一种吲哚布芬原料药中基因毒性杂质的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析化学领域，具体涉及吲哚布芬原料药中两种基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸测定的检测方法，用于吲哚布芬原料药中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸的分析与限度测定。


背景技术：

2.吲哚布芬(indobufen)是一种异吲哚啉基苯基丁酸衍生物，一种血小板聚集的抑制剂，于1984年在意大利首批上市。
3.其化学名为(
±
)2-[4-(1-氧代-2-异二氢吲哚基)苯基]丁酸，分子式c
18h17
no3，精确分子量295.12，结构式如下所示：
[0004][0005]
吲哚布芬主要是通过以下机制发挥抗血小板聚集作用：(1)可逆性抑制血小板环氧化酶，使血栓素b2(血小板聚集的强效激活剂)生成减少；(2)抑制二磷酸腺苷(adp)、肾上腺素和血小板活化因子(paf)、胶原和花生四烯酸诱导的血小板聚集；(3)降低血小板三磷酸腺苷、血清素、血小板因子3、血小板因子4和β-凝血球蛋白的水平，降低血小板粘附性。吲哚布芬是一种可逆的多靶点抗血栓药物。对于激活剂诱发的血小板聚集，单次口服吲哚布芬200mg后2小时可达最大抑制作用，12小时后仍有显著抑制作用(90％)，24小时内恢复。
[0006]
对于报道的吲哚布芬的合成工艺中多数工艺路线涉及2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸，专利cn106631974b公开了如下的合成工艺路线：
[0007]
(1)氢化反应
[0008][0009]
(2)环化反应：
[0010][0011]
(3)锌粉还原反应
[0012][0013]
该工艺路线以2-(4-硝基)苯基丁酸为起始物料，得到关键中间体，而2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸含有基因毒性的警示官能团，属于基因毒性杂质，并有在成品中残留的风险。依据ichm7指导原则的相关规定并结合吲哚布芬制剂的每日最大服用剂量(其中吲哚布芬400mg)，2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的每日最大摄入量不得大于1.5μg，故吲哚布芬原料药中2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的控制限度不得超过3.75ppm。但因其限度较低，检测较为困难，目前尚未有文献报告基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的检测方法。
[0014]
因此，找到一种灵敏度高，专属性好的检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和/或2-(4-硝基)苯基丁酸的方法，实现对吲哚布芬中该杂质的控制，对提高产品的质量和用药的安全性具有十分重要的意义。


技术实现要素：

[0015]
为解决现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的测定方法，能够有效实现吲哚布芬原料药中基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的测定和限度控制。所述的检测方法的灵敏度高、专属性强且操作简便、快速。
[0016]
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0017]
一种吲哚布芬原料药中基因毒性杂质的检测方法，所述方法以十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基键合硅胶为固定相对基因毒性杂质进行色谱分离，采用质谱检测仪进行分析检测；所述流动相为溶剂a和溶剂b的混合，所述的溶剂a选自含挥发性酸的水溶液体系，所述的溶剂b选自含有甲醇、乙腈或两者混合的任意一种。
[0018]
进一步，所述的基因毒性杂质为2-(4-氨基)苯基丁酸。
[0019]
进一步，所述流动相的ph控制在2～7之间，优选为2～3之间。
[0020]
进一步，优选的，所述的溶剂a选自含有甲酸、乙酸或两者混合的任意一种的水溶液；再进一步，所述的溶剂a的体积浓度优选为0.01％～1％；更进一步，所述的溶剂a优选为体积浓度0.01％～1％的乙酸水溶液。
[0021]
进一步，所述流动相洗脱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：0.01～1min时等度，溶剂a与溶剂b的体积比为90:10～70:30，2～4min时等度，溶剂a与溶剂b的体积比为10:90～5:95，4.1～5min时等度，溶剂a与溶剂b的体积比为90:10～70:30。
[0022]
进一步，所述的流动相的流速为0.3～0.5ml/min。
[0023]
进一步，优选的，所述色谱柱的规格为2.1
×
50mm，1.7μm或4.6
×
50mm，1.8μm或4.6
×
50mm，2.7μm。
[0024]
进一步，本发明所述的方法具体包括：取供试品溶解并稀释制成浓度约为0.5～1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；取基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸溶解并稀释制成浓
度约为1.875～3.75ng/ml的溶液，作为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液5～20μl进样，分别记录定量、定性离子对下的离子流图，照外标法以定量离子对峰面积计算杂质含量；所述稀释剂为初始流动相。
[0025]
本发明还公开了一种吲哚布芬原料药中基因毒性杂质的检测方法，所述方法以十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基键合硅胶为固定相对基因毒性杂质进行色谱分离，采用质谱检测仪进行分析检测；所述流动相为溶剂c和溶剂d的混合，所述的溶剂c选自挥发性盐的水溶液体系，所述的溶剂d选自含有甲醇、乙腈或两者混合的任意一种。
[0026]
进一步，所述的基因毒性杂质为2-(4-氨基)苯基丁酸和/或2-(4-硝基)苯基丁酸。
