pH测定方法和pH测定装置与流程

ph测定方法和ph测定装置
技术领域
1.本公开涉及测定溶液的ph值的ph测定方法和ph测定装置。


背景技术：

2.溶液的ph值在了解溶液状态方面是重要的因素。例如，在判断细胞培养液是否变质需要更换时，测定该培养液的ph值。在溶液中放入现有的ph计检测器测定溶液的ph值。此外，也预先在溶液中加入颜色相应于溶液的ph值变化的物质(ph指示剂)，通过目测或传感器观察溶液颜色的变化，相应于溶液的颜色求得ph值。例如，已知应用酚红试剂作为ph指示剂，目测观察细胞培养液中所含酚红试剂的显色反应，通过多种波长的光测定细胞培养液的吸光度，求得相应于测定的吸光度的ph值的技术(例如，参考专利文献1～3)。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：日本专利第5797911号
6.专利文献2：日本特开2019-106944号公报
7.专利文献3：日本特开2019-106945号公报
8.发明概述
9.发明要解决的问题
10.但是，目测观察溶液的状态需要时间，在多数容器中大量使用溶液时，操作者需要大量的劳动和操作时间。在溶液中放入现有的ph计检测器测定溶液的ph值时，存在污染溶液的担心。此外，为了去除污染溶液的担心将ph计检测器制成一次性时，需要许多费用，对在多数容器中大量管理溶液是不经济的。上述专利文献1～3中记载的以往技术中，由于应用多个波长的光，需要具备针对每个波长的多个传感器的昂贵装置，需要高昂的设备成本。
11.例如，由于生物工程领域等的发展细胞培养工业化时，为了培养大量的细胞，需要廉价地有效管理多数培养容器中的培养液。
12.因此，需要能够以廉价有效，没有污染溶液的担心的方法测定溶液的ph值的ph测定方法和ph测定装置。
13.用于解决课题的手段
14.本公开的实施方式涉及的ph测定方法包括：
15.向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射从发光元件发出的光的照射步骤，
16.用光接受元件接受透过溶液的透过光的光接受步骤，
17.测定接受的透过光之中单色光的吸光度的测定步骤，和
18.参考预先制成的吸光度表，算出与测定步骤中测定的吸光度对应的ph值的算出步骤。
19.本公开的实施方式涉及的ph测定装置以包含下列的方式构成：
20.向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射从发光元件发出的光的照射部，
21.接受透过溶液的透过光的光接受部，
22.测定接受的透过光之中单色光的吸光度的测定部，和
23.参考预先制成的吸光度表，算出与测定部中测定的吸光度对应的ph值的算出部。
24.发明效果
25.根据本公开的实施方式涉及的ph测定方法和ph测定装置，由于通过具有如上述的结构，测定接受的透过光之中单色光的吸光度，不需要具备与如以往的多个波长的光的每一个对应的滤色器和多个传感器，可以为具备单个传感器的结构。其结果，可以提供简化结构的ph测定方法和ph测定装置。因此，可以为结构简化的低成本的ph测定装置。此外，由于不需要在溶液中放入ph计等，可以不污染溶液，非常便宜简便地测定溶液的ph值。此外，可以非常便宜迅速地测定多数容器内的溶液的ph值。
26.附图简述
27.[图1]是显示本公开的实施方式涉及的ph测定方法的流程图的一个实例。
[0028]
[图2]是显示本公开的实施方式涉及的光电二极管的量子效率谱的一个实例的图。
[0029]
[图3]是显示本公开的实施方式涉及的ph测定方法的模式图。
[0030]
[图4]是显示本公开的实施方式涉及的培养液的吸收谱的一个实例的图。
[0031]
[图5]是显示本公开的实施方式涉及的溶液的ph和吸光度的关系的图。
[0032]
[图6]是显示本公开的实施方式涉及的ph测定方法的流程图的一个实例。
[0033]
[图7]是显示本公开的实施方式涉及的ph测定装置的框图的一个实例。
[0034]
[图8]是显示本公开的实施方式涉及的ph测定装置的框图的一个实例。
[0035]
用于实施发明的方式
[0036]
＜检测方法＞
[0037]
(第1实施方式)
[0038]
