具有可控光谱形状的复合高亮度荧光团及使用复合高亮度荧光团的方法

具有可控光谱形状的复合高亮度荧光团及使用复合高亮度荧光团的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年9月30日提交的美国临时申请序列号62/908,023、于2020年6月1日提交的国际申请号pct/us2020/035568和于2020年6月1日提交的国际申请号pct/us2020/035574的优先权。美国临时申请序列号62/908,023、国际申请号pct/us2020/035568和国际申请号pct/us2020/035574的全部内容通过援引并入本文。
3.政府支持声明
4.本文所述的发明是在国家科学基金会(national science foundation)授予的grant#1261910、grant#1521057和grant#1738466的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

5.荧光团是具有生物医学应用的具有荧光特性的化合物。例如，荧光团可以用作示踪剂或染料，用于对某些分子或结构染色。更具体地，荧光团可以用于在各种分析方法诸如荧光成像和光谱中对组织、细胞或生物材料染色。
6.流式细胞术(fcm)可以每秒计数和分选数千个细胞，并且可以用于对生物标志物表型。对于这样的应用，每种类型的生物标志物都用荧光团特异性标记。通过标记特异性生物标志物，可以通过量化来自标记在生物标志物上的特异性荧光实体的荧光信号来量化特异性生物标志物的群体。常规fcm使用带通滤波器，仅在每种荧光实体的荧光波长范围的峰附近连续分离和检测信号。光谱流式细胞术(光谱fcm)通过使用一系列许多检测器在整个检测窗口中从一种或多种荧光团收集连续荧光光谱。因此，光谱fcm也可以通过荧光光谱的形状来区分信号。


技术实现要素：

7.根据本公开的示例性实施方式的化合物，除其他可能外，包括：具有与载体连接的第一端的第一接头，具有与所述载体连接的第一端的第二接头，具有与所述载体连接的第一端的第三接头，与所述第一接头的第二端连接的第一荧光实体，不同于所述第一荧光实体的与所述第二接头的第二端连接的第二荧光实体，以及与所述第三接头的第二端连接的生物分子。所述生物分子被配置为与生物标志物连接。
8.在前述的另外实例中，所述载体是氮化硼纳米管(bnnt)或碳纳米管(cnt)。
9.在前述任一项的另外实例中，所述载体是纳米点。
10.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个的所述第一端与所述载体共价结合。
11.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个的所述第一端包括官能团，并且所述官能团将所述接头与所述载体共价结合。
12.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个的所述第
二端经由官能团与所述第一和第二荧光实体之一或所述生物分子共价结合。
13.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个的所述第一端与所述载体非共价结合。
14.在前述的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个是两亲的，并且包括疏水区和亲水区。所述疏水区与所述载体非共价结合。
15.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个具有约1000至10000da之间的分子量。
16.在前述任一项的另外实例中，所述载体是氮化硼纳米管。
17.在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个的至少一个是dspe-pegn(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[(聚乙二醇)n])，其中，n是peg链中聚乙二醇(peg)分子的数目。
[0018]
检测根据本公开的示例性实施方式的生物标志物的方法，除其他可能外，包括向样品提供多个荧光团，所述多个荧光团中的每一个包括与载体连接的生物分子、第一荧光实体和第二荧光实体。所述生物分子被配置为与所述样品中的多个生物标志物相互作用。所述生物分子被配置为与所述样品中的多个生物标志物相互作用。所述方法还包括用激光激发所述样品中的所述多个荧光团并且基于由激发的多个荧光团发射的荧光光谱检测所述样品中的所述多个生物标志物的特性和量中的至少一种。
[0019]
在前述任一项的另外实例中，所述第一和第二荧光实体以及所述生物分子通过第一、第二和第三接头与所述载体连接。所述第一、第二和第三接头中的至少一个经由共价键与所述载体连接。