[0027]
进一步，所述流动相的ph控制在3～7之间，优选为6～7之间。
[0028]
进一步，所述的溶剂c选自甲酸铵或乙酸铵中的一种或任意几种的混合的水溶液；进一步，所述的溶剂c的浓度优选为5～50mmol/l；再进一步，所述的溶剂c优选为5～50mmol/l的乙酸铵的水溶液。
[0029]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸时，所述流动相洗脱采用梯度洗脱，洗脱条件为：0.01min时，溶剂c与溶剂d的体积比为85:15～70:30；2～3min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为30:70～15:85；3.1～5min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为85:15～70:30。
[0030]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸时，所述的流动相的流速为0.9～1.1ml/min。
[0031]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸时，所述色谱柱的规格为4.6
×
150mm,5μm或2.1
×
150mm,1.7μm或2.1
×
150mm,1.6μm或2.1
×
150mm,1.9μm或4.6
×
150mm,2.7μm或4.6
×
150mm,2.5μm或4.6
×
150mm,3.5μm或4.6
×
150mm,3.0μm。
[0032]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸时，所述的方法具体包括：取供试品溶解并稀释制成浓度约为5～10mg/ml的溶液，作为供试品溶液；取基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸溶解并稀释制成浓度约为18.75～37.5ng/ml的溶液，作为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液5～20μl进样，分别记录定量、定性离子对下的离子流图，照外标法以定量离子对峰面积计算杂质含量；所述稀释剂为初始流动相。
[0033]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述流动相洗脱采用梯度洗脱，洗脱条件为：0.01～1min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为90:10～70:30，2～4min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为10:90～5:95，4.1～5min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为90:10～70:30。
[0034]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述的流动相的流速为0.3～0.5ml/min。
[0035]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述色谱柱的规格为2.1
×
50mm，1.7μm或4.6
×
50mm，1.8μm或4.6
×
50mm，2.7μm。
[0036]
进一步，所述的方法单独检测基因毒性杂质2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述的方法具体包括：取供试品溶解并稀释制成浓度约为5～10mg/ml的溶液，作为供试品溶液；取基因毒性杂质2-(4-硝基)苯基丁酸溶解并稀释制成浓度约为18.75～37.5ng/ml的溶液，作为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液2～5μl进样，分别记录定量、定性离子对下的离子流图，照外标法以定量离子对峰面积计算杂质含量；所述稀释剂为流动相或流动相中的
任一种有机溶剂。
[0037]
进一步，所述的方法同时检测基因毒性杂质为2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述流动相洗脱采用梯度洗脱，洗脱条件为：0.01min时，溶剂c与溶剂d的体积比为90:10～85:15；5～6min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为30:70～25:75；6.1～10min时等度，溶剂c与溶剂d的体积比为90:10～85:15。
[0038]
进一步，所述的方法同时检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸时，流动相的流速为0.8～1.2ml/min。
[0039]
进一步，所述的方法同时检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述色谱柱的规格为4.6
×
150mm,5μm或2.1
×
150mm,1.7μm或2.1
×
150mm,1.6μm或2.1
×
150mm,1.9μm或4.6
×
150mm,2.7μm或4.6
×
150mm,2.5μm或4.6
×
150mm,3.5μm或4.6
×
150mm,3.0μm。
[0040]
进一步，所述的方法同时检测基因毒性杂质2-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸时，所述的方法具体包括：取供试品溶解并稀释制成浓度约为5～10mg/ml的溶液，作为供试品溶液；取基因毒性杂质-(4-氨基)苯基丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸溶解并稀释制成浓度约为18.75～37.5ng/ml的溶液，作为对照品溶液；分别取供试品溶液和对照品溶液10～20μl进样，分别记录定量、定性离子对下的离子流图，照外标法以定量离子对峰面积计算杂质含量；所述稀释剂为流动相或流动相中的任一种有机溶剂。
[0041]
