一种角鲨烯含量的测量方法与流程

1.本发明属于本发明属于分析化学研究领域，具体涉及一种角鲨烯含量的测量方法。


背景技术：

2.角鲨烯作为烃类化合物，在有机化学中被划入萜类，是这类天然有机化合物中的一种三萜，结构符合异戊二烯规律，其系统命名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子式为c
30h50
，相对分子质量为410.7，是全反式的结构。
3.角鲨烯是由6个异戊二烯构成的无环三萜烯，分子中的六个双键俱为反式，是一种非环三萜结构，角鲨烯因含六个双键，极不稳定，容易氧化，在空气中放置会产生特殊臭气，易在镍、铂等金属作用下加氢形成角鲨烷。角鲨烯易环化成二环、四环、五环等三萜类化合物，通过化学反应，角鲨烯可以转变成羊毛甾醇，沟通了萜类化合物与甾体化合物之间的密切生源关系。
4.角鲨烯的主要功效：
5.1.预防疾病
6.可供给体内氧气和净化血液，预防脑部缺氧、呼吸困难、自主神经失调症、慢性肝炎、老人性关节炎、防止老化、视神经细胞衰弱、腰痛、肩膀酸痛、降低血糖值，并可外用美化肌肤、除去皱纹和手脚干裂等。
7.2.调节身体与增强免疫力
8.可用于高胆固醇血症和放、化疗引起的白血球细胞减少症。亦可用于改善心脑血管病的缺氧状态。感冒、流行性感染、发炎、过敏、气喘疾病、癌症、增强自身免疫能力。内服方式渗透到身体各部份，来补充细胞所需的氧气、加速新陈代谢、活化细胞、促进细胞再造，而角鲨烯的另一种作用是将身体内的有害物质如重金属等螯合后排出体外，确保身体健康。
9.3.氧气补给与清除自由基
10.角鲨烯的专业任务是供给氧气，也就是说角鲨烯带着大量氧气，到缺氧气的地方将氧气放出，这样的动作几乎是红血球的化身，更是生命存活的根源。角鲨烯除了强力的组织供氧能力外，还具有清除自由基的效果，可以让人体免于自由基的攻击；在增强免疫系统机能及抑制肿瘤细胞生长方面也都有诸多正面的报告。
11.由于其性质的特殊性，对于角鲨烯的研究正在不算深入，作为检测的分析手段也势必要不断提升以满足需求。现有的角鲨烯的检测方法的精度且容易受到干扰。
12.因此找到一种更加精确且干扰低的检测方法是十分必要的。


技术实现要素：

13.本发明的目的在，提供一种角鲨烯含量的测量方法已解决现有的角鲨烯的检测方法精确度不足的技术问题。
14.为了解决所述技术问题本发明提供了一种角鲨烯含量的测量方法，包括如下步骤：
15.样品的制备：对固体样品进行粉碎处理，对液体样品进行匀质处理；
16.对待测样品进行前处理：所述前处理方法包括但不限于，水解，萃取，皂化，甲酯化，过滤；
17.建立标准曲线：选取内参化合物固定内参化合物含量，改变角鲨烯含量用气相色谱仪测定一条标准曲线，并计算角鲨烯和内参化合物峰面积除以各自含量比值并线性模拟算出单位含量峰面积比值k1；依次改变内参化合物含量并固定，改变角鲨烯含量测定一条标准曲线，并计算单位含量峰面积比值线性模拟算出单位含量峰面积比值k2、k3、k4…kn
；去掉各组k值中的偏差值再取平均值得到k0；
18.测定混有内参的样品的气相色谱仪数据，并计算得到角鲨烯初步含量；
19.改变内参样品含量使之与初步含量比值在0.3-3之间，再次测定，并得到精确值。
20.优选地，所述待测样品包括油脂类样品和非油脂类样品。
21.进一步优选地，所述非油脂类样品的前处理包括但不限于水解，萃取和浓缩。
22.更进一步优选地，所述水解的溶剂为乙醇和水，所述水解的试剂为盐酸，所述水解温度为70℃～80℃。
23.进一步优选地，所述油脂类样品的前处理包括但不限于浓缩，皂化及甲酯化，萃取和过滤。
24.更进一步优选地，所述皂化及甲酯化的反应溶液为甲醇，反应试剂为氢氧化钾。
25.优选地，所述内参化合物为角鲨烷，正二十六烷，三十二烷中的至少一种。
26.优选地，所述内参化合物选取的含量范围为0.1-100μg/ml。
27.优选地，所述角鲨烯含量改变范围为1-100μg/ml。
28.具体的，所述的角鲨烯含量的测量方法的应用范围包括水果、茶叶、鱼类、贝类、谷类、豆类、坚果和种子类及提取油脂。
29.与现有的角鲨烯含量相比，本发明提供一种角鲨烯含量的测量方法，包括如下步骤：样品的制备：对固体样品进行粉碎处理，对液体样品进行匀质处理；对待测样品进行前处理：所述前处理方法包括但不限于，水解，萃取，皂化，甲酯化，过滤；建立标准曲线：选取内参化合物固定内参化合物含量，改变角鲨烯含量用气相色谱仪测定一条标准曲线，并计算角鲨烯和内参化合物峰面积除以各自含量比值并线性模拟算出单位含量峰面积比值k1；依次改变内参化合物含量并固定，改变角鲨烯含量测定一条标准曲线，并计算单位含量峰面积比值线性模拟算出单位含量峰面积比值k2、k3、k4…kn