[0020]
在前述任一项的另外实例中，其中，所述第一和第二荧光实体以及所述生物分子分别通过第一、第二和第三接头与所述载体连接。所述第一、第二和第三接头中的至少一个经由非共价键与所述载体连接。
[0021]
在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个是两亲的，并且包括疏水区和亲水区。所述疏水区与所述载体非共价结合。
[0022]
在前述任一项的另外实例中，所述第一、第二和第三接头中的至少一个具有约1000至10000da之间的分子量。
[0023]
在前述任一项的另外实例中，所述载体是氮化硼纳米管。
[0024]
在前述任一项的另外实例中，所述多个荧光团是第一多个荧光团，所述生物标志物是第一生物标志物，并且所述生物分子是第二生物分子，并且进一步包括向样品提供第二多个荧光团，所述第二多个荧光团中的每一个包括与载体连接的第二生物分子、第三荧光实体和第四荧光实体。所述第二生物分子被配置为与所述样品中的第二多个生物标志物相互作用。所述第二荧光团连与所述第二生物分子连接。
[0025]
在前述任一项的另外实例中，所述第二多个荧光团被所述激光激发，并且进一步包括基于由激发的第二多个荧光团发射的荧光光谱检测所述样品中第二多个生物标志物的特性和量中的至少一种。
附图说明
[0026]
图1a示意性地示出抗体缀合的高亮度荧光团结构。
[0027]
图1b示意性地示出染料-接头结构。
[0028]
图1c示意性地示出抗体-接头结构。
[0029]
图2a示出来自以相同荧光强度发射的染料1和染料3的模拟荧光信号。
[0030]
图2b示出来自由染料1和染料3组成的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0031]
图2c示出来自以相同荧光强度发射的染料4和染料6的模拟荧光信号。
[0032]
图2d示出来自由染料4和染料6组成的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0033]
图3a示出来自相同荧光强度的染料1、2和3的模拟荧光信号。
[0034]
图3b示出来自由染料1、2和3组成的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0035]
图3c示出来自相同荧光强度的染料4、5和6的模拟荧光信号。
[0036]
图3d示出来自由染料4、5和6组成的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0037]
图4a示出来自由在1:1:1.5的强度比率下发射的染料1、2、3组成的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0038]
图4b示出来自具有在1:1.5:1的强度比率下发射的染料1、2、3的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0039]
图4c示出来自具有在1.5:1:1的强度比率下发射的染料1、2、3的复合荧光团的模拟荧光信号。
[0040]
图5a示出fitc、srd和cy5染料的实验吸收带(实线)和荧光带(虚线)。出于说明目的，所有曲线都以相同尺度归一化。
[0041]
图5b示出在1:1:1的染料-接头浓度比率下通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是这些复合荧光团在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0042]
图5c示出在1:1:2的染料-接头浓度比率下通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是这些复合荧光团在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0043]
图5d示出在1:4:1的染料-接头浓度比率下通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是这些复合荧光团在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0044]
图6a比较了使用不同染料浓度比率通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在492nm处激发。
[0045]
图6b比较了使用不同染料浓度比率通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在568nm处激发。