本发明所述方法的检测器均为质谱检测器，采用电喷雾离子源(esi)，mrm检测模式，检测基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸采用正离子扫描模式，检测基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸采用负离子扫描模式，根据基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸的化学结构和子离子的检出实际，采用各自的专属离子对进行定性和定量分析，各具体的定量离子对、定性离子对如下所示：
[0042]
基因毒性杂质定量离子对定性离子对2-(4-氨基苯基)丁酸180
→
106180
→
134；180
→
932-(4-硝基苯基)丁酸164
→
149164
→
119；164
→
93；
[0043]
进一步，本发明所述的方法中，所述色谱柱柱温箱温度为20℃-50℃。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0044]
本发明提供了三种分析方法，用于基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的单独测定或同时测定。所述基因毒性杂质的结构类型为硝基苯类与苯胺类。所述三种方法不仅能够实现吲哚布芬原料药中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基)苯基丁酸的定量测定，而且方法的专属性强、准确度、灵敏度高(定量限不大于限度的1/3，检测限不大于限度的1/10)；同时实验操作简便、快速，对吲哚布芬的质量控制及用药安全保证具有重要的意义。
附图说明
[0045]
图1为实施例1中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸对照品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱)；
[0046]
图2为实施例1中z191212批样品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱)；
[0047]
图3为实施例3中基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸对照品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 164-》149提取离子流图谱)；
[0048]
图4为实施例3中z191212批样品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 164-》149提取离子流图谱)；
[0049]
图5为实施例5中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸对照品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱)；
[0050]
图6为实施例5中z191212批样品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱)；
[0051]
图7为实施例7中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸检测限测试的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱，c为mrm 164-》149提取离子流图谱)；
[0052]
图8为实施例7中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸定量限测试的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱，c为mrm 164-》149提取离子流图谱)；
[0053]
图9为实施例7中基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸混合对照品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱，c为mrm 164-》149提取离子流图谱)；
[0054]
图10为实施例7中z191212批样品溶液的hplc-ms图谱(其中a为mrm总离子流图谱，b为mrm 180-》106提取离子流图谱，c为mrm 164-》149提取离子流图谱)。
具体实施方式
[0055]
以下将参考附图，结合具体实施例对本发明做进一步阐述。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0056]
实施例中所涉及的对照品来源：
[0057]
基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸，深圳鼎利生物科技有限公司，纯度：98.17％，批号：dif18211-01；
[0058]
基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸，深圳鼎利生物科技有限公司，纯度：99.72％，批号：dif18210-0。
[0059]
实施例1液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸
[0060]
(1)色谱条件
[0061]
仪器：安捷伦6470型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪
[0062]
色谱柱：acquity beh c18 2.1mm
×
50mm,1.7μm
[0063]
流动相：溶剂a：0.01％乙酸水溶液；溶剂b：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
[0064][0065]
稀释剂：乙腈-水(50:50)
[0066]
流速：0.3ml/min
[0067]
柱温：35℃
[0068]
进样体积：5μl
[0069]
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子扫描模式
[0070]
干燥气、雾化气、鞘气均为氮气；碰撞气为高纯氮；
[0071]
干燥气温度为：300℃
[0072]
干燥气流速为：6l/min
[0073]
雾化气压力:35psi
[0074]
鞘气温度：350℃
[0075]
鞘气流速：12l/min
[0076]
毛细管电压： 4000v
[0077]
喷嘴电压： 500v
[0078]