图1是第1实施方式的ph测定方法的流程图。第1实施方式涉及的ph测定方法包括：向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射从发光元件发出的光的照射步骤a1，用光接受元件接受透过溶液的透过光的光接受步骤a2，测定接受的透过光之中单色光的吸光度的测定步骤a3，和参考预先制成的吸光度表算出与测定步骤中测定的吸光度对应的ph值的算出步骤a4。
[0039]
以下，关于本实施方式的ph测定方法按顺序进行说明。
[0040]
本实施方式的照射步骤a1是向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射从发光元件发出的光的步骤。照射步骤a1通过例如led(发光二极管，light emitting diode)等发光元件实施，但结构不限。
[0041]
本说明书中，“ph指示剂”表示颜色相应于ph值变化的试剂，例如，可以是甲基橙，溴酚蓝，溴甲酚绿，溴百里酚蓝，酚红，百里酚蓝，酚酞等。ph指示剂可以预先添加到溶液中，观察伴随溶液的ph值变化的颜色变化，也可以在观察溶液的颜色之前立即添加到溶液中。
[0042]
本说明书中，“ph变动物质”表示使溶液的ph值变化的物质，例如，可以是细胞，生物组织等的生物物质。ph变动物质可以在加入溶液时立即使溶液的ph值变化，也可以逐渐使溶液的ph值变化。ph变动物质可以与ph指示剂同时加入溶液，也可以与ph指示剂分开加入溶液。例如，在包含ph指示剂的溶液中加入ph变动物质时，溶液的ph值根据ph变动物质变化，与其相应ph指示剂的颜色变化。在ph变动物质是细胞的情形中，细胞是动物细胞，植物
细胞，酵母细胞，细菌细胞等。作为动物细胞，有肌肉细胞，肝脏等内脏细胞，淋巴细胞，单核细胞和粒细胞等血液细胞，神经细胞，免疫细胞，人工诱导多能干细胞(ips细胞：诱导多能干细胞)等。这些细胞可以是来自组织的原代细胞，或也可以是传代培养细胞。ips细胞是在人的皮肤等体细胞中导入数种基因培养，从而保有如es细胞(embryonic stem cell：胚胎干细胞)的能够分化为各种组织和脏器的细胞的分化全能性(多能性，pluripotency)，和经过分裂增殖也能够维持其的自身复制能力即几乎无限增殖能力的细胞。本实施方式涉及的ph测定方法和ph测定装置适于针对包含增殖能力高的ips细胞，即溶液的成分等的变化大的ips细胞的所述溶液。
[0043]
本说明书中，“溶液”表示液体状态的均一混合物，例如，可以是水溶液，甲醇溶液，乙醇溶液等。更具体地，溶液可以是缓冲液，培养液等。溶液除了ph指示剂和ph变动物质还可以包含辅助物质。辅助物质可以是磷、钠等金属离子，肽，氨基酸，蛋白质等。在溶液是培养液的情形中，其在微生物和细胞等生物组织的培养中为培养对象提供生长环境，成为葡萄糖等碳源，蛋白胨、硫酸铵等氮源，氨基酸，维生素，磷酸盐等无机盐类等营养物质的供给源。此外，作为培养液，由包含细胞培养所需的上述营养成分的液体构成，或也可以在该液体中加入琼脂、明胶等。
[0044]
本实施方式的光接受步骤a2是用光接受元件接受透过溶液的透过光的步骤。光接受步骤a2优选地通过作为pin结构的非晶硅光电二极管形成的光接受元件实施，但结构不限。
[0045]
pin结构的光电二极管是三层结构的光电二极管，在pn结之间具有i层(本征层，intrinsic layer)，是接合了pin的三种半导体的光电二极管。在pn结构的光电二极管中，pn结附近产生没有电子也没有空穴的耗尽层，在pin结构的光电二极管中，是替代耗尽层预先制备没有电子也没有空穴的i层的结构。
[0046]
对于在光电二极管中使用的材料，例如，可以使用硅，锗，铟，镓，砷，硫化铅等。根据检测的光的波长适当地选择这些材料。硅吸收190～1100nm的波长，锗吸收400～1700nm的波长，铟、镓和砷吸收800～2600nm的波长，硫化铅吸收1000～不足3500nm的波长。非晶硅表示非晶质硅，具有比晶体硅高的吸光系数。如图2所示，非晶硅光电二极管在约560nm附近的波长显示最高的量子效率(内部量子效率)。在图2中，黑色圆圈标记表示光接受面侧具有的p 层的厚度是10nm时的量子效率，黑色方形标记表示p 层的厚度是20nm时的量子效率，黑色三角标记表示p 层的厚度是30nm时的量子效率。p 层的厚度增大时，针对绿色光的波长范围以外的波长范围的光的量子效率有降低倾向，是优选的。因此，p 层的厚度可以为10nm以上，更优选可以为20nm以上，进一步优选可以为20nm至30nm。
