一种新型冠状病毒2019-nCoV快检试纸条制备方法与流程

一种新型冠状病毒2019-ncov快检试纸条制备方法
技术领域
1.本发明属于医学免疫检测技术领域，具体提供一种新型冠状病毒2019-ncov快检试纸条制备方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒2019-ncov疫情已在全世界蔓延，对我国及全球民生和经济造成极大影响。如何快速筛查诊断2019-ncov新型冠状病毒显得极为重要，因此，其实验室检测技术备受广泛关注。
3.目前已涌现出多种关于新型冠状病毒2019-ncov检测方法，如，病毒核酸检测，主要包括实时荧光定量pcr和快速多重pcr方法。但病毒核酸检测结果受到疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、检测操作环境以及人员操作等因素的影响，容易出现假阴性结果问题，且pcr法需要价格昂贵的pcr仪器，耗费时间长，不适于2019-ncov的快速诊断。
4.因此，寻求一种价格便宜、操作简便、灵敏度和特异性都较高的检测方法是迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

5.针对上述的技术缺陷和应用时的不利情况，本发明提供了一种新冠状病毒 2019-ncov快检试纸条制备方法，通过偶联新冠状病毒2019-ncov s1-rbd抗体和 zncdse/zns量子点制备量子点荧光标记物，经优化反应体系和条件，制备了一种新冠状病毒2019-ncov快检试纸条，该试纸条操作简单、检测快速、灵敏、特异性强、结果清晰易于判断，不需昂贵的仪器设备，适用于实验室及快检现场操作。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.步骤1：羧基化水溶性zncdse/zns量子点与2019-ncov s1-rbd单克隆抗体偶联；
8.步骤2：将步骤1获得的偶联有羧基化水溶性zncdse/zns量子点的2019-ncov s1-rbd 单克隆抗体均匀喷覆于经过处理的硝酸纤维素膜上，室温下晾干待用；
9.步骤3：pbs缓冲液稀释2019-ncov s1-rbd多克隆抗体；
10.步骤4：均匀喷在硝酸纤维素膜上，形成检测带t；
11.步骤5：pbs缓冲液稀释羊抗鼠igg二抗；
12.步骤6：将步骤5制备的稀释液均匀喷在硝酸纤维素膜上，形成质控带c，t带和c带间隔5mm-10mm；
13.步骤7：将步骤4和步骤6制作的含检测带t和质控带c的硝酸纤维膜垫室温下晾干待用；
14.步骤8：在粘性pvc底板上依次粘帖样品垫、量子点标记的2019-ncov s1-rbd单克隆抗体的量子点标记垫、标有检测带t和质控带c的硝酸纤维素膜、吸水纸。黏贴的方法为，样品垫(1)左端对齐pvc底板(7)的左端，样品垫(1)的右端压在量子点标记垫(2)的左端，量
子点标记垫(2)的右端压在标记有检测带t(5)和质控带c (6)的硝酸纤维素膜左端，吸水纸(4)压在标记有检测带t和质控带c的硝酸纤维 3膜右端。
15.步骤9：用试纸切刀切割成3cm-5cm试纸。
16.步骤10：干燥后密封保存。
17.进一步的，上述步骤1中，羧基化水溶性zncdse/zns量子点使用终浓度为2μm.