mrm检测模式：定量离子对180
→
106，裂解电压(frag)115v，碰撞电压(ce)28v，驻留时间(dwell)170ms，加速电压(cell acc)3v；
[0079]
定性离子对180
→
134，裂解电压(frag)115v，碰撞电压(ce)18，驻留时间(dwell)170ms，加速电压(cell acc)3v；
[0080]
定性离子对180
→
93，裂解电压(frag)115v，碰撞电压(ce)28；驻留时间(dwell)170ms，加速电压(cell acc)3v；
[0081]
(2)方法学考察
[0082]
参照中国药典2020年版9101分析方法验证指导原则-杂质限度检查，对本法的专属性、检测限、定量限进行考察；
[0083]
(3)溶液配制
[0084]
对照品贮备溶液：精密称取对照品10.08mg，置100ml容量瓶中，用乙腈-水(50:50)溶解并稀释到刻度，摇匀，即得，浓度为98.96μg/ml；
[0085]
对照品溶液：取贮备液适量，用稀释剂稀释到限度浓度(3.75ng/ml)，摇匀，即得；
[0086]
定量限、检测限溶液：取对照品溶液适量，分别置100ml容量瓶中，用稀释剂稀释到刻度，摇匀，浓度分别为限度浓度的30％、25％、10％、5％、3％；
[0087]
供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料三批样品100.2、100.1、100.2mg，分别置100ml容量瓶中，用乙腈-水(50:50)溶解并稀释至刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得；
[0088]
加标供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料样品(z200203批)100.2mg，置100ml容量瓶中，用对照品溶液溶解并稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得；
[0089]
(4)测定方法
[0090]
专属性测定方法：分别进样稀释剂空白、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液，空白溶液应无干扰，样品及样品中存在的杂质应无干扰；
[0091]
定量限、检测限测定方法：分别取稀释剂空白及测试溶液进样，记录色谱图，计算mrm 180
→
106图谱中主峰信噪比，当信噪比约为3时对应浓度为检测限，当信噪比约为10时对应浓度为定量限；
[0092]
样品中2-(4-氨基苯基)丁酸残留量测定方法：分别进样稀释剂空白与对照品溶液6份，记录色谱图，mrm 180
→
106提取色谱图中主峰峰面积变化的rsd％不得过20.0％，按外标法以峰面积计算样品中2-(4-氨基苯基)丁酸的残留量；
[0093]
(5)测定结果
[0094]
专属性：2-(4-氨基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；定量限、检测限测试数据见表1所示：
[0095]
表1定量限、检测限测试数据
[0096][0097]
3批原料样品测试数据见表2所示：
[0098]
表2 3批原料样品测试数据
[0099][0100]
方法学考察及样品测定结果表明，本法专属性好、灵敏度高，可用于样品中该杂质的检测。典型对照品溶液图谱见附图1，典型样品溶液图谱见附图2(z191212批)。
[0101]
实施例2
[0102]
(1)除色谱柱、洗脱梯度外，其它色谱条件均同实施例1，色谱柱为zorbax sb-c8 3.0
×
100mm,1.8μm，洗脱梯度为：
[0103]
时间(min)0.01133.15溶剂a(％)9090109090溶剂b(％)1010901010
[0104]
(2)溶液配制及测定方法均同实施例1
[0105]
(3)进样及结果分析
[0106]
分别取稀释剂空白、对照品溶液(浓度为限度的30％，1.125ng/ml)、加标供试品溶液进样，记录色谱图。结果2-(4-氨基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；s/n为16.9，大于10。方法的专属性、灵敏度均可以满足样品中该杂质测定及限度制订的要求，表明方法可行。
[0107]
对比例1不同流动相体系对液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸灵敏度的影响
[0108]
(1)除流动相组成外，其它色谱条件均同实施例1；
[0109]
(2)设置以下二种流动相，考察对方法灵敏度的影响：
[0110]
流动相1溶剂a：水，溶剂b：乙腈；
[0111]
流动相2溶剂a：5mmol/l碳酸氢铵，溶剂b：乙腈；
[0112]
(3)溶液配制同实施例1；
[0113]
(4)进样及结果分析
[0114]
分别取稀释剂空白及对照品溶液(浓度为限度的30％，1.125ng/ml)进样，分别用这两种流动相梯度洗脱，记录色谱图。结果，峰拖尾且s/n分别为7.9、3.7，小于10。用这二种流动相测定，方法的灵敏度不能满足样品中该杂质测定及限度制订的要求。
[0115]
实施例3液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸
[0116]
(1)色谱条件
[0117]
仪器：安捷伦6470型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪
[0118]
色谱柱：acquity beh c18 2.1mm
×
50mm,1.7μm
[0119]
流动相：溶剂a：20mmol/l乙酸铵溶液；溶剂b：乙腈，按以下梯度进行洗脱：
[0120]
时间(min)0.011244.15溶剂a(％)909010109090溶剂b(％)101090901010
[0121]
稀释剂：甲醇
[0122]
流速：0.3ml/min
[0123]
柱温：35℃
[0124]
进样体积：2μl
[0125]
质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子扫描模式
[0126]
干燥气、雾化气、鞘气均为氮气；碰撞气为高纯氮；
[0127]
干燥气温度为：300℃
[0128]
干燥气流速为：6l/min
[0129]
雾化气压力:35psi
[0130]
鞘气温度：350℃
[0131]
鞘气流速：12l/min