[0047]
测定步骤a3测定接受的透过光之中单色光的吸光度。
[0048]
本说明书中，“单色光”表示仅包含1种波长或规定波长范围的光，不被光谱进一步分解的光，例如，可以是红色光或红色光范围，蓝色光或蓝色光范围，绿色光或绿色光范围。单色光优选绿色光或绿色光范围。即，如图4所示，因为绿色光或绿色光范围伴随溶液的ph变化吸光度的变化大。规定波长范围例如保有包含中心波长的宽度的波长范围，以中心波长
±
波长带范围宽表示。本实施方式的ph测定方法和ph测定装置中，优选560nm左右作为绿色光的波长，560nm
±
40nm左右作为绿色光范围的波长范围，更优选可以为560nm
±
20nm左右。优选通过接受单色光的波长范围的光，光接受灵敏度(接受且光电转换的信号的强度)
变大。
[0049]
本实施方式中，对于ph指示剂，溶液的ph值降低时，规定波长范围的吸光峰减少，光接受元件在上述规定波长范围中量子效率可为最高。由此，可以高灵敏度检测吸光峰的减少，可以高灵敏度且高精度测定溶液的ph值。
[0050]
算出步骤a4是参考预先制成的吸光度表，算出与测定步骤中测定的吸光度对应的ph值的步骤。
[0051]
本说明书中，“吸光度表”表示显示溶液的ph值与溶液的吸光度的关系的数据，例如存储在存储部(存贮部)的数据。该存储部可为个人计算机(pc)，独立的大容量存储装置，usb存贮器等便携式存贮装置等中具备的存储电路(存贮电路)，ic，lsi等存贮部。存贮电路和存贮部可为ram(随机存取存储器，random access memory)，rom(只读存储器，read only memory)等。
[0052]
作为本公开的一个实施方式，图3显示应用细胞培养液作为溶液，应用酚红作为ph指示剂，应用细胞作为ph变动物质，应用非晶硅光电二极管作为光接受元件的模式图。酚红是一般的细胞培养液中包含的ph指示剂，在430～440nm附近和560nm附近具有吸收峰(图4)。作为具体的酚红，可以应用例如富士胶片和光纯药(株式会社)制造的“0.04w/v％酚红溶液”(酚红的分子式：c
19h14
o5s，分子量:354.38)。作为该酚红溶液的配制方法，例如，在酚红0.10g中加入0.02mol/l的氢氧化钠溶液14.2ml和水成为250ml的方法等。包含酚红的细胞培养液在细胞的最适ph的ph6.8～7.2(中性)为红色，随着细胞培养进行ph降低时，430～440nm附近的吸收峰增加，560nm附近的吸收峰减少，即变色为黄色。在图4中，符号1(实线)表示新溶液的吸光度，符号2(虚线)和符号3(一点划线)表示细胞培养进行的细胞培养液的吸光度，符号4(二点划线)表示交换前细胞培养液的波长。
[0053]
酚红的吸收谱中，绿色的560nm的波长的吸收成为酸性时变化大。pin结构的非晶硅光电二极管的量子效率也在560nm附近的波长最高，因此，可以没有滤色器或复杂机制而检测颜色的变化。由非晶硅光电二极管检测的光被存储为电荷，通过读取其电荷量检测颜色的变化。
[0054]
将测定的绿色光的吸光度与预先制成的吸光度表的吸光度比较。以下的表1是吸光度表的一个实例。
[0055]
[表1]
[0056]
光源 λ560nm
[0057]
phc1c2c371.801.701.661.601.551.4851.511.461.4141.421.381.33
[0058]
细胞培养液的ph与560nm的吸光度的关系在图5显示。吸光度a与酚红的浓度c具有以下的数学式1所示的关系。
[0059]
a＝α
×
l
×
c ···
(1)
[0060]
此处，α表示吸光系数(摩尔吸光系数：单位：l/(mol
·
cm))，l表示液体中的光路长。l
×
c变大时，吸光度a也变大，l
×
c变小时，吸光度a也变小。此外，吸光系数α由酚红的酸
型成分(hx)的吸光系数αhx和碱型成分(x-)的吸光系数αx组成，某波长λ的吸光度a作为酸型成分(hx)的吸光度和碱型成分(x-)的吸光度的和以a＝αhx