；去掉各组k值中的偏差值再取平均值得到k0；测定混有内参的样品的气相色谱仪数据，并计算得到角鲨烯初步含量；改变内参样品含量使之与初步含量比值在0.3-3之间，再次测定，并得到精确值。与现有技术对比，本发明所述的角鲨烯含量的检测方法一方面采用内参法来检测，相比于外标法本身就具备一定的精度优势，另一方面通过多组数据的线性拟合，获得精确的参比值，进一步提升精度；最后通过二次测量，减少因为峰面积比过大引起的数据误差。综合多方面获得比现有技术更高的检测精度。
附图说明
30.图1为本发明实施例所述角鲨烯含量的测量方法流程图
具体实施方式
31.为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中使用到的各类原料，除非另有说明，均为常见市售产品。
32.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
33.本发明实施例中揭露的数值是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值而不限于本发明实施例中公开的具体数值。
34.本发明实施例中揭露的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。
35.本发明实施例一方面提供了一种角鲨烯含量的测量方法，包括如下步骤：
36.s01：样品的制备：对固体样品进行粉碎处理，对液体样品进行匀质处理；
37.s02：对待测样品进行前处理：所述前处理方法包括但不限于，水解，萃取，皂化，甲酯化，过滤；
38.s03：建立标准曲线：选取内参化合物固定内参化合物含量，改变角鲨烯含量用气相色谱仪测定一条标准曲线，并计算角鲨烯和内参化合物峰面积除以各自含量比值并线性模拟算出单位含量峰面积比值k1；依次改变内参化合物含量并固定，改变角鲨烯含量测定一条标准曲线，并计算单位含量峰面积比值线性模拟算出单位含量峰面积比值k2、k3、k4…kn
；去掉各组k值中的偏差值再取平均值得到k0；
39.s04：测定混有内参的样品的气相色谱仪数据，并计算得到角鲨烯初步含量；
40.s05：改变内参样品含量使之与初步含量比值在0.3-3之间，再次测定，并得到精确值。
41.具体的，所述步骤s01中固体采用粉碎机粉碎，液体采用匀浆机进行匀质处理，处理后保存温度在-18℃。样品制备是为了让样品更均一方便后续处理，得到更准确数据。
42.具体的，所述步骤s02中所述待测样品包括油脂类样品和非油脂类样品。更具体的，所述油脂类样品的前处理包括但不限于水解，萃取和浓缩。更进一步的，所述水解的溶剂为乙醇和水，所述水解的试剂为盐酸，所述水解温度为70℃～80℃。对于蛋白质，多肽等大分子，影响测定，且本身也不具备测定的条件，将其水解后往往会变成大极性较小分子，具备较好的水溶性，在后续萃取过程中会留在水中被除去，达到纯化样品，减少干扰的目的。
43.更具体的，所述步骤s02中所述油脂类样品的前处理包括但不限于浓缩，皂化及甲酯化，萃取和过滤。进一步的，所述皂化及甲酯化的反应溶液为甲醇，反应试剂为氢氧化钾。油脂类的样品皂化后产生的脂肪酸钠容易被除去，同样的被甲酯化后也具备较大极性，容
易被除去大部分，最终剩下少量对检测的影响大大降低。
44.具体的，所述步骤s03中所述内参化合物为角鲨烷，正二十六烷，三十二烷中的至少一种。内参化合物要满足单位含量的峰面积不能与角鲨烯的单位含量峰面积差异过大，否则会引起误差，另外内参化合物在gc测量中的出峰位置要与角鲨烯有一定差异性，不能产生重叠，影响检测。最后内参化合物沸点不能太高从而影响气化。进一步优选实施例中，内参化合物角鲨烷的光谱性质，出峰时间，溶解性等都差异不大，最终测量得到的比值接近于1，误差较小，因此选取角鲨烷效果较好。
45.具体的，所述步骤s03中所述内参化合物选取的含量范围为0.1-100μg/ml。具体的，所述步骤s03中所述角鲨烯含量改变范围为1-100μg/ml。内参化合物需要更宽的范围所以下限缩小了十倍。更具以往数据，角鲨烯含量是普遍较低的，大部分可落入1-100μg/ml的范围，因此选取此范围对后续测量有更好的参考价值。
46.具体的对于步骤s04和步骤s05，因为无法提前预知样品中角鲨烯的含量，因此选取的参考化合物的浓度可能与待测样的角鲨烯含量有较大差异，造成一定的误差。但是也能得到一个初步数据，对后续精确测量有指导意义。通过参比化合物浓度使其范围贴近待测样后再次测量就可以得到更准确数据了。
