RAL抑制剂防治骨关节炎

ral抑制剂防治骨关节炎
技术领域
1.本发明提供了一种活性因子，具体地，涉及一种用于防治骨关节炎的活性因子。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis，oa)是全球最普遍的关节疾病，60岁以上的人群中超过10％的男性及18％的女性罹患此病。已有数据表明，在发达国家oa所造成的社会经济负担巨大，可占gdp的1％-2.5％。随着我国逐步进入老龄化社会，我国60岁以上人群中膝骨性关节炎的患病率为35％-50％，并呈逐年升高趋势。目前对于该病的防治缺乏有效手段，在疾病早期采用理疗、非甾体类抗炎药(nsaid)和关节腔注射玻璃酸钠、糖皮质激素类药物等方法仅能缓解临床症状；而终末期多进行关节置换术，术后存在假体松动等并发症可能，给患者及其家庭带来沉重的经济和心理负担。
3.目前研究表明oa发病机制复杂，其发病机制尚不明了。研究表明下肢异常负荷、衰老、创伤等多种因素会引起关节内滑膜炎症及炎症因子分泌(tnf-a、il-1β、il-6等)、关节软骨稳态失衡，基质金属蛋白酶(mmps)释放、自由基产生以及软骨细胞凋亡、进而导致软骨和软骨下骨的丢失、退变，即软骨细胞合成分解代谢失衡。目前oa临床药物主要包括：1)消炎止痛药，如双氧芬酸钠、塞来昔布等；2)改善骨关节炎软骨的药物，如氨基葡萄糖；3)膝关节注射药物，如玻璃酸钠等，主要是减轻炎症、保护、润滑和滋养软骨的作用。但对于引起oa的根本原因：关节软骨的进行性退变和消失缺乏靶向防治方案。
4.目前进入临床试验阶段的oa药物主要分为靶向骨与软骨、靶向神经以及靶向免疫调节等方向。靶向治疗骨与软骨的代表性药物为二膦酸盐类(bisphosphonates)、雷尼酸锶(strontium ranelate)、重组人成纤维细胞生长因子18(rhfgf-18,sprifermin)、wnt通路抑制剂(lorecivivint、组织蛋白酶k抑制剂(miv711)等，均可通过不同机制促进软骨基质合成，防止oa进展。靶向神经类药物主要有关节内注射用辣椒素(cntx-4975)、抗神经生长因子单克隆抗体(tanezumab,fasinumab)等，可通过缓解疼痛减轻患者症状。而靶向免疫调节的药物主要为羟氯喹(hydroxychloroquine)、肿瘤坏死因子抑制剂(adalimumab,etanercept)、白介素1α/β抑制剂(anakinra,lutikizumab)
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、甲氨蝶呤(methotrexate)等，此类药物通过免疫调节减轻炎症反应进而治疗oa。上述进入临床实验的药物疗效有待证实。在oa防治研究中，发现oa新的防治靶点、并针对其进行药物研发，针对oa机制进行精准防治，调节软骨细胞合成代谢和分解代谢是oa防治的方向。


技术实现要素：

5.在本发明的研究中，经蛋白质谱分析，并对其进行临床软骨组织标本验证后发现，ral在oa软骨组织中明显高表达，在oa发生发展过程中，ral发挥负性调控作用，而抑制其表达后可明显促进软骨细胞合成代谢并抑制分解代谢。对此我们认为，ral在oa发生发展中具有重要作用，通过抑制其表达，可对软骨细胞代谢起正性保护作用。ral抑制剂(抑制物)可作为防治oa的创新药物。
6.基于上述发现，本发明提供了一种新的针对oa病症的治疗因子或药物。具体如下：
7.本发明提供了一种活性因子的用途，其特征在于：
8.上述活性因子选自如下a-d所示物质中的一种或几种的混合：
9.rbc8；
10.rbc8的同分异构体；
11.rbc8的衍生物；
12.rbc8的立体异构体，几何异构体，互变异构体，消旋体，水合物，溶剂化物，代谢产物以及药学上可接受的盐或前药中的一种或几种；
13.上述用途包含如下用途中的至少一种：
14.用于制备对关节软骨具有保护作用的药物；
15.用于制备延缓软骨退变的药物。
16.此外，本发明还发现了一种活性因子的用途，其特征在于：
17.上述rbc8的衍生物选自bqu57或其类似物。
18.此外，本发明还发现了一种活性因子的用途，其特征在于：
19.上述活性因子选自ral抑制剂一种或几种的混合；
20.上述用途包含如下用途中的至少一种：
21.用于制备对关节软骨具有保护作用的药物；
22.用于制备延缓软骨退变的药物。
23.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
24.上述活性因子还用于制备降低软骨细胞炎症因子的释放的药物。
25.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
