓶外不定根诱导培养，培养2周后，茎段基部有不定根形成，继续培养2周后，不定根诱导率为58.9％；继续培养2个月后，田间移栽成苗率为87.3％。
52.实施例1
53.一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法，具体操作如下：
54.(1)取材：以如图1所示的野外多年生蜡梅优良株系的当年生半木质化带腋芽的茎段为外植体；
55.(2)表面消毒与腋芽萌发诱导：
56.将步骤(1)中蜡梅优良株系的当年生茎段剪切成6cm大小的切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗20min，冲洗期间添加2ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍；再用75％的无水乙醇消毒2次，每次消毒30s；然后用无菌水冲洗4遍；之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动；消毒后吸干表面水分，切成1.5cm长的带腋芽的切段，接种于含1/2dkw、0.2mg/l 6-ba、0.05mg/l zt、20g/l蔗糖、8.0g/l琼脂的培养基中，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室中进行茎段腋芽的萌发诱导培养，培养20d后腋芽萌发率为100％。
57.(3)扩大培养：
58.以步骤(2)中萌发60d后的腋芽为外植体来源，切成长度为1.0cm且带有腋芽的切
段，接种于含1/2dkw、0.3mg/l 6-ba、1.0mg/l zt、10mg/l agno3、20g/l蔗糖、8.0g/l琼脂的不定芽诱导培养基中于温度为20
±
2℃，led红光：蓝光＝3：1，光周期为14/10h的恒温培养室中进行不定芽的诱导培养。光照培养4周后，不定芽诱导率高达92.4％，平均每个外植体产生3.3个不定芽，仅10.4％的茎段基部有少量无愈伤组织形成，如图5所示；然后，将诱导出不定芽从的茎段转移到新鲜的不定芽诱导培养基中进行不定芽的继代和增殖培养。光照培养4周后，平均每个外植体产生6.5个不定芽，平均芽长4.8cm，如图6所示。
59.(4)不定芽的瓶外生根：
60.将步骤(3)中形成的高3-6cm，伴有4-8片叶子的丛生芽分离，清洗后将其定植于经过添加有300mg/l k-iba和0.3％高锰酸钾的1/4霍格兰营养液喷施的营养基质中，其中营养基质含有体积比为2：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行瓶外不定根诱导培养，如图7所示。培养10天后，茎段基部有不定根形成，如图8所示，不定根诱导率为91.2％；继续培养2个月后，田间移栽成苗率为95.6％。
61.实施例2
62.一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
63.(1)取材：以野外多年生蜡梅优良株系的当年生半木质化带腋芽的茎段为外植体；
64.(2)表面消毒与腋芽萌发诱导：
65.将步骤(1)中的外植体剪切成5cm大小的切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗15min，冲洗期间添加1ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭3遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗2遍；再用75％的无水乙醇消毒1次，消毒时间为25s；然后用无菌水冲洗5遍；之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒1min，最后用无菌水冲洗7遍，切成1.5cm长的带腋芽的切段，接种于含1/2dkw、0.05mg/l 6-ba、0.5mg/l zt、20g/l蔗糖、8.0g/l琼脂的培养基中，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室中进行茎段腋芽的萌发诱导培养；
66.(3)扩大培养：
67.以步骤(2)中萌发45d后的腋芽为外植体来源，切成长度为1.0cm且带有腋芽的切段，接种于含1/2dkw、0.2mg/l 6-ba、0.2mg/l zt、5mg/lagno3、20g/l蔗糖、8.0g/l琼脂的不定芽诱导培养基中于温度为20
±
2℃，led红光：蓝光＝3：1，光周期为14/10h的恒温培养室中进行不定芽的诱导培养。光照培养4周后，将诱导出不定芽从的茎段转移到新鲜的不定芽诱导培养基中进行不定芽的继代和增殖培养；
68.(4)不定芽的瓶外生根：
69.将步骤(3)中形成的高3-6cm，伴有4-8片叶子的丛生芽分离，清洗后将其定植于经过添加有100mg/l k-iba和0.3％高锰酸钾的1/4霍格兰营养液喷施的营养基质中，其中营养基质含有体积比为2：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室中进行瓶外不定根诱导培养。
70.实施例3
71.一种减轻蜡梅茎段组培再生中基部愈伤组织形成的方法，包括以下步骤：
72.(1)取材：以野外多年生蜡梅优良株系的当年生半木质化带腋芽的茎段为外植体；
73.(2)表面消毒与腋芽萌发诱导：
74.将步骤(1)中的外植体剪切成7cm大小的切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗25min，冲洗期间添加3ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭2遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍；再用75％的无水乙醇消毒3次，每次消毒时间为35s；然后用无菌水冲洗3遍；之后再用0.1％的氯化汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗5遍，切成1.5cm长的带腋芽的切段，接种于含1/2dkw、0.1mg/l 6-ba、0.3mg/l zt、20g/l蔗糖和8.0g/l琼脂的培养基中，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室中进行茎段腋芽的萌发诱导培养；