[0046]
图6c比较了使用不同染料浓度比率通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在647nm处激发。
[0047]
图7a示出在1:1:1比率的染料-接头浓度下通过共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0048]
图7b示出在2:2:1比率的染料-接头浓度下通过共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0049]
图7c示出在2:1:1比率的染料-接头浓度下通过共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。实线、点线和虚线曲线是在492nm、568nm和647nm处激发的实际荧光信号。
[0050]
图8a比较了使用不同染料浓度比率通过共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在492nm处激发。
[0051]
图8b比较了使用不同染料浓度比率通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在568nm处激发。
[0052]
图8c比较了使用不同染料浓度比率通过非共价官能化制备的由fitc、srd和cy5染料组成的复合荧光团的荧光信号。所有信号都在647nm处激发。
具体实施方式
[0053]
非常一般地，高亮度荧光团包含载体元件、荧光元件和将载体元件连接至荧光元件的接头。对于生物医学应用，载体元件、接头和荧光元件中的每一种都必须是生物相容的(尽管对生物相容性的要求会因特定应用而变化)。
[0054]
一种实例载体元件是纳米材料，诸如碳纳米管(cnt)和氮化硼纳米管(bnnt)，它们两者被认为是用于生物医学应用诸如细胞药物递送和光谱学应用的生物学上相容的纳米材料。然而，已经示出与纳米管连接的荧光元件表现出淬灭或荧光亮度的降低。
[0055]
已经发现，具有纳米材料载体的某些荧光团不仅不表现出淬灭效应，而且表现出比其他已知荧光团高几个数量级的亮度，如在以下中所述：于2018年4月13日提交的美国专利申请序列号15/953,200，并公开为美国专利公开号2018/0296705；于2020年6月1日提交的国际申请号pct/us2020/035568；以及国际申请号pct/us2020/035574。美国专利申请序列号15/953,200、国际申请号pct/us2020/035568和pct/us2020/035574的全部内容通过援引并入本文。
[0056]
现在参考图1a，示意性地示出了荧光团20。荧光团20通常包括无机或有机纳米级载体22、接头24、荧光实体26以及生物分子28(诸如抗体)。可以选择抗体/生物分子28以与生物标志物，包括细胞壁、细胞外囊泡(诸如胞外体)等上的生物标志物相互作用。实例生物标志物包括表面标志物诸如cd9、cd127以及细胞内标志物等。这种相互作用将荧光团20与生物标志物连接，使得可以通过检测荧光团20的荧光光谱的形状来检测(和计数、识别等)生物标志物，如下文更详细讨论的。
[0057]
在一个实例中，载体22是氮化硼纳米管(bnnt)或碳纳米管(cnt)载体。载体22可以通过任何已知方法制造。
[0058]
在特定的实例中，载体22是多壁bnnt或cnt载体，其中，每个bnnt或cnt具有六边形氮化硼(对于bnnt的h-bn)或石墨烯(对于cnt)的多个同轴壳，具有大于约1nm但小于约80nm的典型外径。这些bnnt和cnt的长度在约1-5000nm之间。在其他实例中，载体22可以是另一种纳米级无机材料，诸如氮化硼(h-bn)纳米片/纳米颗粒和石墨烯/石墨纳米片/纳米颗粒。还考虑了氮化硼纳米点和碳纳米点。在一个实例中，如国际申请号pct/us2020/035574中更全面描述的，纳米点通过机械搅拌处理以促进在点的纳米结构中形成瑕疵，这些瑕疵促进/实现与接头24的结合，这继而使更多的接头24和因此更多的荧光实体26能够结合至纳米点并改进所得荧光团20的荧光。
[0059]
现在参考图1b，接头24在一个实例中是两亲聚合物接头。也就是说，接头24包括疏水区25和亲水区27。疏水区25与纳米管载体22非共价结合，而亲水区27上的官能团与荧光体26(或另一实体，如将在下面讨论)共价结合。一种实例接头24是dspe-peg
n-nh2(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)n])，其中，n是peg链中聚乙二醇(peg)分子的数目。其他接头24可以类似地包括长度不同的peg链(或不同的链)。
[0060]