26.上述活性因子还用于制备防止软骨细胞外基质降解的药物。
27.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
28.上述活性因子还用于制备抑制炎症状态下软骨组织分解代谢，同时促进合成代谢的药物。
29.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
30.上述活性因子还用于制备能与ral-gdp复合体结合的药物或成分。
31.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
32.上述活性因子还用于作为抑制ral与其效应器ralbp1的结合的药物或成份。
33.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
34.上述活性因子还用于制备促进软骨合成代谢(如促进软骨合成代谢标志物acan、ii型胶原等的表达)的药物。
35.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
36.上述活性因子还用于制备抑制基质金属蛋白酶(mmps,如mmp-3，mmp-13)的药物。
37.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
38.上述活性因子还用于制备抑制nf-κb通路的激活的药物。
39.进一步地，本发明提供的上述活性因子的用途，其特征还在于：
40.上述药物为经胃肠道给药剂型或经胃肠道以外给药途径剂型。
41.本发明的作用和效果：
42.ras为ras超家族的5个亚家族之一，该超家族包含约150种gtp酶，通过结合并水解gtp而发挥其分子生物学作用。ral则因与ras存在高度相似的编码序列从而命名为ras like(ral)蛋白，而ral存在两个亚型ral与ralb，两者具有几乎相同的编码序列，行使相似的生物学功能，仅三维结构中的c末端的高变区存在差异。ral作为gtp酶，主要分布于细胞膜，同样具有结合并水解gtp的作用，当细胞内gtp浓度大于gdp 10倍时，在ral guanine nucleotide exchange factors(ralgef)的辅助下ral与gtp结合而激活，激活后的ral-gtp复合体通过与其受体ralbp1的结合从而启动下游信号通路，之后在ral gtpase activating proteins(ralgap)的催化下失活为ral-gdp复合体。简而言之，当ral与gtp结合为激活状态，而与gdp结合为失活状态，从而发挥其“分子开关”作用，调节下游通路。
43.ralb可与secretory 5(sec5)形成复合体直接募集并活化非典型iκb家族成员tbk1，而在初始免疫过程中，tbk1的活化又可激活nf-κb通路，导致转录因子p65入核启动下游转录翻译，合成分泌细胞因子。
44.nf-κb为经典的炎症通路，非激活状态下，nf-κb蛋白由p65和p50两个亚单位组成的复合体形式为主存在于胞内，并与其抑制物iκb以非共价结合的方式形成无活性的三聚体。在上游刺激下可激活iκb激酶(iκbkinase，ikk)，导致iκb的降解，促使p65解离并磷酸化，进入细胞核内发挥转录因子作用。在oa组织中因该通路的激活而导致炎症因子il-1β、tnf-a、il-6的表达，同时炎症因子的分泌将进一步激活nf-κb通路，形成循环放大的过程，最终破坏软骨细胞合成与分解代谢平衡，导致软骨组织发生oa。
45.基于上述理论设想，在本发明尝试采用ral的特异性抑制剂，发现其能通过与ral-gdp复合体结合，抑制其与受体ralbp1的耦合，继而抑制ral生理作用。同步利用rbc8(一种ral的特异性抑制剂)进行实验发现(如图1所示)，il-1β诱导小鼠原代软骨细胞oa模型后采用rbc8进行干预，发现抑制ral后可促进软骨合成代谢标志物acan的表达并在一定浓度下抑制mmp-3的合成。证明了ral抑制剂rbc8具有明显的关节软骨保护作用。
46.故而，在本发明提出，ral在oa退变软骨中表达增高，在oa的发生发展中起重要作用，而抑制ral的表达，可通过抑制下游重要信号如nf-κb通路的激活降低软骨细胞炎症因子的释放，防止软骨细胞外基质降解，进而延缓软骨退变。
附图说明
47.图1.ral gtp酶的gdp-gtp循环。
48.图2.ral在人oa退变软骨组织种高表达。
49.其中，(a)番红-快绿，阿尔新蓝检测显示与正常对照相比，oa组关节软骨退变、细胞外基质含量减低；免疫组化染色检测与正常对照相比，oa组关节软骨中ral高表达(黑色箭头指示检测阳性反应)，免疫荧光检测也显示oa组关节软骨细胞中ral高表达(绿色为阳性表达)；