[0132]
毛细管电压：-3500v
[0133]
喷嘴电压：-1000v
[0134]
mrm检测模式：定量离子对164
→
149，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)11v，驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0135]
定性离子对164
→
119，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)11，驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0136]
定性离子对164
→
93，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)17；驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0137]
(2)方法学考察
[0138]
参照中国药典2020年版9101分析方法验证指导原则-杂质限度检查，对本法的专属性、检测限、定量限进行考察；
[0139]
(3)溶液配制
[0140]
对照品贮备溶液：精密称取对照品10.02mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释
到刻度，摇匀，即得，浓度为99.92μg/ml；
[0141]
对照品溶液：取贮备液适量，用稀释剂稀释到限度浓度(18.75ng/ml)，摇匀，即得；
[0142]
定量限、检测限溶液：取对照品溶液适量，分别置100ml容量瓶中，用稀释剂稀释到刻度，摇匀，浓度分别为限度浓度的30％、25％、10％、5％、3％；
[0143]
供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料三批样品50.31、50.12、50.25mg，分别置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
[0144]
加标供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料样品50.22mg(z200203批)，置10ml容量瓶中，用对照品溶液溶解并稀释到刻度，摇匀，即得；
[0145]
(4)测定方法
[0146]
专属性测定方法：分别进样稀释剂空白、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液，空白溶液应无干扰，样品及样品中存在的杂质应无干扰；
[0147]
定量限、检测限测定方法：分别取稀释剂空白及测试溶液进样，记录色谱图，计算mrm 164
→
149提取色谱图中主峰信噪比，当信噪比约为3时对应浓度为检测限，当信噪比约为10时对应浓度为定量限；
[0148]
样品中2-(4-硝基苯基)丁酸残留量测定方法：分别进样稀释剂空白与对照品溶液6份，记录色谱图，mrm 164
→
149图谱中主峰峰面积变化的rsd％不得过20.0％，按外标法以峰面积计算样品中2-(4-硝基苯基)丁酸的残留量。
[0149]
(5)测定结果
[0150]
专属性：2-(4-硝基苯基)丁酸峰在此条件下能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；定量限、检测限测试数据见表3；
[0151]
表3定量限、检测限测试数据
[0152][0153]
3批原料样品测试数据见表4
[0154]
表4定量限、检测限测试数据
[0155][0156]
方法学考察及样品测定结果表明，本法专属性好、灵敏度高，可用于样品中该杂质的检测。典型对照品溶液图谱见附图3，典型样品溶液图谱见附图4(z191212批)。
[0157]
实施例4
[0158]
(1)除色谱柱、洗脱梯度外，其它色谱条件均同实施例3，色谱柱为zorbax sb-c8 3.0
×
100mm,1.8μm，洗脱梯度为：
[0159]
时间(min)0.0113.53.65溶剂a(％)9090109090溶剂b(％)1010901010
[0160]
(2)溶液配制及测定方法均同实施例3
[0161]
(3)进样及结果分析
[0162]
分别取稀释剂空白、对照品溶液(浓度为限度的30％，5.63ng/ml)、加标供试品溶液进样，记录色谱图。结果2-(4-硝基基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；s/n为15.2，大于10。方法的专属性、灵敏度均可以满足样品中该杂质测定及限度制订的要求，表明方法可行。
[0163]
对比例2
[0164]
不同流动相体系对液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸灵敏度的影响
[0165]
(1)除流动相组成外，其它色谱条件均同实施例3
[0166]
(2)设置以下二种流动相，考察对方法灵敏度的影响
[0167]
流动相1溶剂a：水，溶剂b：乙腈；
[0168]
流动相2溶剂a：5mmol/l碳酸氢铵，溶剂b：乙腈；
[0169]
(3)溶液配制同实施例3
[0170]
(4)进样及结果分析
[0171]
分别取稀释剂空白及对照品溶液(浓度为限度的30％，5.63ng/ml)进样，分别用这两种流动相梯度洗脱，记录色谱图。结果，峰拖尾，s/n分别为4.2、6.8，小于10。用这二种流动相测定，方法的灵敏度不能满足样品中该杂质测定及限度制订的要求。
[0172]
实施例5液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸
[0173]
(1)色谱条件
[0174]
仪器：安捷伦6470型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪
[0175]
色谱柱：acquity beh c18 2.1mm
×
50mm,1.7μm
[0176]
流动相：溶剂a：20mmol/l乙酸铵溶液；溶剂b：甲醇，按以下梯度进行洗脱：
[0177][0178]
稀释剂：20mmol/l乙酸铵-甲醇(85:15)溶液
[0179]
流速：1.0ml/min
[0180]
柱温：35℃
[0181]
进样体积：20μl
[0182]
质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子扫描模式
[0183]