现在参考图1c，疏水区25与纳米管载体22非共价结合，而亲水区27上的官能团与抗体28(或另一生物分子，诸如核酸等)共价结合。一个实例接头24是dspe-peg
n-马来酰亚胺(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)n])，其中，n是peg链中聚乙二醇(peg)分子的数目。其他接头24可以类似地包括长度不同并且可以具有各种官能团的peg链(或不同的链)。
[0061]
在一个实例中，如专利申请序列号15/953,200中更全面描述的，接头24具有大于约1000da(对于具有peg链的接头24，其对应于约5-10nm的延伸接头长度)并且小于约10000da的分子量，与现有技术的荧光团相比，这允许所得荧光团20的改进的荧光。在另外实例中，接头24的分子量大于约2400da并且小于约10000da。
[0062]
除了上面讨论的dspe-peg接头24之外，许多其他潜在的接头在本领域中是已知的。例如，接头24可以包括选自以下的一个或多个基团：-ch2-、-ch＝、-c≡、-nh-、-n＝、o-、-nh2-、-n3-、-s-、-c(o)-、-c(o)2-、-c(s)-、-s(o)-、-s(o)2-或其任何组合。应当理解，将选择包括多于一个上文基团的接头，使得接头24是稳定的；例如，接头24可以不包括两个相邻的-o-基团，这会生成不稳定的过氧化物键。接头24可以是直链、支链，或者可以包括一个或多个环体系。非限制性示例性接头包括疏水区域，其可以是脂肪酸、磷脂、鞘脂、鞘磷脂[诸如dspe、1-o-十六烷基-2-o-(9z-十八烯基)-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(铵盐)、n-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)5000、d-赤型-鞘氨醇磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸、3-sn-磷脂酰-l-丝氨酸(ps)、糖基磷脂酰肌醇、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺但不限于此)。疏水单元可以用于与水溶性聚合物链诸如peg(或peo聚环氧乙烷)、pmo(聚甲基噁唑啉)、pei(聚乙烯亚胺)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、多肽、碳水化合物锚缀合。水溶性聚合物链在一端与接头连接，并且在第二端与荧光实体(或另一部分，如下文所述)连接。这些疏水性和亲水性单元必须具有如上提及的反应性基团并且使得这些基团缀合在一起形成两亲性接头。
[0063]
在另一实例中，如国际申请号pct/us2020/035574中更全面描述的，荧光团20可以通过将接头24共价官能化到载体22上来创建。在该实例中，接头24包括与载体22相互作用的官能团“r”和与连接于载体22的其他部分如荧光染料分子26和抗体28相互作用的官能团“r
’”
。该实例中的这种接头24不一定是两亲的(并且可能有或可能没有疏水/亲水区25/27)，尽管它可能是这样的。另外，在一些实例中，多个接头24可以彼此串联连接。实例官能团是叠氮化物基团，但会考虑任何已知的官能团。在国际申请号pct/us2020/035574中描述的另外实例中，载体22诸如通过在极性液体中的机械搅拌进行处理，以在载体22的纳米结构中形成瑕疵，该瑕疵促进/使得经由官能团r与接头24结合。
[0064]
荧光实体26是任何已知的荧光染料，包括但不限于香豆素类、苯并噁二唑类、吖啶酮类、吖啶类、双苯亚胺类(bisbenzimides)、吲哚、苯并异喹啉、萘、蒽、呫吨、芘、卟啉、荧光素、罗丹明、硼-二吡咯亚甲基(bodipy)和花青衍生物。许多这样的荧光染料是可商购的。荧
光实体26通过任何合适的方法与接头24结合。
[0065]
本文所述的任何高亮度荧光团20(“hfb”)可以在每个载体22上包括多于一种类型的荧光实体26以创建“复合荧光团”。例如，图2a示出两种实例荧光染料26“染料1”和“染料3”的荧光光谱。这些染料具有与异硫氰酸荧光素(fitc)和花菁-5(cy5)相似的发射光谱，峰发射分别在～515nm和665nm处。
[0066]
在“染料1”和“染料3”以相同的荧光强度(1:1的比率)发射的情况下，具有这些染料的复合荧光团20的荧光光谱将如图2b中示出，具有两个峰。
[0067]
在另一实例中，复合荧光团20包括两种其他的实例染料，“染料4”和“染料6”，其具有与上面实例不同的荧光光谱，并且与上面实例相比，光谱峰之间的间距相对更窄，如图2c中示出。在该实例中，“染料4”和“染料6”模拟alexa 555和alexa 568的发射光谱，具有的峰发射分别在～573nm和603nm处。