50.(b)western blot显示检测oa致病重要炎症因子il-1β在10ng/ml及20ng/ml时，均可刺激软骨细胞高表达ral；
51.(c)western blot检测10ng/ml il-1β在刺激软骨细胞12h以上，均可刺激ral的高表达；
52.(d)实时荧光定量pcr检测显示，与正常对照相比，oa组关节软骨中ral高表达。“***”表示p＜0.001。
53.图3.ral抑制剂rbc8抑制软骨退变。
54.其中，(a)rbc8分子结构式；
55.(b)检测不同浓度rbc8对软骨细胞活性的影响；
56.(c)western blot检测rbc8对关节软骨细胞col2、acan和mmp13蛋白表达的影响，结果发现rbc8明显挽救oa致病重要炎症因子il-1β对于col2、acan的抑制效应，促进oa病理条件下软骨合成代谢因子col2、acan的表达，抑制oa病理条件下软骨分解代谢因子基质金属蛋白酶mmp-13的表达。
57.(d)免疫荧光结果显示rbc8促进oa病理条件下关节软骨细胞合成代谢因子col2的表达。
58.(e)免疫荧光结果显示rbc8促进oa病理条件下关节软骨细胞合成代谢因子acan的表达。
59.(f)免疫荧光结果显示rbc8抑制oa病理条件下关节软骨细胞分解代谢因子mmp13的表达。
60.图4.软骨组织块培养显示rbc8可明显抑制关节软骨退变。
61.图5.bqu57防治软骨退变,保护关节软骨。
62.(a-b)western blot结果。
63.(c)免疫荧光结果。
64.(d)免疫荧光结果。
具体实施方式
65.一、验证退变软骨组织及细胞中ral表达情况的实验方法
66.(1)收集临床中因膝骨性关节炎行全膝关节置换术病人的关节软骨，依据软骨组织是否破坏、是否光滑分为相对正常组和oa组，如软骨表面凹凸不平呈颗粒状，局部可见软骨下骨，则为oa组；如软骨表面光滑呈瓷白色或微黄色，无软骨损伤，为相对正常组。通过western blot及免疫荧光检测ral表达情况；
67.其中，
68.关于western blot的具体方法如下：
69.1.1组织蛋白提取
70.1)把组织剪切成小碎片
71.2)按照每20mg组织加入200μl ripa裂解液(申能博彩，中国)的比例加入裂解液，若需高浓度蛋白，可相应减少裂解液。
72.注：所有细胞/组织样品裂解后，12000g，4度离心10分钟，小心转移上清至新ep管，此蛋白可至于-80度冰箱长期保存。
73.1.2蛋白定量
74.1)利用bca蛋白检测试剂盒(invitrogen,usa)对蛋白进行定量。完全溶解蛋白标准品，取适量25mg/ml蛋白标准，用ripa裂解液稀释至终浓度为0.5mg/ml。
75.2)根据样品数量，按bca试剂a加1体积，bca试剂b 50体积(1:50)配制适量bca工作液，充分混匀。
76.3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，加标准品稀释液补足到20μl。
77.4)各孔加入200μl bca混合液，37℃放置30分钟。
78.5)用酶标仪测定od562nm吸光值，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
79.1.3蛋白变性
80.定量后的蛋白与sds page loading buffer(takara,japan),按4:1比例共混，100度煮沸5分钟。变性后的样品可置于负80度长期保存。
81.1.4蛋白电泳
82.1)清洗玻璃板，晾干后至于制胶架。
83.2)按照sds-page凝胶快速配制试剂盒(雅酶，中国)说明书先制备分离胶，具体浓度根据蛋白量制定。
84.3)在放置好的制胶板内缓慢延玻璃板加入7ml分离胶，不能有气泡。之后加入2ml无水乙醇封住分离胶，等待20分钟至分离胶凝固，倒去乙醇并吸干。
85.4)在按照sds-page凝胶快速配制试剂盒说明书制备浓缩胶，再次延玻璃板加入足量浓缩胶至刚刚冒顶，插入梳子，等待约15分钟浓缩胶可凝固，轻轻竖直向上拔出梳子。
86.5)制胶后，将胶和玻璃板放置于电泳槽中，加入1x电泳缓冲液(雅酶，中国)。根据蛋白定量结果(每孔约20μg)，计算上样体积，每孔延壁缓慢加入蛋白样本。其中蛋白分子量标准物(碧云天，中国)加入5μl。
87.6)随后先90v电泳30分钟后，120v电泳1-2小时。
88.1.5转膜封闭
89.1)电泳结束后，胶需放在tbst(雅酶，中国)中润洗2分钟后，再放入转膜液(雅酶，中国)中浸泡5分钟。
