流体样品分类的制作方法

1.本发明涉及用于样品的分类的方法和计算机程序，所述样品已经通过例如色谱法或电泳分离其成分，并且更具体地，涉及基于与参考样品的相对量和成分概况(profile)相似性对该样品进行分类的方法。


背景技术：

2.在生物药品(例如疫苗、抗体、重组蛋白、基因疗法载体等)的制造中，通常需要若干色谱分离步骤以从产物中去除各种污染物和杂质。在制造过程的每个步骤期间，需要检查与参考样品相比的量和纯度两者。
3.然而，分离概况通常显示多个可能重叠的分子峰带。这样的复杂分离概况的分析显著增加了成本和处理时间。此外，复杂样品的分离概况可能难以精确分析，这可能引入个体操作者的偏见。因此，对于快速自动化分析有着显著的兴趣，以消除个人偏见和减少制造生物药品的时间两者。因此，需要用于样品比较的方法和计算机程序，如果需要，其可以既快速又是自动化的。


技术实现要素：

4.本发明的一个方面是提供一种方法，所述方法可以由计算机程序实施，用于比较生物制药过程中的不同样品。这通过引入基于与参考样品的相对量和成分概况相似性的二维分析的相似性分数来实现。相对量是与参考样品的成分的量值相比的样品的不同化学成分的量值的测量。成分概况相似性计算是对由分离过程产生的已分离成分的空间或时间概况与已经经受相同分离过程的一个或多个参考样品的概况进行比较的相似性的测量。通过提供每个样品的相似性分数，所得二维数据集形成样品分类的基础，所述相似性分数允许估计目的样品与参考样品的相似性。在已经设定分类标准之后，可以使用计算机分析软件以及合适的硬件来自动化和实施分析方法。
5.一个优点是这样的分析方法允许快速、非操作者依赖性的分类方案，其中可以容易地设定用于对样品进行分组的限制以用于自动化分析。该方法允许作出决定，例如制造过程运行是否令人满意，或者是否需要改变分离参数。另外，样品成分的分离通常是不完全的，换句话说，测量的成分带重叠，导致难以分析的数据。通过以上文刚刚描述的方式将测量的概况与参考进行比较而不是仅查看测量的某些峰，所提出的方法允许这样的不完全分离。
6.本发明的其它合适的实施方案在从属权利要求中描述。
附图说明
7.图1显示经分析的考马斯染色的凝胶的图像。在聚丙烯酰胺凝胶上分离不同的样品(1-10)，并随后用考马斯染色剂染色。使用分析软件image quant tl (可从cytiva life sciences获得)分析凝胶。
8.图2显示图1中的样品5的电泳泳道概况。
9.图3显示图1和图2中样品的二维相似性分数图。样品的相对量(y轴)和泳道概况相似性分数(x轴)在一个图中显示。在该实施例中，8号样品是参考样品。
10.图4显示将图3的不同的样品分组为三个组(a-c)的一种方式。
11.图5显示两种蛋白质样品的色谱图。
12.图6显示使用本发明的实施方案产生的蛋白质纯化过程中不同循环的185个色谱图的2d相似性散点图。
13.图7显示用于呈现使用本发明的实施方案产生的结果的图形用户界面(gui)。
14.图8显示根据本发明的各种实施方案的方法。
15.定义如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等可以具有归于它们的含义，并且可以指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially)”同样具有专利法中所归属的含义，并且所述术语是开放式的，允许存在多于所列举的那些，只要所列举的那些的基本或新颖特征不会因存在多于所列举的那些而改变，但排除现有技术实施方案。
具体实施方式
16.在一个方面，本发明公开了用于自动化分析已经经受分离的样品的计算机辅助方法，该术语包括将样品的至少一些成分形成为较高浓度的等分试样、级分或流。术语分离包括部分分离。
17.在某些实施方案中，样品可以是生物制药制造过程中的中间体或最终产物。此外，参考样品可以在创建过程时经受化学分离和随后的分析，或者保存用于在后来的阶段的化学分离分析。生物制药制造领域众所周知如何储存参考样品以备将来分析。保存的参考样品数据也可以用于比较。
18.在一些实施方案中，通过电泳进行分离，并使用颜色染色剂或荧光染料检测已分离的分子。随后，在泳道中存在多少样品成分以及泳道空间概况与参考样品相比的相似程度两方面，比较电泳分离的泳道概况。
19.在一些实施方案中，通过色谱法进行分离，并使用吸光度测量检测已分离的分子。随后，在从色谱柱洗脱多少样品以及样品概况(也称为色谱图)的相似程度两方面，比较分离概况。这样，可以快速评估生物过程制造过程中不同批次的再现性，并且可以容易地做出过程继续的决定。