×
[hx] αx
×
[x-]([hx]：酸型成分的浓度，[x-]：碱型成分的浓度)表示。即使酚红的浓度c＝[hx] [x-]恒定，ph变化时酸型成分(hx)和碱型成分(x-)的浓度比变化，吸光度a变化。另外，表1中，l是0.1mm～10mm左右，例如可为l＝3mm。此外，关于c1，c2，c3，c1＞c2＞c3，酚红溶液中酚红的浓度可设定为0.01w/v％～0.1w/v％左右的范围内。例如，可为c1＝0.08(w/v％)，c2＝0.05，c3＝0.02。
[0061]
参考数种细胞培养液的初期状态的变化(l
×
c的变化)的ph变动引起的吸光度变化量作为数据表，通过测定细胞培养液的初期的吸光度和细胞培养液中的吸光度的变化，可以推定细胞培养液的ph值。
[0062]
作为本实施方式的变形实例，在照射步骤前，可以进一步包含在溶液中维持ph变动物质的维持步骤。由此，可以确保用于使ph变动物质改变溶液的ph值的时间。
[0063]
本说明书中，“维持”表示将ph变动物质在溶液中以原样状态保持，或在用于使ph变动物质改变溶液的ph值的充足时间内将ph变动物质在溶液中保持。
[0064]
关于第1实施方式的ph测定方法的一个实例，参考图6所示的流程图在以下说明。另外，在图6中，判断控制中的“成功”(标志1)以“是”表示，“失败”(标志0)以“否”表示。
[0065]
以下，顺着这些流程对ph测定方法进行说明。
[0066]
首先，在步骤b1，测定溶液的初期的吸光度。
[0067]
接着，在步骤b2中，参考步骤b5的吸光度表，算出与测定的吸光度对应的ph值。
[0068]
此外，在步骤b3中，在与测定的吸光度对应的ph值达到步骤b6中读出的目标ph值的情形中，转移到步骤b4，输出数据，鸣动警报通知达到目标ph值。或者，可以在pc中具备的图像显示装置(显示器)中显示或基于鸣动显示警报。
[0069]
此外，警报可以传送到细胞培养的实施者携带的智能手机，智能手表等移动设备。此情形中，通过移动设备中振动，发光，告知的显示等传送方法，可以传送警报。
[0070]
在步骤b3中，在与测定的吸光度对应的ph值未达到目标ph的情形中，参考步骤b7中的采样间隔的数据表读取采样间隔，判断是否达到步骤b8中的采样时间，即细胞培养液是否达到交换时期。采样间隔的数据表可以是存储采样执行时刻的时刻存储部(时刻存贮部)，存储从前次采样执行时刻起的经过时间的经过时间存储部(经过时间存贮部)等。
[0071]
在步骤b8中达到采样时间的情形中，在步骤b9测定吸光度后，移动到步骤b2，重复前述步骤b3，b7，b8，重复直至在步骤b3中达到目标ph。
[0072]
通过以上结构，实施方式的ph测定方法可以不需要操作者的劳动和时间，有效地测定ph。
[0073]
＜测定装置＞
[0074]
(第2实施方式)
[0075]
图7是显示本公开的第2实施方式的ph测定装置100的功能结构的框图。本公开的第1实施方式涉及的测定方法由ph测定装置100执行。
[0076]
本实施方式的ph测定装置100包括：向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射从发光元件发出的光的照射部10，接受透过溶液的透过光的光接受部20，测定接受的透过光之中单色光的吸光度的测定部30，和参考预先制成的吸光度表算出与测定部30测定的吸光度对应的ph值的算出部40。
[0077]
照射部10包含用于向包含ph指示剂和ph变动物质的溶液照射光的发光元件，但结构不限。例如，照射部10可以是能够发出且照射包含单色光的波长范围的光的那种，是led发光装置，电致发光装置，半导体激光装置，荧光灯等。
[0078]
包含ph指示剂和ph变动物质的溶液可以收纳在由光学透明的玻璃，塑料等构成的容器中。容器由例如培养皿，烧瓶，多孔板等组成。容器的形状、大小等没有特别限定，只要是用于细胞培养的容器，可以具有1个以上适于细胞增殖的空间。例如，如果是培养皿，宽度或直径为数cm～数10cm左右，高度为数mm～数cm左右，如果是烧瓶，宽度或直径为数cm～数10cm左右，高度为5cm～数10cm左右，如果是多孔板，宽度或直径为数cm～数10cm左右，高度为0.5cm～数cm左右。容器以可以从外部观察内部的方式由上述光学透明的材料例如塑料、玻璃等材料构成。此外，对于多孔板，1个孔的平面视图形状为圆形，正方形等四边形，五边形、六边形等多边形等。圆形为适合细胞的各向同性增殖的形状，有细胞容易增殖的优点。六边形是适合孔的最密配置的形状，有利于多孔板的小型化。