90.2)将剪好的pvdf膜，在甲醇中浸泡5s，在转膜液中平衡5分钟。
91.3)从正极至负极按照“白架子-海绵-滤纸-pvdf膜-胶-滤纸-海绵-黑架子”的顺序放置转膜复合物，彻底清除内部的气泡。
92.4)冰浴转膜，300ma恒流，4℃转膜2小时，将分离胶上的蛋白质转印到pvdf膜。
93.5)转膜结束后，丽春红染色5分钟，tbst漂洗3-5分钟，重复2-3次，剪下目的蛋白附近的条带。
94.6)用5％bsa(生工，中国)(1x tbst配制，5g 100ml)室温封闭1小时。
95.1.6抗体孵育
96.1)封闭结束后，以封闭液(5％bsa的1x tbst溶液)配制一抗，膜在4℃摇床孵育过夜。
97.2)孵育结束后，1x tbst漂洗5分钟，重复3次。
98.3)以封闭液配制荧光二抗(li-cor，usa)(根据一抗选择种属)，室温摇床孵育1h。
99.4)孵育结束后，1x tbst漂洗5分钟，重复3次。
100.1.7蛋白检测
101.1)将膜放置到odyssey双色红外激光成像系统内拍照。
102.关于免疫荧光方法具体如下：
103.1)石蜡切片常规脱蜡和水化，二甲苯两次每次10-20分钟，梯度酒精100％-95％-85％-75％，每次5分钟。
104.2)tbst洗涤三次，每次3分钟。
105.3)切片放入湿盒中，用无尘纸巾吸除组织周围的水分，根据不同抗体的要求，对组织抗原进行相应修复45分钟。
106.4)tbst清洗3次，每张切片滴加足够的3％h2o2溶液(30％h2o2和甲醇按照1：9的比例配制，12张切片配1ml)，室温下孵育10分钟，以阻断组织内内源性的过氧化物酶的活性。
107.5)tbst洗涤三次，每次5分钟。去除组织周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈。5％bsa室温封闭1h
108.6)移除封闭液，tbst洗涤三次，每次5分钟。根据不同抗体的要求，用5％bsa稀释一抗mmp13(abcam,1:200,ab39012),type x collagen(abcam,1:1000,ab58632),gfp(abcam,1:1000,ab290))。每张切片加50μl一抗，4℃过夜。
109.7)去除一抗，tbst洗涤三次，每次5分钟。
110.8)加荧光二抗(abcam,1:1000,usa)。避光室温孵育1小时。
111.9)去除二抗，加入dapi染色液(博士德，中国)室温孵育10分钟。
112.10)用tbst在室温漂洗三次，每次5分钟。
113.11)用封片剂(博士德，中国)封片，在荧光显微镜下观察结果。
114.(2)通过预染番红固绿，观察软骨损伤程度，依据oarsi评分对收集的软骨组织分级(o，1，2，3，4，5，6级)，在对不同病理程度的软骨分别提取总rna，检测ral mrna表达水平与疾病进展程度是否相关。由于人软骨组织软骨细胞稀疏，细胞外基质成分过多，采用传统trizol法提取总rna粘多糖污染较多，难以纯化总rna。所以利用激光显微切割仪将单细胞或细胞群落切割收集满50mg后进行总rna提取；
115.其中，
116.关于番红固绿染色方法具体如下：
117.1)将人软骨组织包埋、切片、脱蜡至水：二甲苯i10min，二甲苯ii 10min(脱蜡过程，脱蜡要彻底)；100％乙醇i 5min，100％乙醇ii 5min；95％酒精i 5min，95％乙醇ⅱ中5min；85％乙醇中5min；75％乙醇中5min；自来水涮洗。
118.2)自来水冲洗30秒；
119.3)固绿(sigma,germany)(0.1％固绿溶液：称取0.5g番红粉末，用500ml去离子水溶解)染色5分钟；
120.4)自来水冲洗1分钟；
121.5)番红(sigma,germany)(0.2％番红溶液：称取1g番红粉末，用500ml去离子水溶解)染色5分钟；
122.6)1％冰醋酸分色1秒；
123.7)95％乙醇脱水1分钟，2次；
124.8)100％乙醇脱水2分钟，2次；
125.9)二甲苯透明5分钟，2次；
126.10)中性树胶封固。
127.关于oarsi评分标准：
128.0级：正常软骨；
129.0.5级：无组织结构改变的番红o染色丢失；
130.1级：无软骨丢失表层出现微小纤维化；
131.2级：垂直裂隙向下至表层软骨，合并部分表层软骨丢失；
132.3级：垂直裂隙/缺损到达钙化软骨，影响关节面＜25％；
133.4级：垂直裂隙/缺损到达钙化软骨，影响关节面25-50％；
134.5级：垂直裂隙/缺损到达钙化软骨，影响关节面50-75％；
135.6级：垂直裂隙/缺损到达钙化软骨，影响关节面＞75％