75.(3)扩大培养：
76.以步骤(2)中萌发90d后的腋芽为外植体来源，切成长度为1.0cm且带有腋芽的切段，接种于含1/2dkw、0.5mg/l 6-ba、0.5mg/l zt、20mg/l agno3、20g/l蔗糖和8.0g/l琼脂的不定芽诱导培养基中于温度为20
±
2℃，led红光：蓝光＝3：1，光周期为14/10h的恒温培养室中进行不定芽的诱导培养。光照培养4周后，将诱导出不定芽从的茎段转移到新鲜的上述不定芽诱导培养基中进行不定芽的继代和增殖培养；
77.(4)不定芽的瓶外生根：
78.将步骤(3)中形成的高3-6cm，伴有4-8片叶子的丛生芽分离，清洗后将其定植于经过添加有400mg/l k-iba和0.3％高锰酸钾的1/4霍格兰营养液喷施的营养基质中，其中营养基质含有体积比为2：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩，于温度为22
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行瓶外不定根诱导培养。
79.测试了不同消毒方法对蜡梅野外茎段污染率的影响。以野外多年生蜡梅的当年生半木质化带腋芽的枝条为外植体，剪切成6cm大小的切段，置于300ml塑料培养瓶中，纱布封口后于流水下冲洗20min，冲洗期间添加2ml洗手液，然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍，置于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍；再用75％的无水乙醇消毒2次，每次消毒30s；然后用无菌水冲洗4遍；之后再用不同种类的消毒试剂(20％次氯酸钠溶液，0.1％氯化汞溶液及10％过氧化氢溶液)消毒不同时间(1min，2min，3min和5min)，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动。消毒后吸干表面水分，切成1.5cm带腋芽的茎段，接种于实施例1中腋芽诱导培养基中进行腋芽的诱导培养。生长条件与实施例1相同。培养20d后，统计茎段平均污染率及腋芽的平均萌发率，结果如表1所示。
80.表1不同消毒方法对蜡梅茎段污染率及腋芽萌发的影响
81.[0082][0083]
表1结果表明，在所测试的三种消毒剂中，0.1％氯化汞溶液的消毒效果最佳，随着消毒时间的延长污染率逐渐降低，消毒2min时茎段腋芽的生长状态最好，茎段的平均污染率仅为2.0％，腋芽平均萌发率为100％。
[0084]
为减轻蜡梅无菌组培茎段再生过程中基部愈伤组织的诱导，发明人进一步测试了不同种类和浓度的植物调节剂(6-ba、zt和agno3)，dkw培养基中大量元素的含量、不同光质及外植体年龄即野外茎段萌发不同天数(30d，45d，60d，75d和90d)获得的腋芽植株对蜡梅茎段不定芽诱导和愈伤组织诱导的影响。以经过萌发培养60d获得的腋芽植株为外植体材料，切成1.0cm大小切段接种于添加有不同植物生长调节剂的不同大量元素含量的dkw培养基中于温度为20
±
2℃，led白光，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行茎段腋芽不定芽诱导培养，结果如表2所示。表2研究表明培养基中低浓度大量元素及低浓度植物生长调节剂更利于缩小茎段基部愈伤组织的形成，但低浓度植物生长调节剂影响不定芽的诱导率，低浓度大量元素也导致不定芽的长势弱，甚至出现黄化的现象。因此，基于不定芽诱导率，不定芽个数，愈伤组织诱导情况及不定芽长势的综合考虑，1/2dkw培养基中添加0.3mg/l 6-ba、1.0mg/l zt和10mg/l agno3蜡梅茎段不定芽的诱导效果最佳。光照培养30d后，平均不定芽诱导率为89.2％，平均每个外植体产生3.1个不定芽，平均愈伤组织诱导率为16.3％，愈伤组织的平均直径为0.6cm。
[0085]
表2不同植物生长调节物质及大量元素对蜡梅茎段不定芽诱导的影响
[0086][0087]
同时发明人测试了led光质对蜡梅茎段不定芽长势的影响，研究发现，led光质对茎段不定芽长度及长势的影响如表3所示。研究发现led光质对蜡梅不定芽的长势具有重要的影响，在所测试的光质中，led红：蓝为3：1时，最利于芽的伸长生长。
[0088]
表3不同led光质条件对蜡梅茎段不定芽高度的影响
[0089][0090][0091]
在此基础上，发明人进一步测试了外植体年龄对愈伤组织及不定芽诱导情况的影响，将实施例1中野外茎段萌发不同天数(30d，45d，60d，75d和90d)获得的腋芽植株的茎段接种在添加有0.3mg/l 6-ba、1.0mg/l zt和10mg/l agno3的1/2dkw培养基中于温度为20
±
2℃，led红光：蓝光(3：1)，光照强度为2000lx，光周期为14/10h的恒温培养室进行茎段不定芽诱导培养，结果如表4所示。研究表明外植体年龄对茎段不定芽及愈伤组织的形成具有重要影响，随着茎段年龄的增加，不定芽诱导率及平均每个外植体产生的不定芽个数出现先增加后降低的现象，同时，随着茎段年龄的增加，愈伤组织诱导率及愈伤组织的直径出现逐渐降低的趋势，苗龄为90d时愈伤组织的诱导率为0％。综合考虑不定芽及愈伤组织的诱导情况，以苗龄为60d的茎段为外植体时，诱导效果最好。
[0092]
表4不同外植体年龄对蜡梅不定芽诱导的影响
[0093][0094][0095]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。