实施例
20.实施例1使用sds-page电泳分析不同的蛋白质样品。所得考马斯染色的凝胶示于图1中。一些样品含有多种蛋白质，并且电泳分离后所得泳道概况是复杂的，即它表现出许多重叠峰。这样的泳道概况难以通过眼睛手动比较。可以相对于沿着泳道的空间位置来测量每个或多个目的泳道的不透明度，也称为光密度。在图2所示的图中仅针对图1的泳道5给出这样的测
量，但是可以针对在图1中所示的其它泳道进行相同的测量。使用从图2的图产生的数据(其不需要以图形表示，而可以纯粹作为数据存在)，使用pearson相关系数，在蛋白质的量(在这种情况下，不透明度=光密度)和不同泳道概况如何空间相关两方面分析泳道概况。这种计算将两个数据阵列进行比较，在这种情况下是图2中图解说明的类型的样品泳道概况数据与参考样品泳道概况(在这种情况下是泳道8)。计算的值可以从-1 (负相关)到0 (无相关)到1 (正相关)变化。pearson成对相关计算是使用参考泳道概况或若干泳道概况的参考平均值来使不同的泳道概况相关的一种方式。然而，存在许多可使用的其它方式来使泳道概况相关。
21.图1中所示的十个泳道中的每一个的相关计算的结果显示在图3中的二维图中。其中显而易见的是，就样品成分的量而言，某些泳道与参考样品良好相关，在该泳道中已分离的蛋白质产生图1中所示的不透明带，并且给出接近1的分数(y轴)，并且某些泳道的整个泳道概况也与参考泳道良好相关，并因此给出接近1的分数(x轴)。这些数据提供了两个相似性比较：化学成分(例如蛋白质)的量相似性(y轴)；以及实际化学成分概况相似性(x轴)。还显而易见的是，在该实施例中的样品基于分离概况相似性分数而落入不同的组中。
22.如在图4中所示，数据点允许通过样品的分组来容易地分类。这样的分类允许快速分析，并且不依赖于用户对不同概况的相似程度的估计。可以基于以下设定对样品进行分组的限制：a)仅样品的量的相似性；b)仅化学分离概况相似性；c)样品的量和化学分离概况相似性。
23.因此，取决于哪些样品已经被分析，可以应用用于对样品进行分组的不同规则。例如，认为图4中仅c组样品被分类为落入与参考样品的可接受相似性内。
24.实施例2与如上所述类似的技术可以应用于如在图5中所示的色谱分离，其中已经使用吸光度计来测量从含有色谱介质的柱中出现的化学成分(例如蛋白质)的带(测量蛋白质浓度的典型uv吸光度)。所得数据(称为色谱图)在图5中显示，其中叠加了两个色谱图，并且数据集包含光电检测器输出读数(相当于图2的不透明度/成分量测量)和时间(时间相关)数据(相当于也在图2中显示的空间/距离数据)。该数据集以与上述相同的方式处理，再次提供与参考样品或平均样品数据的成分量和化学相似性的比较分数。随后，该处理过的数据对样品进行分类，例如在生物制药制造过程中的通过或失败结果。在图5中，使用
ä
kta pure 25色谱系统(可从cytiva life sciences获得)比较了具有相同起始浓度的两种蛋白质样品的两个色谱图。样品在用于分离的strep-tactin标签的类型上不同。结果是，色谱图(即时间分离概况)显示不同的峰形和分离概况的微小变化。对于色谱图的这部分，相似性分数分析得到样品1的相似性分数为(0.90；0.87)，其中0.90是分离概况相似性分数，而0.87是相对量，其显示与参考样品相比，样品1在洗脱量以及在一定程度上与分离基质的化学结合两方面不同。
25.本领域技术人员将意识到，根据本发明可以进行各种分析。例如，当考虑色谱法实例时，色谱法分析中的另外的维度可以是例如以下中的一个或多个：ph、电导率和/或压力。因此，色谱法运行数据(例如对应于压力、ph和/或电导率数据的时间相关数据)可以用于样
品的分类。这样的参数可以代替相对量或另外用作相似性图的y轴数据(纵坐标数据)。
26.图6显示使用本发明的实施方案产生的蛋白质纯化过程中不同循环的185个色谱图的2d相似性散点图。该图显示色谱图相对峰面积如何与分离概况相似性分数相关。这样的图数据证明，使用本发明的实施方案可以以高分辨率分析许多运行，并且可以进一步鉴定例如不能由熟练的操作者容易地确定的数据点。因此，本发明的各种实施方案可以用于警告操作者异常值和/或可以用于自动化处理系统中以优化用于基于色谱法的生物处理系统的控制参数。
27.在图6中，在具有ph分步洗脱的
ä
kta pure 25
™
系统中，使用fibro hitrap prisma