136.7(3)小鼠原代软骨细胞分离培养：取3天内出生乳鼠，水合氯醛麻醉过量至死，浸泡于75％乙醇15min消毒，取乳鼠双下肢，仔细分离去除膝关节周围肌肉韧带，去除粉红色股骨及胫骨，仅保留膝关节透明软骨，如小米粒大小，切碎呈肉泥状，泡于0.2％ii型胶原酶37℃摇床消化4-6h至组织消失或培养液明显浑浊后终止消化，离心重悬后接种于培养皿中，传至p1-p2代使用。通过不同浓度梯度il-1β诱导小鼠原代oa软骨细胞模型，检测ral是否高表达及与退变程度是否相关；
137.分组如下：
138.①
nc组；
139.②
il-1β组(5ng/ml)；
140.③
il-1β组(10ng/ml)；
141.④
il-1β组(20ng/ml)；
142.二、验证抑制/过表达ral对软骨细胞代谢和软骨组织细胞外基质的影响的实验方法
143.2-1.体外实验：
144.(1)构建ral敲减sirna转染小鼠atdc5细胞系，western blot检测软骨细胞合成代谢指标：col2a1、acan、sox9及分解代谢指标：mmp-3、mmp-13、adamts5的表达，同时收集培养基进行elisa检测软骨细胞il-1β、tnf-a、il-6分泌情况；
145.(2)构建ral过表达质粒转染小鼠atdc5细胞系，western blot检测软骨细胞合成代谢指标：col2a1、acan、sox9及分解代谢指标：mmp-3、mmp-13、adamts5的表达，同时收集培养基进行elisa检测软骨细胞il-1β、tnf-a、il-6分泌情况；
146.(3)组织块培养：无菌分离小鼠股骨头软骨分别进行组织块培养(如图4)，2-3天更换培养液，同时加入il-1β诱导软骨内细胞退变，持续作用2周，治疗组在il-1β诱导基础上加入ral抑制剂rbc8干预2周。2周后收集组织块进行病理学分析：番红固绿染色、阿尔新兰染色检测软骨细胞外基质改变，免疫组化检测软骨组织细胞及细胞外基质合成代谢指标：col2a1、acan、sox9及分解代谢指标：mmp-3、mmp-13、adamts5的表达；
147.分组如下：
148.①
nc组；
149.②
il-1β组；
150.③
il-1β rbc8组
151.其中，
152.关于构建ral敲减sirna/过表达质粒转染小鼠atdc5细胞系的方法如下：
153.1)atdc5细胞系生长支70-90％汇合度时转染；
154.2)使用opti-mem无血清培养基(thermofisher,usa)125ul稀释lipo3000试剂(thermofisher,usa)3.75ul并充分混匀(两管)；
155.3)使用opti-mem无血清培养基250ul稀释dna(吉玛基因，中国)5ug，制备dna预混液(若转染过表达质粒需添加p3000 10ul)，充分混匀；
156.4)在每管已稀释的lipo3000中加入稀释的dna(1：1比例)，室温孵育10-15min；
157.5)将孵育后的dna-脂质复合物加入细胞中；
158.6)37℃孵育细胞2-4天后，分析转染细胞，进行下游检测。
159.关于elisa试剂盒：
160.1)按照elisa试剂盒(碧云天，中国)操作，计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内。
161.2)配制标准品并绘制出标准曲线，同时设置本底较正孔，该孔只加tmb溶液和终止液。
162.3)分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温孵育120分钟。
163.4)洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
164.5)加入生物素化抗体100μl/孔,用封板膜封住反应孔，室温孵育60分钟。
165.6)洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
166.7)加入辣根过氧化物酶标记streptavidin 100μl/孔。用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。
167.8)洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
168.9)加入显色剂tmb溶液100μl/孔，用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。
169.10)加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量a450值。
170.(4)bqu57的干预实验(如图5)