[0068]
在“染料4”和“染料6”以相同的荧光强度(1:1的比率)发射的情况下，由这些染料组成的复合荧光团20的荧光光谱将如图2d中示出，与图2b中示出的那些相比，具有两个更接近的峰。在这种情况下，由于光谱与相邻光谱的尾部重叠，603nm处的第二个峰的强度更高(如图2c中示出)。
[0069]
因此，已经发现由不同类型的染料制成的复合荧光团20将产生具有不同的、可识别的形状的荧光光谱，如图2b和2d中示出。
[0070]
作为另一实例，复合荧光团20可以包括具有不同荧光光谱的三种类型的染料1、2、3，如图3a中示出。在本实例中，染料1、2、3模拟异硫氰酸荧光素(fitc)、磺酰罗丹明b(srd)和花菁-5(cy5)的发射光谱，具有的峰发射分别在～515nm、588nm和665nm处。
[0071]
在“染料1”、“染料2”和“染料3”以相同的荧光强度(在1:1:1的比率下)发射的情况下，由这些染料组成的复合荧光团20的荧光光谱将如图3b中示出，具有三个峰。如所示出，由于光谱与相邻光谱的尾部重叠，峰588nm的强度高于如图3a中示出的单独染料2(图3a)。
[0072]
作为另一实例，复合荧光团20可以包括染料4、5、6，与图3c中示出的前述实例相比，它们具有不同的荧光光谱和更窄的光谱峰之间的间距。这些染料4、5、6模拟alexa 555、srd和alexa 568的发射光谱，具有的峰发射分别在～573nm、585nm和603nm处。这些发射峰之间的间距为约12nm至18nm。
[0073]
在“染料4”、“染料5”和“染料6”以相同的荧光强度(在1:1:1的比率下)发射的情况下，由这些染料组成的复合荧光团20的荧光光谱将如图3d中示出。如所示出，由于各个发射峰的间距接近，所有三个单独的光谱合并成具有独特形状的宽光谱。
[0074]
如图3b和3d所示，染料的选择和它们的发射峰之间的间距影响包括染料的复合荧光团20的荧光光谱形状。
[0075]
在另一实例中，复合荧光团20可以包括以彼此不同的荧光强度发射的染料。图4a示出具有1:1:1.5荧光强度比率的染料1、2、3的合并光谱。图4b示出具有1:1.5:1的荧光强度比率的染料1、2、3的合并光谱。图4c示出具有1.5:1:1的荧光强度比率的染料1、2、3的合并光谱。如所示出，尽管这些复合荧光团20包括同一组染料，但所有所得光谱的形状是独特的。复合荧光团20的荧光光谱的形状取决于在特定激发激光源/波长下各个染料的荧光强度比率。
[0076]
图5a示出在每个载体22上具有三种类型染料26的复合荧光团20的归一化吸收带
(实线)和荧光带(虚线)。在该实例中，载体22是bnnt载体。光谱1和2分别是fitc的吸收和荧光光谱。光谱3和4分别是srd的吸收和荧光光谱。光谱5和6分别是cy5的吸收和荧光光谱。
[0077]
图5b示出这些复合荧光团20分别在492nm(实线)、568nm(点线)和647nm(虚线)处激发的荧光信号。
[0078]
由于492nm处的激光完全在fitc的吸收带(图5a中的光谱1)内，检测到来自520nm处的fitc的强荧光，如图5b中的实线光谱示出，具有的长尾由srd(588nm)和cy5(665nm)的弱荧光贡献。492nm激光不应导致srd和cy5的发射，因为激发激光远离它们的吸收带(图5a中分别为光谱3和5)。因此，来自588nm处的srd的小荧光是被来自fitc的荧光激发。同样，来自665nm处的cy5的小荧光是被来自srd的荧光激发。
[0079]
这些复合荧光团20在568nm激发的荧光信号(图5b中的点线光谱)描述如下。568nm激光激发srd并导致588nm处的强发射，具有665nm处cy5的弱荧光尾。该568nm激光不应激发fitc和cy5，因为激发激光远离它们的吸收带。因此，来自665nm处的cy5的小荧光是被来自srd的荧光激发。
[0080]
这些复合荧光团20在647nm处激发的荧光信号(图5b中的虚线光谱)描述如下。647nm激光仅激发cy5染料并导致665nm处的强发射。
[0081]
如图5b中示出，在被不同的激光激发时，复合荧光团20的荧光光谱的形状不同。
[0082]
图5c和5d总结了用于制造复合荧光团20的染料浓度的影响。将染料浓度定义为每单位体积合成溶液的染料分子数。
[0083]
图5c示出分别在492nm(实线)、568nm(点线)和647nm(虚线)处激发的复合hbf 20的荧光信号。这些复合hbf 20是通过使用fitc、srd和cy5染料分子以1:1:2的浓度比率混合制造的。所用的总染料浓度与上面针对图5b描述的那些相同。
[0084]
图5d示出复合hbf 20分别在492nm(实线)、568nm(点线)和647nm(虚线)处激发的荧光信号。这些复合hbf 20是通过使用fitc、srd和cy5染料分子以1:4:1的浓度比率混合制造的。所用的总染料浓度与针对图5b和5c描述的那些相同。