47.对于步骤s05内参样品含量使之与初步含量比值在0.3-3之间较为合适。当浓度差异过大容易引起误差。具体的，当参比化合物浓度太小，容易受到基线不平的影响，而影响参比化合物峰面积，从而造成较大的误差；同样的当参比化合物浓度太大，导致测量峰平头，也就是无法完全显示。即使完全显示，一方面此时被测化合物受基线影响较大；另外大浓度的物质保留时间的范围也会变宽，甚至容易包裹其他杂峰，从而导致测量误差。因此选取较为接近的0.3-3之间的浓度范围较为合适。
48.在具体实施例中，所述的角鲨烯含量的测量方法的应用范围包括水果、茶叶、鱼类、贝类、谷类、豆类、坚果和种子类及提取油脂。
49.试剂或材料
50.如无特别说明，所用的试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
51.氢氧化钾(koh)。
52.氯化钠(nacl)。
53.无水硫酸钠(na2so4)。
54.盐酸(hcl)。
55.乙醚(c4h
10
o)。
56.石油醚：沸程30℃～60℃。
57.甲醇(ch3oh)：色谱纯。
58.乙醇(c2h6o)(95％)。
59.正己烷(c6h
14
)：色谱纯。
60.角鲨烷(c
30h62
)
61.正二十六烷(c
26h54
)
62.三十二烷(c
32h66
)
63.角鲨烯(c
30h50
)，cas号：111-02-4，纯度≥99.0％。
64.盐酸溶液(8.3mol/l)：量取250ml盐酸，用110ml水稀释，混匀，室温下可放置2个
月。
65.氢氧化钾-甲醇溶液(1mol/l)：取5.6g氢氧化钾溶解在100ml甲醇中，混匀。
66.饱和氯化钠溶液：称取360g氯化钠溶解于1.0l水中，搅拌溶解，澄清备用。
67.乙醚-石油醚混合溶液(1 1)：取等体积的乙醚和石油醚，混匀备用。
68.微孔滤膜(ny)：0.22μm。
69.仪器设备
70.匀浆机或实验室用组织粉碎机或研磨机。
71.气相色谱仪：具备氢火焰离子检测器(fid)。
72.恒温水浴：控温范围40℃～100℃，控温
±
1℃。
73.分析天平：感量0.1mg。
74.氮吹仪。
75.涡旋振荡器。
76.色谱柱参考条件：
77.毛细管色谱柱：(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷弱极性固定相，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；或同等性能的色谱柱。
78.进样口温度：250℃。
79.检测器温度：300℃。
80.程序升温：初始温度160℃，保持1min；以15℃/min升温至220℃，保持2min；再以5℃/min升温至280℃，保持10min；后运行300℃，时间2min。
81.载气：氮气，流速，2ml/min。
82.分流比：20:1
83.进样量：11l。
84.氢气：40ml/min。
85.空气：400ml/min。
86.尾吹：30ml/min。
87.实施例1标准曲线绘制：
88.角鲨烯标准储备溶液：准确称取0.1g(精确到0.0001g)角鲨烯标准品到烧杯中，加入正己烷溶解，移入100ml容量瓶后用正己烷定容，得到浓度为1000μg/ml标准储备液。此溶液4℃下可保存六个月。
89.角鲨烯标准工作溶液：分别取0.100，0.300，1.00，2.00，5.00，10.0ml角鲨烯标准储备液于100ml容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为1.003.00，10.0，20.0，50.0，100μg/ml的系列溶液。
90.内参标准储备溶液：准确称取0.1g(精确到0.0001g)内参标准品到烧杯中，加入正己烷溶解，移入100ml容量瓶后用正己烷定容，得到浓度为1000μg/ml标准储备液。此溶液4℃下可保存六个月。
91.内参标准工作溶液：分别取0.100，0.300，1.00，2.00，5.00，10.0ml，50ml，100ml内参标准储备液于1000ml容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为0.1，0.3，1.00，2.00，5.0，10.0，50.0，100μg/ml的系列溶液。