171.细胞培养及药物干预
172.3)将atdc5细胞接种于六孔板；
173.4)bqu(0.1um,1um)预处理24小时，之后il-1β(20ng/ml)干预12小时；
174.5)收集蛋白用于后续研究。
175.western blot检测
176.2.1蛋白提取
177.1)使用预冷pbs将贴壁细胞清洗三次；
178.2)按照每孔加入100μl裂解液的比例加入裂解液，若需高浓度蛋白，可相应减少裂解液。
179.注：所有细胞样品裂解后，12000g，4度离心10分钟，小心转移上清至新ep管，此蛋白可至于-80度冰箱长期保存。
180.2.2蛋白定量
181.6)利用bca蛋白检测试剂盒对蛋白进行定量。完全溶解蛋白标准品，取适量25mg/ml蛋白标准，用ripa裂解液稀释至终浓度为0.5mg/ml。
182.7)根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀。
183.8)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，加标准品稀释液补足到20μl。
184.9)各孔加入200μl bca混合液，37℃放置30分钟。
185.10)用酶标仪测定od562nm吸光值，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
186.2.3蛋白变性
187.定量后的蛋白与sds page loading buffer按4:1比例共混，100度煮沸5分钟。变性后的样品可置于负80度长期保存。
188.2.4蛋白电泳
189.7)清洗玻璃板，晾干后至于制胶架。
190.8)按照sds-page凝胶快速配制试剂盒说明书先制备分离胶，具体浓度根据蛋白量制定。
191.9)在放置好的制胶板内缓慢延玻璃板加入7ml分离胶，不能有气泡。之后加入2ml无水乙醇封住分离胶，等待20分钟至分离胶凝固，倒去乙醇并吸干。
192.10)在按照sds-page凝胶快速配制试剂盒说明书(碧云天，p0012ac)制备浓缩胶，再次延玻璃板加入足量浓缩胶至刚刚冒顶，插入梳子，等待约15分钟浓缩胶可凝固，轻轻竖直向上拔出梳子。
193.11)制胶后，将胶和玻璃板放置于电泳槽中，加入1x电泳缓冲液。根据蛋白定量结果(每孔约20μg)，计算上样体积，每孔延壁缓慢加入蛋白样本。其中蛋白分子量标准物(碧云天，p0066)加入5μl。
194.12)随后先90v电泳30分钟后，120v电泳1-2小时。
195.2.5转膜封闭
196.7)电泳结束后，胶需放在tbst中润洗2分钟后，再放入转膜液中浸泡5分钟。
197.8)将剪好的pvdf膜，在甲醇中浸泡5s，在转膜液中平衡5分钟。
198.9)从正极至负极按照“白架子-海绵-滤纸-pvdf膜-胶-滤纸-海绵-黑架子”的顺序放置转膜复合物，彻底清除内部的气泡。
199.10)冰浴转膜，300ma恒流，4℃转膜2小时，将分离胶上的蛋白质转印到pvdf膜。
200.11)转膜结束后，丽春红染色5分钟，tbst漂洗3-5分钟，重复2-3次，剪下目的蛋白附近的条带。
201.12)用5％bsa(1x tbst配制，5g 100ml)室温封闭1小时。
202.2.6抗体孵育
203.5)封闭结束后，以封闭液(5％bsa的1x tbst溶液)配制一抗，膜在4℃摇床孵育过夜。
204.6)孵育结束后，1x tbst漂洗5分钟，重复3次。
205.7)以封闭液配制荧光二抗(根据一抗选择)，室温摇床孵育1h。
206.8)孵育结束后，1x tbst漂洗5分钟，重复3次。
207.2.7蛋白检测
208.2)根据beyoecl plus，取适量等体积溶液a和溶液b混合成工作液。
209.3)滤纸吸去残余洗涤液，不要碰到蛋白条带。
210.4)将工作液滴加至转印膜上至完全覆盖，室温放置1-2分钟
211.5)取膜，弃beyoecl plus工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，将膜放置到化学发光成像仪内拍照。
212.细胞免疫荧光
213.1)接种细胞于细胞爬片上；
214.2)在培养板中将已爬好细胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min；
215.3)用4％的多聚甲醛固定爬片15min，pbs浸洗玻片3次，每次3min；
216.4)0.5％triton x-100(pbs)配制室温通透20min；
217.5)pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