干燥气、雾化气、鞘气均为氮气；碰撞气为高纯氮；
[0184]
干燥气温度为：300℃
[0185]
干燥气流速为：6l/min
[0186]
雾化气压力:35psi
[0187]
鞘气温度：350℃
[0188]
鞘气流速：12l/min
[0189]
毛细管电压： 4000v
[0190]
喷嘴电压： 500v
[0191]
mrm检测模式：
[0192]
定量离子对180
→
106，裂解电压(frag)119v，碰撞电压(ce)30v，驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0193]
定性离子对180
→
134，裂解电压(frag)115v，碰撞电压(ce)20，驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0194]
定性离子对180
→
93，裂解电压(frag)118v，碰撞电压(ce)32；驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0195]
(2)方法学考察
[0196]
参照中国药典2020年版9101分析方法验证指导原则-杂质限度检查，对本法的专属性、检测限、定量限进行考察；
[0197]
(3)溶液配制
[0198]
对照品贮备溶液：精密称取对照品10.03mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得，浓度为98.46μg/ml；
[0199]
对照品溶液：取贮备液适量，用稀释剂稀释到限度浓度(37.5ng/ml)，摇匀，即得；
[0200]
定量限、检测限溶液：取对照品溶液适量，分别置100ml容量瓶中，用稀释剂稀释到刻度，摇匀，浓度分别为限度浓度的30％、25％、10％、5％、3％；
[0201]
供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料三批样品100.8、100.2、100.5mg，分别置10ml容量瓶中，用dmso 5ml溶解用稀释剂稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
[0202]
加标供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料样品100.2mg(z200203批)，置10ml容量瓶中，用dmso 5ml溶解，加入适量的对照品贮备液，用稀释剂稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得供试品溶液，其中2-(4-氨基苯基)丁酸浓度为限度浓度(37.5ng/ml)；
[0203]
(4)测定方法
[0204]
专属性测定方法：分别进样稀释剂空白、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液，空白溶液应无干扰，样品及样品中存在的杂质应无干扰；
[0205]
定量限、检测限测定方法：分别取稀释剂空白及测试溶液进样，记录色谱图，计算mrm 180
→
106提取色谱图中主峰信噪比，当信噪比约为3时对应浓度为检测限，当信噪比约为10时对应浓度为定量限；
[0206]
样品中2-(4-氨基苯基)丁酸残留量测定方法：分别进样稀释剂空白与对照品溶液6份，记录色谱图，mrm 180
→
106提取色谱图中主峰峰面积变化的rsd％不得过20.0％，按外标法以峰面积计算样品中2-(4-氨基苯基)丁酸的残留量。
[0207]
(5)测定结果
[0208]
专属性：2-(4-氨基苯基)丁酸峰在此条件下能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；定量限、检测限测试数据见表5；
[0209]
表5定量限、检测限测试数据
[0210][0211]
3批原料样品测试数据见表6
[0212]
表6 3批原料样品测试数据
[0213][0214]
方法学考察及样品测定结果表明，本法专属性好、灵敏度高，可用于样品中该杂质的检测。典型对照品溶液图谱见附图5，典型样品溶液图谱见附图6(z191212批)。
[0215]
实施例6(1)除色谱柱、洗脱梯度外，其它色谱条件均同实施例5，色谱柱为zorbax sb-c8 3.0
×
100mm，1.8μm，洗脱梯度为：
[0216]
时间(min)0.0123.53.65溶剂a(％)7015157070溶剂b(％)3085853030
[0217]
(3)溶液配制及测定方法均同实施例3
[0218]
(3)进样及结果分析
[0219]
分别取稀释剂空白、对照品溶液(浓度为限度的30％，11.25ng/ml)、加标供试品溶液进样，记录色谱图。结果2-(4-氨基基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；s/n为21.2，大于10。方法的专属性、灵敏度均可以满足样品中该杂质测定及限度制订的要求，表明方法可行。
[0220]
对比例3不同稀释剂、不同进样体积对液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸色谱行为的影响
[0221]
(1)除稀释剂组成、进样体积增设5μl、10μl外，其它色谱条件均同实施例5；
[0222]
(2)设置以下三种稀释剂，考察对主峰色谱行为的影响：
[0223]
稀释剂1：甲醇；
[0224]
稀释剂2：乙醇；
[0225]
稀释剂3：dmso
[0226]
(3)溶液配制除了稀释剂分别更换为甲醇、乙醇、dmso外，其它均同实施例5；
[0227]
(4)进样及结果分析
[0228]
分别取三种稀释剂空白及三种不同稀释剂甲醇、乙醇、dmso的对照品溶液(浓度为限度的30％，11.25ng/ml)，分别进样5μl、10μl、20μl，记录色谱图。结果，进样10μl、20μl所得色谱图中，主峰裂分为不规则的多重峰。进样5μl所得色谱图中s/n分别为6.4、6.8、5.6，均小于10，方法的灵敏度不能满足样品中该杂质测定及限度制订的要求。
[0229]
实施例7液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸
[0230]
(1)色谱条件
[0231]
仪器：安捷伦6470型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪
[0232]
色谱柱：agilent eclipse xdb-c