92.选取内参化合物固定内参化合物含量，改变角鲨烯含量用气相色谱仪测定一条标
准曲线，并计算角鲨烯和内参化合物峰面积除以各自含量比值并线性模拟算出单位含量峰面积比值k1；依次改变内参化合物含量并固定，改变角鲨烯含量测定一条标准曲线，并计算单位含量峰面积比值线性模拟算出单位含量峰面积比值k2、k3、k4…kn
；去掉各组k值中的偏差值再取平均值得到k0；更具体的可以选取0.1μg/ml内参化合物，分别测定1.00，3.00，10.0，20.0，50.0，100μg/ml的角鲨烯系列溶液得到k1；再选取0.3μg/ml内参化合物分别测定1.00，3.00，10.0，20.0，50.0，100μg/ml的角鲨烯系列溶液得到k2；然后依次测出k3、k4…kn
；最终绘制曲线，或者去掉偏差取平均值得到k0。
93.实施例2样品的制备：
94.在采样和制备过程中，应避免样品污染。固体或半固体样品使用组织粉碎机或研磨机粉碎，液体样品用匀浆机均质，于-18℃下冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。
95.样品的前处理：
96.非油脂类样品：
97.水解
98.称取均匀的样品1.0g(精确至0.1mg，对于不同的样品称样量可适当调整，保证样品中脂肪量约100mg～200mg)到100ml具塞试管中，加入2ml95％乙醇和4ml水，混匀，加入盐酸溶液10ml，混匀。将试管放入70℃～80℃水浴中，水解40min。每隔10min振荡一下试管，确保在试管壁上的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出试管冷却至室温。
99.提取
100.水解后的样品，加入10ml 95％乙醇，混匀，然后加入50ml乙醚-石油醚混合溶液，振摇5min，静置10min。用少量的乙醚-石油醚混合溶液冲洗具塞试管和塞子，将醚层转移到250ml烧杯中。按照以上步骤重复提取水解液两次，将三次收集的醚层合并到250ml烧杯中。放置于水浴锅上蒸发至干，得到样品提取物。
101.油脂类样品：
102.准确称取0.1～0.5g(精确至0.1mg)至25ml试管中，按照如下皂化及甲酯化步骤“加入1ml 1mol/l氢氧化钾-甲醇溶液......过滤，待测”。
103.皂化及甲酯化
104.将提取物用正己烷溶解并完全转移至25ml试管中，用氮吹仪吹干，加入1ml 1mol/l氢氧化钾-甲醇溶液，在涡旋振荡器上振荡2min，加入5.0ml正己烷，在涡旋振荡器上萃取1min，用饱和氯化钠溶液洗涤至中性，静置，使水相和正己烷相分层。取正己烷相3ml于10ml试管中，加入约0.3g无水硫酸钠进行干燥，用0.22 1m滤膜过滤，待测。
105.实施例3测定
106.将混有内参化合物的角鲨烯标准工作液分别注入气相色谱仪中，测定相应的峰面积，并计算峰面积比值，以峰面积比值为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。
107.样品液经气相色谱仪分析，测得峰面积，采用内标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。
108.实施例4分析结果表述
109.x＝k0*s
测m参v定
/s
参m样
110.x——样品中角鲨烯的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
111.s
测
：测定样品峰面积
112.s
参
：参考化合物峰面积
113.m
参
：参考化合物含量，单位为(μg/ml)
114.m
样
：待测样品质量，单位为(g)
[0115]v定
：定容体积单位为(ml)
[0116]
计算结果保留三位有效数字。
[0117]
实施例5
[0118]
具体实施例选取不同的参比作为内参化合物，分别测试得到k值，如表1所示：
[0119]
表1
[0120][0121]
可以看出角鲨烷的k值接近1，且误差小，可信范围广；但是其余的内参化合物也具备可信区间，也就是小于5％；若知晓化合物的大致浓度范围，可选取合适的内参化合物，保证可信度；若进一步缩小测试浓度范围并采用角鲨烷作为内参化合物，在20-80μg/ml的区间内误差范围可低于3％。
[0122]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0123]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。