一种基于适配体的神经性贝类毒素比色传感器及检测方法

1.本发明涉及一种贝类神经性毒素检测分析技术，尤其涉及一种基于适配体比色传感器的神经性贝类毒素检测分析方法。


背景技术：

2.神经性贝类毒素(nsp)是一种化学性质较为稳定的脂溶性环状聚酯毒素，nsp的主要成份是短裸甲藻毒素(brevetoxin)，其中brevetoxin-2是其主要存在形式。nsp中毒症状主要分为胃肠道症状及神经系统症状，其中胃肠道中毒症状包括恶心、呕吐、腹泻、腹绞痛，神经系统中毒症状包括口、唇、舌远端感觉异常、口齿不清和头晕头痛。nsp中毒严重时会发展为呼吸窘迫、肢体部分瘫痪。目前国内外海产品神经性毒素检测方法主要有小鼠生物法(mba)，高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)和酶联免疫检测技术(elisa)等。mba方法专业性较强且个体差异性较大；hplc-ms虽然具有灵敏度和准确度高的优点，但其设备庞大并且价格昂贵；elisa等酶联免疫检测技术同样存在价格昂贵和检测成本高等不足，检测试剂盒也被国外垄断。适配体是人工合成的单链dna或rna序列，因为它们可以折叠成二级和三级结构，使适配体可以特异性结合目标物质。适配体对靶分子有高亲和力，其解离常数范围从纳摩尔到皮摩尔水平。相较于抗体，其稳定性更高且可通过聚合酶链式反应进行后续扩增，大大节约成本。基于适配体比色传感器的神经性贝类毒素检测分析方法，具有成本低廉、操作简便等优点，便于建立海洋水产品神经性毒素的检测分析平台，有望成为海洋毒素检测分析领域的新工具并进行推广。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于适配体比色传感器的贝类神经性毒素检测分析方法。
4.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一方面，本发明提供了一种基于适配体的神经性贝类毒素比色传感器，该传感器包括96孔聚苯乙烯微孔板、络氨酸修饰的纳米金溶液、适配体bt10稀释液、神经性贝类毒素样品稀释液和二甲基联苯胺tmb溶液。适配体bt10稀释液与毒素样品稀释液体积比为1:2加入96孔聚苯乙烯微孔板，室温下混合孵育使两者结合；加入络氨酸修饰纳米金溶液，络氨酸修饰纳米金溶液与毒素样品稀释液体积比为5:1，未与毒素结合的适配体bt10会与纳米金结合从而保护纳米金免于聚沉；再加入二甲基联苯胺tmb溶液，二甲基联苯胺tmb溶液与毒素样品稀释液体积比为1:4，诱导纳米金聚沉，聚沉程度不同导致颜色及吸光度不同，从而构建出比色传感器检测神经性贝类毒素浓度；
5.所述络氨酸修饰的纳米金溶液是：称取质量比为6:17的络氨酸粉末和氢氧化钾粉末放入干净的烧杯中，加入超纯水充分搅拌溶解；加热烧杯中的溶液至沸腾状态，然后迅速加入2ml质量分数为1％的氯金酸溶液。继续加热20分钟后，停止加热并冷却至室温；用透析袋对上述溶液透析过夜，得到络氨酸修饰的纳米金溶液；络氨酸修饰的纳米金降低神经性
贝类毒素在纳米金表面的吸附；
6.所述适配体bt10稀释液是：将适配体bt10粉末转速4000rpm，离心5分钟，之后加入ph＝7.0的磷酸盐缓冲液将适配体bt10稀释成浓度为50μm的原液；然后进行适配体二级结构处理，具体为将装有上述原液的离心管90℃水浴加热5分钟，之后迅速放入4℃环境中冷却5分钟，最后室温下放置10分钟，完成二级结构处理；通过使用ph＝7.0的磷酸盐缓冲液可以将适配体原液稀释成不同浓度；
7.所述毒素样品稀释液是：将神经性贝类毒素brevetoxin-2溶液用纯水稀释成不同浓度。
8.进一步地，适配体bt10的序列为：5
’‑
ggccaccaaaccacaccgtcgcaaccgcgagaaccgaagtagtgatcatgtccctgcgtg-3’。
9.另一方面，本发明提供了一种基于所述比色传感器的神经性贝类毒素检测方法，该方法具体步骤为：
10.(1)取10μl浓度为0.3μm的适配体bt10稀释液分别加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，对应加入20μl不同浓度的毒素样品稀释液，反应30分钟；
11.(2)向反应后溶液加入100μl络氨酸修饰的纳米金溶液，反应5分钟；最后加入5μl tmb溶液，反应5分钟；
12.(3)将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，读取530nm和610nm处的吸光度，计算吸光度的比值即a
610nm
/a
530nm
，得到神经性贝类毒素的浓度。
13.本发明的有益效果是：本发明利用特定序列的核酸适配体对神经性贝类毒素特异性检测，通过加入tmb诱导络氨酸修饰的纳米金的聚沉实现对神经性贝类毒素brevetoxin-2的定量检测。本发明的检测方法成本低廉，操作便捷，检测时间少于1小时。
附图说明
14.图1是本发明方法原理图；
15.图2是本发明络氨酸修饰的纳米金溶液吸收光谱表征图；
16.图3是本发明氯化钠诱导纳米金聚沉对适配体响应图；
17.图4是本发明tmb诱导纳米金聚沉对适配体响应图；
18.图5是本发明适配体浓度优化图；
19.图6是本发明检测不同浓度神经性贝类毒素brevetoxin-2结果图；
具体实施方式