18 4.6
×
150mm,5μm
[0233]
流动相：溶剂a：20mmol/l乙酸铵溶液；溶剂b：甲醇，按以下梯度进行洗脱：
[0234]
时间(min)0.0166.110溶剂a(％)90309090溶剂b(％)10701010
[0235]
稀释剂：20mmol/l乙酸铵-甲醇(90:10)溶液
[0236]
流速：1.0ml/min
[0237]
柱温：35℃
[0238]
进样体积：20μl
[0239]
质谱条件：采用电喷雾离子源，基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸采用正离子扫描模式，基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸采用负离子扫描模式；
[0240]
干燥气、雾化气、鞘气均为氮气；碰撞气为高纯氮；
[0241]
干燥气温度为：300℃
[0242]
干燥气流速为：6l/min
[0243]
雾化气压力:35psi
[0244]
鞘气温度：350℃
[0245]
鞘气流速：12l/min
[0246]
毛细管电压： 4000v；-3500v
[0247]
喷嘴电压： 500v；-1000v
[0248]
mrm检测模式：
[0249]
基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸定量离子对180
→
106，裂解电压(frag)118v，碰撞电压(ce)29v，驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0250]
基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸定性离子对180
→
134，裂解电压(frag)114v，碰撞电压(ce)19v，驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0251]
基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸定性离子对180
→
93，裂解电压(frag)116v，碰撞电压(ce)30；驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0252]
基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸定量离子对164
→
149，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)11v，驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0253]
基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸定性离子对164
→
119，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)11v，驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0254]
基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸定性离子对164
→
93，裂解电压(frag)90v，碰撞电压(ce)17；驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；(2)方法学考察
[0255]
参照中国药典2020年版9101分析方法验证指导原则-杂质限度检查，对本法的专属性、检测限、定量限进行考察；
[0256]
(3)溶液配制
[0257]
2-(4-氨基苯基)丁酸对照品贮备溶液：精密称取2-(4-氨基苯基)丁酸对照品10.02mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得，浓度为98.37μg/ml；
[0258]
2-(4-硝基苯基)丁酸对照品贮备溶液：精密称取2-(4-硝基苯基)丁酸对照品10.08mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得，浓度为100.52μg/ml；
[0259]
混合对照品溶液：取2-(4-硝基苯基)丁酸和2-(4-氨基苯基)丁酸的贮备液各适量，置同一容量瓶中，用稀释剂稀释使2-(4-硝基苯基)丁酸和2-(4-氨基苯基)丁酸的浓度均为限度浓度(37.5ng/ml)，摇匀，即得。
[0260]
定量限、检测限溶液：取对照品溶液适量，分别置100ml容量瓶中，用稀释剂稀释到刻度，摇匀，浓度分别为限度浓度的30％、25％、10％、5％、3％；
[0261]
供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料三批样品100.5、100.2、100.1mg，分别置10ml容量瓶中，各加5ml dmso溶解，用稀释剂稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
[0262]
加标供试品溶液：精密称取吲哚布芬原料样品100.2mg(z200203批)，置10ml容量瓶中，用dmso 5ml溶解，加入2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸的对照品贮备液各适量，用稀释剂稀释到刻度，0.45μm过滤，取续滤液，即得供试品溶液，其中2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸的浓度均为限度浓度(37.5ng/ml)；
[0263]
(4)测定方法
[0264]
专属性测定方法：分别进样稀释剂空白、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液，空白溶液应无干扰，样品及样品中存在的杂质应无干扰；
[0265]
定量限、检测限测定方法：分别取稀释剂空白及测试溶液进样，记录色谱图，计算mrm 180
→
106、mrm 164
→
149提取色谱图中主峰信噪比，当信噪比约为3时对应浓度为检测限，当信噪比约为10时对应浓度为定量限；
[0266]
样品中2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸残留量测定方法：分别进样稀释剂空白与对照品溶液6份，记录色谱图，mrm 180