218.6)吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
219.7)加荧光二抗：pbst浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，pbst浸洗切片3次，每次3min；
220.注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
221.8)复染核：滴加dapi避光孵育5min，对标本进行染核，pbst 5min
×
4次洗去多余的dapi；
222.9)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
223.三、结果与分析
224.3-1.ral蛋白在oa退变软骨中高表达
225.收集因膝骨性关节炎进行全膝关节置换术病人的关节软骨，依据关节面完整程度分为normal组及oa组，首先进行番红-快绿染色，染色结果表明oa组关节软骨层的厚度显著性比normal组关节软骨层薄，阿尔新蓝染色结果显示oa组蛋白聚糖的含量显著性小于normal组，免疫组化染色显示oa组ral的表达显著性低于normal组，从normal和oa组分离软骨细胞，利用免疫荧光检测ral的表达，结果显著oa组来源的软骨细胞中ral的表达显著性高于normal组来源的软骨细胞(图2a)。利用不同浓度的il-1(0ng/ml,5ng/ml,10ng/m和20mg/ml)刺激软骨细胞24小时，利用western blot检测ral蛋白的表达，结果显示il-1可以促进软骨细胞中ral蛋白的表达，并具有浓度依赖性(图2b)。利用10ng/ml的il-1刺激软骨细胞0小时，6小时，12小时，24小时，36小时和48小时，利用western blot检测ral的表达，结果显示ral蛋白的表达随着刺激时间的增加而增加，具有时间依赖性(图2c)。实时荧光定量pcr检测normal组和oa组关节软骨中ral mrna的表达，结果显示oa组关节软骨中ral mrna的表达显著高于normal组软骨(图2d)。
226.其中，
227.关于real-time pcr分析的具体方法如下：
228.1.组织总rna的提取
229.1)采用显微切割仪(leica,germany)将不同分级的关节软骨组织中的细胞及细胞团切割收集。
230.2)将收集的石蜡组织，按石蜡组织总rna提取试剂盒(qiagen,germany)说明提取总rna。
231.3)用rnase-free水(20-50μl)溶解样品后，nanodrop 2000(thermofisher,usa)测定rna浓度和纯度，od260/od280应在1.8～2.0之间。rna样本-80℃保存，或直接进行rt-pcr。
232.4)本试验所用物品均需要经过depc处理。
233.2.rna的反转录反应：
234.1)在冰上按以下比例配制反转录反应混合液：
[0235][0236]
2)将反应混合液混匀后，按以下参数进行反转录：
[0237][0238]
3)样品放于-20℃备用。
[0239]
3.real-time pcr
[0240]
基因mrna表达检测：使用takara公司real-time pcr检测试剂(cat:rr420a)。
[0241]
引物序列详见下表。
[0242]
1)在冰上按以下组分配制real-time pcr反应液，注意避光操作。
[0243][0244]
2)短时离心，将溶液都甩至管底，反应参数如下：
[0245][0246]
3)反应结束后确定real-time pcr的扩增曲线和溶解曲线。gapdh作为内参基因，使用comparative ct法进行pcr定量。
[0247]
3-2.ral抑制剂rbc8抑制il-1诱导的关节软骨细胞外基质降解
[0248]
rbc8是ral的抑制剂，分子结构式如图3a所示，利用不同浓度(0μm、1μm、5μm、10μm、20μm和40μm)的rbc8刺激软骨细胞，结果显示1μm和5μm的rbc8对软骨细胞的活性没有影响(图3b)。western blot结果显示il-1可以抑制col2和acan蛋白的表达，同时可以促进mmp-13蛋白的表达，而rbc8可以促进col2和acan蛋白的表达，同时可以抑制mmp-13蛋白的表达(图3c)。实时荧光定量pcr检测结果显示il-1可以抑制col2和acan mrna的表达，同时可以促进mmp-13mrna的表达，而rbc8可以促进col2和acan mrna的表达，同时可以抑制mmp-13mrna的表达(图3d)。免疫荧光检测结果显示il-1可以抑制col2和acan蛋白的表达，同时可以促进mmp-13蛋白的表达，而rbc8可以促进col2和acan蛋白的表达，同时可以抑制mmp-13蛋白的表达(图3e)。