18.进一步的，上述步骤1中edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs (n-羟基琥珀酰亚胺)混合物的使用浓度为1mg/ml，配比为3∶2；
19.进一步的，上述步骤2中基底硝酸纤维素膜在被喷涂之前经过质量浓度为0.5％的 tween-20和浓度为10mm的pbs浸泡处理，其ph值为7.4。
20.进一步的，上述步骤2中2019-ncov s1-rbd多克隆抗体为自制的多克隆抗体，抗体包覆浓度为0.1mg/ml-2mg/ml，更进一步的为0.5mg/ml。
21.进一步的，上述步骤5中羊抗鼠igg二抗包覆浓度为0.5mg/ml-5mg/ml，进一步的为 1mg/ml。
22.进一步的，上述步骤8中的样品垫为1％bsa的tbs，ph9.0处理过的吸水纸。
23.有益效果：本发明专利涉及一种新型冠状病毒2019-ncov快检试纸条制备方法，该快检试纸条操作简单、检测快速、灵敏、特异性强、结果清晰易于判断，不需昂贵的仪器设备，适用于实验室及快检现场操作。
附图说明
24.图1新型冠状病毒2019-ncov快检试纸条制作流程图。
25.图2新型冠状病毒2019-ncov快检试纸条结构示意图
26.其中，1、样品垫，2、量子点标记垫，3、硝酸纤维素膜，4、吸水纸，5、检测带t，6、质控带c，7、pvc底板。
具体实施方式
27.下面对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1
29.步骤1：使用终浓度为2μm羧基化水溶性zncdse/zns量子点与2019-ncov s1-rbd单克隆抗体(使用浓度为0.1mg/ml)偶联。
30.步骤2：获得的偶联有羧基化水溶性zncdse/zns量子点的2019-ncov s1-rbd单克隆抗体均匀喷覆于硝酸纤维素膜上，制成量子点标记垫1，室温下晾干待用。
31.步骤3：将中基底硝酸纤维素膜在被喷涂之前经过质量浓度为0.5％的tween-20和浓度为10mm的pbs浸泡处理，其ph值为7.4。
32.步骤4：取2019-ncov s1-rbd多克隆抗体为自制的多克隆抗体，抗体包覆浓度为 0.5mg/ml，使用pbs缓冲液稀释2019-ncov s1-rbd多克隆抗体，均匀喷在硝酸纤维素膜3上，形成5检测带t。
33.步骤5：pbs缓冲液稀释羊抗鼠igg二抗至1mg/ml。
34.步骤6：将步骤5稀释液均匀喷在硝酸纤维素膜3上，形成6质控带c带，t带和c 带间隔8mm。
35.步骤7制作完成的含t带和c带的硝酸纤维膜垫室温下晾干待用；
36.步骤8：取1％bsa的tbs，ph9.0处理过的吸水纸做为样品垫1，在粘性pvc底板7 上依次粘帖样品垫1、量子点标记的2019-ncov s1-rbd单克隆抗体的量子点标记垫2、标有检测带t和质控带c的硝酸纤维素膜3、吸水纸4。粘帖的方法为，样品垫左端对齐pvc底板的左端，样品垫的右端压在量子点标记垫2的左端，量子点标记垫的右压在标记有t线和c线的硝酸纤维膜左端，吸水纸压在标记有t线和c线的硝酸纤维膜右端。
37.步骤9：用试纸切刀切割成3cm-5cm试纸。
38.步骤10：室温干燥后密封，并保存在4℃
±
2℃保存。
39.实施例2(制备实施例)。
40.羧基化水溶性zncdse/zns量子点与2019-ncov s1-rbd单克隆抗体的偶联。
41.(1)吸取600μl ph7.4硼酸缓冲液加入到200μl水溶性cdte/znse核壳量子点(表面羧基修饰)中，使终浓度为2μm，缓慢搅拌混匀得到量子点溶液。
42.(2)加入100-200μl的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n
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羟基琥珀酰亚胺)偶联活化试剂edc和nhs到量子点溶液中，使工作浓度为1mg/ml，缓慢搅拌均匀。
43.(3)再加入50-200μl的浓度为0.1mg/ml 2019-ncov s1-rbd单克隆抗体溶液，室温条件下，100rpm/min摇床反应2～4小时。
44.(4)反应完全后，用5％的牛血清白蛋白(bsa)封闭30min；6000rpm离心3min，去除可能的团聚物，留上清。
45.(5)吸取500μl上清放入超滤管中(amicon ultra-0.5，ultracel-10 membrane，10kda， ufc501008)的内管中，将内管套入外管。
46.(6)沉淀物用含1％bsa的pb液(含0.02％nan3)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存备用。
47.(7)凝胶电泳法鉴定偶联效果定：制备1％的琼脂糖凝胶，吸取少量的上述实施例2 步骤(6)中的沉淀重悬液，在电压为80v的条件下，电泳30min后，在紫外分析仪中观察电泳结果，能显出清晰亮带说明偶联成功。
48.上述实施例仅为示例性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与变化。因此，本发明的权利保护范围，应以权利要求书的范围为依据。