→
106、mrm 164
→
149提取色谱图中主峰峰面积变化的rsd％均不得过20.0％，按外标法以峰面积计算样品中两杂质的残留量。
[0267]
(5)测定结果
[0268]
专属性：2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；
[0269]
定量限、检测限测试数据见表7
[0270]
表7定量限、检测限测试数据
[0271][0272]
3批原料样品测试数据见表8
[0273]
表8原料样品测试数据
[0274][0275]
方法学考察及样品测定结果表明，本法专属性好、灵敏度高，可用于样品中两杂质
的同时检测。其中定量限、检测限测试图谱分别见附图7，8；典型对照品溶液图谱见附图9，典型样品溶液图谱见附图10(z191212批)。
[0276]
实施例8
[0277]
(1)除色谱柱、洗脱梯度外，其它色谱条件均同实施例7，色谱柱为zorbax eclipse xdb-c8 4.6
×
150mm,5μm，洗脱梯度为：
[0278]
时间(min)0.0166.110溶剂a(％)90309090溶剂b(％)10701010
[0279]
(2)溶液配制及测定方法均同实施例7
[0280]
(3)进样及结果分析
[0281]
分别取稀释剂空白、对照品溶液(浓度为限度的30％，11.25ng/ml)、加标供试品溶液进样，记录色谱图。结果2-(4-氨基苯基)丁酸峰、2-(4-硝基苯基)丁酸峰在此条件下均能达到基线分离，空白溶液无干扰，样品及样品中存在的杂质无干扰；s/n分别为19.6、21.2，大于10。方法的专属性、灵敏度均可以满足样品中该杂质测定及限度制订的要求，表明方法可行。
[0282]
对比例4考察不同体系的流动相(流动相1)或相同体系不同ph流动相(流动相2、流动相3)对液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸灵敏度的影响
[0283]
(3)除流动相外，其它色谱条件同实施例7
[0284]
(4)设置以下三种流动相，考察对方法灵敏度的影响
[0285]
流动相1溶剂a：0.01％乙酸水溶液，溶剂b：乙腈；
[0286]
流动相2溶剂a：20mmol/l乙酸铵(用乙酸调节ph至6.0
±
0.1)，溶剂b：甲醇；
[0287]
流动相3溶剂a：20mmol/l乙酸铵(ph约6.8)，溶剂b：甲醇；
[0288]
稀释剂初始流动相
[0289]
分别按以下梯度进行洗脱：
[0290]
时间(min)0.0166.110溶剂a(％)90309090溶剂b(％)10701010
[0291]
(3)溶液配制
[0292]
同实施例7；
[0293]
(4)灵敏度测定方法
[0294]
分别取稀释剂空白及11.25ng/ml对照品溶液(相当于限度浓度的30％)进样，记录色谱图，计算mrm 180
→
106、mrm 164
→
149提取色谱图中主峰信噪比，判定方法的灵敏度。
[0295]
(5)测定结果
[0296]
灵敏度测试结果见表9，不同体系流动相对方法灵敏度的影响
[0297]
表9灵敏度测试结果
[0298][0299]
结果显示，用流动相1、流动相2按此梯度洗脱，对照品溶液图谱中(浓度为限度浓度的30％)，2-(4-硝基苯基)丁酸s/n均小于10，灵敏度不能满足样品检测及质量控制的要求。而用流动相3按此梯度洗脱，对照品溶液图谱中(浓度为限度浓度的30％)，2-(4-硝基苯基)丁酸和2-(4-氨基苯基)丁酸s/n均大于10，灵敏度可满足产品中2-(4-氨基苯基)丁酸、2-(4-硝基苯基)丁酸的检测及质量控制。
[0300]
对比例5考察不同的质谱检测模式(sim)对液质联用法分离测定吲哚布芬原料中基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸和2-(4-硝基苯基)丁酸专属性的影响
[0301]
(1)色谱条件
[0302]
仪器：安捷伦6470型高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪
[0303]
色谱柱：agilent eclipse xdb-c
18 4.6
×
150mm,5μm
[0304]
流动相：溶剂a：20mmol/l乙酸铵溶液；溶剂b：甲醇，按以下梯度进行洗脱：
[0305]
时间(min)0.0166.110溶剂a(％)90309090溶剂b(％)10701010
[0306]
稀释剂：20mmol/l乙酸铵-甲醇(90:10)溶液
[0307]
流速：1.0ml/min
[0308]
柱温：35℃
[0309]
进样体积：20μl
[0310]
质谱条件：采用电喷雾离子源，基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸采用正离子扫描模式，基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸采用负离子扫描模式；
[0311]
干燥气、雾化气、鞘气均为氮气；碰撞气为高纯氮；
[0312]
干燥气温度为：300℃
[0313]
干燥气流速为：6l/min
[0314]
雾化气压力:35psi
[0315]
鞘气温度：350℃
[0316]
鞘气流速：12l/min
[0317]
毛细管电压： 4000v；-3500v
[0318]
喷嘴电压： 500v；-1000v
[0319]
sim检测模式：
[0320]
基因毒性杂质2-(4-氨基苯基)丁酸选取质荷比(m/z)180，裂解电压(frag)118v，驻留时间(dwell)180ms，加速电压(cell acc)3v；
[0321]
基因毒性杂质2-(4-硝基苯基)丁酸选取质荷比(m/z)164，裂解电压(frag)90v，驻留时间(dwell)200ms，加速电压(cell acc)3v；
[0322]
(2)溶液配制
[0323]
同实施例7；
[0324]
(3)进样及结果分析
[0325]
分别取稀释剂空白及混合对照品溶液(限度浓度，11.25ng/ml)进样，记录色谱图。结果，峰形较差，s/n为2.2，小于10。用该模式测定，方法的灵敏度不能满足样品中这两种杂质测定及限度制订的要求。
[0326]
最后说明的是，以上实施例仅用以详细说明本发明的技术方案而非限制，本领域的专业技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。