™
色谱单元，对于来自纯化循环的185个色谱图中的每一个衍生数据。选择参考样品作为系列中的第一个色谱图。所有色谱图明显非常相似，但是使用pearson相关系数计算来检测在峰形方面不同的两次运行。这两个值作为异常值出现在图6的左侧。在检查之后，所有的循环色谱图被判断为是可接受的。(注意：这些色谱图中的一些值是饱和的，并因此峰面积与该特定数据集的相对量不成比例。)图7显示用于呈现使用本发明的实施方案产生的结果的图形用户界面。gui包括提供数据的2d可视化的窗口。在该实施例中，显示相似性分数相对于相对量的图。这样的2d散点图提供了容易的用户可视化。gui还可以或可选地使得用户能够选择参考概况，以便显示概况，例如电泳泳道或色谱图，并在散点图中显示二维样品数据。
28.此外，在各种实施方案中，2d散点图可以使用户能够选择目的区域用于分析，从分析中去除已经达到检测器的最大极限的所有数据点，和/或使用散点图来设定用于将样品分组成不同组的限制。此外，各种实施方案也可以允许散点图例如通过使用趋势线或颜色梯度来跟踪蛋白质纯化过程。
29.图8显示根据本发明的各种实施方案的方法。方法100包括以下步骤：a.至少部分地分离110流体样品的一种或多种化学成分；b. 在化学分离期间或之后测量和记录120样品的已分离化学成分的量；c.在分离期间或之后测量和记录130样品成分的空间或时间分离概况，并提供其数据集；d.将所述已分离成分的量与一个或多个参考样品进行比较140；e.将空间或时间分离概况与所述参考样品或每个参考样品的相应概况进行比较150；f.基于如在以上步骤d.140和e.150或两者下进行的已分离成分的量或概况比较的相似性，分别使用所述参考样品或每个参考样品的等价量和/或概况，对样品指定160相似性分数；g.基于相似性分数提供170样品的分类。
30.在涉及电泳的各种实施方案中，方法100可以包括以下步骤中的一个或多个：1a.在图像中选择目的区域。对于电泳，用户可以例如使用上述类型的gui来创建泳道框。
31.2a.任选地，随后可以从分析中排除泳道概况的饱和区域，即，检测器已经达到其最大值的区域。这可以是自动的或者可以是用户驱动的。
32.3a.校正不均匀迁移。用户可以调整泳道框和泳道以校正穿过电泳凝胶的不均匀迁移。任选地，泳道概况尺度可以通过与其它泳道中的标记样品(即具有已知分子量的样品)进行比较来校正，由用户或自动化进行。
33.在涉及色谱法的各种实施方案中，方法100可以包括以下步骤中的一个或多个：1b.通过分析软件手动或自动化在色谱图中选择目的区域。该步骤是任选的，或者
可以分析全部色谱图。
34.2b.任选地，从分析中排除泳道概况的饱和区域，即其中检测器已经达到其最大值的区域。
35.3b.进行色谱图的对准以用于比较。色谱图对准可以通过软件算法自动化或者由用户执行。对准通常基于所执行的色谱操作，例如已知参考样品的洗脱时间，或相开始。该步骤是任选的，并且在一些情况下不需要对准。
36.随后，可以将以下步骤应用于电泳分析和色谱图分析两者：4.如果数据集具有不同数量的数据点，则可以对各个电泳泳道概况或色谱图进行取样或插值以对于每个样品获得相同数量的数据点。
37.5.随后可以执行所有数据点或用户限定的分析范围的分析。例如，在一些情况下，仅存在一个目的峰，则分析范围可以自动化或由用户相应地调整。
38.6.计算泳道或色谱图样品的积分信号。或者，对每个泳道，将所有检测到的带或峰的总量相加。
39.7.在优选实施方案中，进行n个样品的所有可能的成对比较。这导致n
×
n阵列。例如，一个阵列用于相对量，而一个阵列用于概况相似性分数。这样也可以用于比较色谱法的压力、ph和/或电导率数据集。
40.8. gui允许用户选择一个参考泳道或色谱图，并且随后可以产生2d散点图，在y轴上显示相对量，并且在x轴上显示概况相似性分数。
41.因此，已经描述了本发明的各种实施方案和特征。本书面描述进一步使用实例来公开本发明，包括优选的模式，并且被提供以使本领域技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统以及执行任何并入的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这样的其它实例旨在处于权利要求的范围内。在本文的文本中提及的任何专利或专利申请或可商购获得的产品(例如系统或软件)在允许的情况下通过引用以其整体并入本文，如同它们被单独并入一样。