[0079]
光接受部20可以是包含接受透过光的光接受元件的装置，但结构不限。例如，光接受部20包含上述pin结构的光电二极管等光接受元件。在照射部10配置于收纳包含ph指示剂和ph变动物质的溶液的容器上方的情形中，光接受部20可以配置于容器的下方。此外，光接受部20可以在由玻璃基板，塑料基板等构成的检测基板上具备通过cvd(化学气相沉积，chemical vapor deposition)法等薄膜形成法形成的光接受元件，此外，也可以将该检测基板配置于容器中的容器底面。
[0080]
此情形中，由于将光接受元件，电极和电路布线等在检测基板上通过薄膜形成配置，可以将薄型化和小型化的光接受部20在溶液中配置。其结果，可以直接且高精度检测ph变动物质的ph值的变动。此外，由于能够低成本制造薄型化和小型化的光接受部20，容器中充分进行细胞培养并完成细胞培养时，可以废弃使用过的光接受部20。然后，应用该容器开始新的细胞培养时，可以将未使用的光接受部20配置于容器中。即，也可以在每次实施细胞培养时替换光接受部20。
[0081]
此外，可以是整个检测基板覆盖以由氮化硅(si3n4)、氧化硅(sio2)等构成的绝缘性无机保护膜的结构。由此，可以抑制检测基板污染溶液。此外，此情形中，可以将使用过的光接受部20洗涤等再次在细胞培养中使用。
[0082]
测定部30可以通过包含信号转换元件的装置等实现，但结构不限，其中信号转换元件基于从光接受元件输出的信号取得预定信号值。测定部30通过有线通信方式或无线通信方式取得从光接受元件输出的信号。例如，测定部30可以是具备ad转换部和信号存储部(信号存贮部)的pc等电子设备，其中所述ad转换部取得与通过光接受部20接受的透过光之中单色光的吸光度对应的信号(光电转换信号)并将该信号的电压值或电流值ad(模拟至数字，analog to digital)转换，所述信号存储部(信号存贮部)存储ad转换的数字信号。
[0083]
算出部40可以通过具有参考预先制成的吸光度表，算出与在测定部30测定的吸光度对应的ph值的演算功能的计算机实现，但结构不限。例如，算出部40可以是由容纳pc等电子设备内具备的算出用程序软件的ic，lsi等组成的演算处理电路部(中央处理器，center of processing unit；简称cpu)等。
[0084]
(第3实施方式)
[0085]
图8是显示本公开的第3实施方式的ph测定系统200的功能的构成的框图。本公开
的第1实施方式涉及的测定方法由ph测定系统200执行。
[0086]
ph测定系统200具备：数据输入部1，与数据输入部1连接的ph演算系统2，与ph演算系统2连接的数据输出部3，和与ph演算系统2连接的测定系统4。
[0087]
数据输入部1中，容纳与目标ph值，初期ph值，采样间隔，监测开始指示有关的数据，向ph演算系统2传送数据。
[0088]
ph演算系统2中，容纳吸光度数据表，向测定系统4传送测定指示，比较通过测定系统4测定的吸光度的测定数据和吸光度数据表，向数据输出部3传送比较数据。
[0089]
如果比较数据达到目标ph值，数据输出部3鸣响警报。
[0090]
测定系统4在接受来自ph演算系统2的测定指示时测定溶液的吸光度。将测定的吸光度作为测定数据传送到ph演算系统2。
[0091]
以上，对本公开的实施方式进行详细说明，此外，本公开不限于上述实施方式，在不脱离本公开的主旨的范围内，可以进行各种变更、改良等。不言而喻，分别构成上述各实施方式的全部或一部分可以在适当、不矛盾的范围内组合。
[0092]
符号说明
[0093]1ꢀꢀꢀꢀꢀ
数据输入部
[0094]2ꢀꢀꢀꢀꢀ
ph演算系统
[0095]3ꢀꢀꢀꢀꢀ
数据输出部
[0096]4ꢀꢀꢀꢀꢀ
测定系统
[0097]
10
ꢀꢀꢀꢀ
照射部
[0098]
20
ꢀꢀꢀꢀ
光接受部
[0099]
30
ꢀꢀꢀꢀ
测定部
[0100]
40
ꢀꢀꢀꢀ
算出部