[0249]
关于阿尔新蓝染色具体方法如下：
[0250]
1)石蜡切片常规脱蜡入水；
[0251]
2)自来水冲洗30秒；
[0252]
3)阿尔新蓝(sigma,germany)染色30分钟(称取1g阿尔新蓝粉末，用100ml 3％冰醋酸溶解，醋酸调整ph至2.5)；
[0253]
4)自来水冲洗2分钟；
[0254]
5)95％乙醇脱水3分钟，1次；
[0255]
6)100％乙醇脱水3分钟，2次；
[0256]
7)二甲苯透明5分钟，2次；
[0257]
8)中性树胶封固；
[0258]
关于免疫组化染色具体方法如下：
[0259]
1)石蜡切片常规脱蜡和水化，二甲苯两次每次10-20分钟，梯度酒精100％-95％-85％-75％，每次5分钟。
[0260]
2)tbst(tbs中加入tween-20至终浓度为0.05％)洗涤三次，每次3分钟。或者直接用dd水涮洗几次(换缸)。
[0261]
3)切片放入湿盒中，用无尘纸巾吸除组织周围的水分，根据不同抗体的要求，(胃蛋白酶)对组织抗原进行相应修复45分钟。
[0262]
4)tbst清洗3次，每张切片滴加足够的3％h2o2溶液(30％h2o2和甲醇按照1：9的比例配制，12张切片配1ml)，室温下孵育10分钟，以阻断组织内内源性的过氧化物酶的活性。
[0263]
5)tbst洗涤三次，每次5分钟。去除组织周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈。5％bsa(0.5gbsa(4
°
冰箱) 10mltbst)室温封闭1h
[0264]
6)移除封闭液，tbst洗涤三次，每次5分钟。根据不同抗体的要求，用5％bsa稀释一
抗mmp13(abcam,1:200,ab39012),type x collagen(abcam,1:1000,ab58632),gfp(abcam,1:1000,ab290))。每张切片加50μl一抗，4℃过夜。
[0265]
7)去除一抗，tbst洗涤三次，每次5分钟。
[0266]
8)加二抗(迈新，中国)。hrp标记的igg。37℃恒温箱内孵育一小时。
[0267]
9)去除二抗，tbst洗涤三次，每次5分钟。每张切片加50μl新鲜配制的dab溶液，室温放置3-10分钟。dab溶液现配现用。染色中观察，若见棕色很快显现，则需提早中止染色，不确定时可在显微镜下观察。
[0268]
10)去除多余的dab溶液，自来水稍冲洗，苏木素复染3分钟，自来水冲洗2分钟返蓝。
[0269]
11)95％乙醇脱水5分钟，2次。
[0270]
12)100％乙醇脱水5分钟，2次。
[0271]
13)二甲苯透明5分钟，2次。
[0272]
14)中性树胶封固。
[0273]
3-3.ral抑制剂rbc8抑制炎症状态下软骨组织块分解代谢并促进合成代谢
[0274]
为检测rbc8对关节软骨分解代谢和合成代谢的影响，在体外培养软骨组织块，加入il-1β模拟关节软骨炎症状态，加入rbc8，检测rbc8对软骨组织块代谢的影响。如图4所示，番红-快绿染色和阿尔新蓝染色结果显示il-1β可以促进组织块中基质的降解，而rbc8可以抑制il-1β导致组织块中基质的降解。免疫组化染色结果显示il-1β可以抑制软骨组织块中acan和col2的表达，而rbc8可以减缓il-1β导致的acan和col2表达降低。免疫组化染色结果显示oa重要炎症因子il-1β可以促进软骨组织块中mmp-13的表达，而rbc8可以减缓il-1β导致mmp-13表达降低。
[0275]
由此，通过软骨组织块培养显示，rbc8可明显抑制关节软骨退变，保护软骨基质。明显挽救oa致病重要炎症因子il-1β对于col2、acan的抑制效应，促进oa病理条件下软骨合成代谢因子col2、acan的表达，抑制oa病理条件下软骨分解代谢因子基质金属蛋白酶mmp-13的表达。
[0276]
3.4.bqu57防治软骨退变,保护关节软骨。
[0277]
如图5a，5b的western blot结果显示，bqu57明显挽救il-1β对于col2的抑制效应，促进oa病理条件下软骨合成代谢因子col2的表达，抑制oa病理条件下软骨分解代谢因子基质金属蛋白酶mmp-13的表达。b为a图定量分析。
[0278]
如图5c的免疫荧光结果显示，bqu57促进oa病理条件下关节软骨细胞合成代谢因子col2的表达。
[0279]
如图5d的免疫荧光结果显示，bqu57抑制oa病理条件下关节软骨细胞分解代谢因子mmp-13的表达。