20.以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述。
21.本发明提出的一种基于适配体的神经性贝类毒素比色传感器，它包括如下物质：96孔聚苯乙烯微孔板、络氨酸修饰的纳米金溶液、适配体稀释液、毒素样品稀释液和tmb溶液。
22.具体的，所述络氨酸修饰的纳米金溶液是：称取0.006g络氨酸粉末和0.017g氢氧化钾粉末放入干净的烧杯中，向烧杯中加入300ml超纯水，充分搅拌溶解。用酒精灯加热烧杯中的溶液至沸腾状态，然后迅速加入2ml质量分数为1％的氯金酸溶液。继续加热，直到溶液的体积减少到150ml，停止加热并冷却至室温。用8000-14000d的透析袋对上述溶液透析
过夜，由此得到络氨酸修饰的纳米金溶液。
23.具体的，所述适配体稀释液是：将上海生工生物有限公司合成的适配体(序列：5
’‑
ggccaccaaaccacaccgtcgcaaccgcgagaaccgaagtagtgatcatgtccctgcgtg-3’)粉末1200rpm转速下离心5分钟，之后加入ph＝7.0的磷酸盐缓冲液稀释成浓度为50μm的原液。然后进行适配体二级结构处理，具体为将装有上述原液的离心管90℃水浴加热5分钟，之后迅速放入4℃环境中冷却5分钟，最后室温下放置10分钟，完成二级结构处理。通过使用ph＝7.0的磷酸盐缓冲液可以将适配体原液稀释成不同浓度。
24.具体的，所述毒素样品稀释液是：将神经性贝类毒素brevetoxin-2溶液用纯水稀释成不同浓度。
25.上述基于适配体比色传感器的神经性贝类毒素检测方法，原理如图1所示，具体为：
26.取10μl浓度为0.3μm的适配体稀释液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入20μl不同浓度的毒素样品稀释液，反应30分钟，使得适配体和毒素充分结合。向反应后溶液加入100μl络氨酸修饰的纳米金溶液，反应5分钟，未与毒素结合的适配体可以缠绕在纳米金表面，起到保护纳米金的作用，而与毒素结合的适配体则不能。最后加入5μl tmb溶液，反应5分钟，tmb带正电可以诱导纳米金聚沉，聚沉程度与纳米金表面的适配体量相关，即与毒素浓度相关。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，读取530nm和610nm处的吸光度，计算吸光度的比值即a
610nm
/a
530nm
，比值反应纳米金的聚沉程度。
27.实施例1：
28.络氨酸修饰的纳米金制备：称取0.006g络氨酸粉末和0.017g氢氧化钾粉末放入干净的烧杯中，向烧杯中加入300ml超纯水，充分搅拌溶解。用酒精灯加热烧杯中的溶液至沸腾状态，然后迅速加入2ml质量分数为1％的氯金酸溶液。继续加热，直到溶液的体积减少到150ml，停止加热并冷却至室温。用8000-14000d的透析袋对上述溶液透析过夜，由此得到络氨酸修饰的纳米金溶液。制备好的纳米金溶液用酶标仪扫描吸收光谱进行表征，如图2所示，可以发现在520nm处有特征吸收峰，说明纳米金成功制备。
29.实施例2：
30.实验组取10μl浓度为0.3μm的适配体稀释液，对照组取10μl，ph＝7.0的磷酸盐缓冲液(即0μm)加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入100μl络氨酸修饰的纳米金溶液，反应5分钟。向实验组和对照组加入5μl 10％氯化钠溶液或5μl tmb溶液诱导纳米金聚沉，结果如图3和4所示，可以发现使用传统的氯化钠诱导纳米金聚沉对低浓度的适配体并不灵敏，不能有效区分。而使用本发明的tmb诱导纳米金聚沉对低浓度的适配体比较灵敏，可以很好区分开。
31.实施例3：
32.为了研究加入的最佳适配体浓度，以达到最高的灵敏度，首先探究tmb诱导纳米金聚沉原理对适配体浓度的响应情况。向各孔中加入100μl纳米金溶液，之后加入10μl不同浓度的适配体稀释液(浓度分别为0.1μm，0.2μm，0.3μm，0.4μm，0.5μm，1μm,2μm)反应5分钟，之后加入5μl tmb溶液诱导纳米金聚沉，结果如图5所示。可以发现当适配体浓度为0.3μm时，适配体浓度继续降低时，区分度比较大。考虑到该传感器的原理是适配体与毒素的结合，使得纳米金表面适配体的量减少，因此选择0.3μm适配体浓度为最佳浓度。
33.实施例4：
34.在上述反应条件和优化条件下，取10μl浓度为0.3μm的适配体稀释液加入到96孔聚苯乙烯微孔板中，加入20μl不同浓度的毒素样品稀释液(浓度范围0-5ppm)，反应30分钟，使得适配体和毒素充分结合。向反应后溶液加入100μl络氨酸修饰的纳米金溶液，反应5分钟。最后加入5μl tmb溶液，反应5分钟。将反应好的96孔聚苯乙烯微孔板放入酶标仪中，读取530nm和610nm处的吸光度，计算吸光度的比值即a
610nm
/a
530nm
。吸光度比值与毒素浓度的关系如图6所示。传感器在0-1ppm浓度范围内表现出良好的线性。线性关系式为a
610nm
/a
530nm
＝0.2267*x 0.7011，其中x表示毒素浓度，线性度为0.9949。
35.需要声明的是，本发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。