[0085]
如所示出，由于这些hbf 20具有不同的染料浓度比率，即使总染料浓度相同，在被492nm处的激光激发时，图5c和5d中的实线光谱在形状上是不同的。为了比较的目的，在图6a中一起示出在492nm处激发的所有光谱。如所示出，具有不同染料浓度比率(1:1:1、1:1:2、1:4:1)但具有相同的总染料浓度的复合hbf 20即使在被相同的激光波长激发时，也会发射具有不同光谱形状的荧光。当比较所有点线光谱(图6b，在568nm处激发)或所有虚线光谱(图6c，在647nm处激发)时，情况也是如此。
[0086]
上面讨论的任何实例复合荧光团20可以包括bnnt作为载体22，以及dspe-peg 5000作为接头24，如于2018年4月13日提交的美国专利申请序列号15/953,200并公开为美国专利公开号2018/0296705中所述。
[0087]
在另一实例中，荧光团20包括与载体22和荧光实体26共价结合的接头24，如上所述。这些示例荧光团20因此通过共价官能化制备。例如，荧光团20包括三种不同类型染料的混合物：fitc、srd和cy5染料分子，以三种浓度比率(1:1:1、2:2:1、2:1:1)，分别如图7a、7b和7c中示出。用于三种复合hbf 20中的每一种的总染料浓度是相同的。
[0088]
如图7a中示出，使用不同的激发激光(492nm、568nm和647nm)将导致不同的光谱形状，如在1:1:1的染料浓度比率的情况下分别由实线、点线和虚线光谱所示。
[0089]
如图7b中示出，使用不同的激发激光(492nm、568nm和647nm)将导致不同的光谱形状，如在染料浓度2:2:1比率的情况下分别由实线、点线和虚线光谱所示。
[0090]
如图7c中示出，使用不同的激发激光(492nm、568nm和647nm)将导致不同的光谱形状，如在染料浓度2:1:1比率的情况下分别由实线、点线和虚线光谱所示。
[0091]
图8a比较了在492nm处激发的以1:1:1、2:2:1、2:1:1染料浓度比率制备的复合荧光团20的光谱形状。如所示出，具有1:1:1比率的染料-接头24/26浓度比率的复合荧光团20的光谱形状与具有2:2:1的染料-接头24/26浓度比率的那些和具有2:1:1比率的染料-接头24/26浓度比率的那些非常不同。具有2:2:1和2:1:1比率的样品的光谱形状分别类似于srd和cy5染料，并且不能被492nm很好地激发。
[0092]
图8b比较了在568nm处激发的具有1:1:1、2:2:1和2:1:1的染料-接头24/26浓度比率的复合荧光团20的光谱形状。如所示出，所有这些光谱的形状都不同。
[0093]
图8c比较了在647nm处激发的具有1:1:1、2:2:1和2:1:1的染料-接头24/26浓度比率的复合荧光团20的光谱形状。如所示出，所有这些光谱的形状都不同。
[0094]
因此，本文所述的复合荧光团20的光谱根据所选择的激发激光而变化。
[0095]
本文所述的复合荧光团20可以用于流式细胞术。对于常规流式细胞术(fcm)，一种或多种生物标志物经由如上所述的生物分子28用独特的荧光团20(诸如如上所讨论的复合荧光团20)标记。荧光团20被激光激发，使得荧光团20发出荧光并发射可检测的光子。常规fcm使用带通滤波器来连续分离并检测仅在每个荧光实体的荧光波长范围的峰附近的与光子相关的信号。通过标记特异性生物标志物，可以通过量化来自标记在一种或多种生物标志物上的独特荧光实体20的荧光信号来量化那些生物标志物的群体。
[0096]
在光谱流式细胞术(光谱fcm)中，在预定的检测窗口(例如，波长范围)内检测样品的荧光光谱。样品中的荧光实体20各自具有独特的荧光光谱，其可以如本领域已知的那样被检测和识别，例如通过光谱分离，以便识别和量化样品中的生物标志物。
[0097]
通常，对于光谱fcm，在检测速度、灵敏度和光谱分辨率之间存在折衷。例如，为了在合理的短检测持续时间内收集许多数据点，每个信号的检测时间都会非常短。然而，因为本文所述的荧光团20具有如此高的荧光强度，所以需要较少的激光暴露(例如时间)来获得可记录的荧光信号。因此，本文所述的荧光团20允许光谱fcm用于高通量应用。此外，因为复合荧光团20可以包括两种、三种或更多种荧光实体26，这些荧光实体26被选择以在以各种量组合时产生具有独特荧光光谱的荧光团20，所以可以用容易获得的荧光染料制备许多不同的荧光团20，每一个都具有独特的荧光光谱。
[0098]
前面的描述本质上是示例性的而不是限制性的。对所公开的实例的变化和修改对本领域技术人员而可以变得显而易见，而不必背离本发明的本质。本发明的法律保护范围只能通过研究以下权利要求来确定。