一种酵母仿生免疫微纳生物机器人及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种酵母仿生免疫微纳生物机器人及其制备方法和应用。


背景技术：

2.炎症相关疾病包括肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、肺炎、神经退行性疾病、关节炎、膀胱炎、结肠炎、糖尿病、子痫前期等严重影响人类健康，由于机体中的生理屏障作用，如粘液屏障、血脑屏障、胎盘屏障、气血屏障等，无论是游离药物还是传统的纳米递送系统很难突破生理屏障到达病灶部位，最新研究发现，只有0.7％的纳米颗粒被成功递送到实体瘤中，这一低值严重影响了纳米药物的临床转化。
3.新兴的微纳机器人因其主动运输、屏障穿透等优势，有望给生物医药领域带来颠覆性变革。其中，酶驱动的微纳生物机器人是一类利用生物酶与对应底物之间的催化反应，将化学能转化成机械能的微纳米器件。因其无需复杂的外部装置，更适合应用于体内环境中。但是目前酶驱动的微纳机器人应用于体内面临几个挑战：(1)绝大多数是以无机材料为微纳生物机器人的基底，无生物学效应，且生物相容性差；(2)目前常用喷涂和电化学沉积等方法制备微纳机器人，只侧重于运动功能，并没有载药部件，载药量低；(3)目前酶驱动微纳米机器人的驱动力弱。不能够在高盐和高粘度条件下运动。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提出了一种酵母仿生免疫微纳生物机器人及其制备方法和应用。该酵母仿生免疫微纳生物机器人通过多层组装扩展，大大增加了生物酶的含量，从而提高酵母仿生免疫微纳生物机器人的驱动力，同时，底盘酵母细胞壁微囊可刺激免疫细胞产生抗炎因子，因此，本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人特别适用于炎症相关疾病的治疗与检测。
5.具体通过以下技术方案实现：
6.一种酵母仿生免疫微纳生物机器人，包括酵母细胞壁微囊、载药纳米粒和生物素化酶层及链霉亲和素层，其中，所述生物素化酶层和所述链霉亲和素层多层组装扩展并修饰在酵母细胞壁微囊的部分外表面，所述载药纳米粒包裹于所述酵母细胞壁微囊内部。
7.进一步地，所述酵母细胞壁微囊取自酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母、膜璞毕赤酵母、美极梅奇酵母、红冬孢酵母和假丝酵母中的一种或多种。
8.进一步地，所述载药纳米粒中的纳米粒为带电脂质聚合物纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒和白蛋白纳米粒中的一种或多种。
9.进一步地，所述载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物、基因药物、重金属捕获剂、病毒捕获剂或细菌捕获剂中的一种或多种。
10.进一步地，所述生物素化酶层中的酶为葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶、
胰蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、脱氧核糖核酸酶(dna酶)或三磷酸腺苷酶(atp酶)中的一种或多种。
11.本发明还提供上述酵母仿生免疫微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)将载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁微囊内得到载药酵母微囊；
13.(2)在步骤(1)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽溶液，所述掩蔽溶液将载药酵母微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽，之后加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽溶液上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化；
14.(3)将生物素化的酶与步骤(2)制备的表面部分活化酵母微囊共孵育，得到表面部分包覆有单层生物素化酶层的酵母仿生免疫微纳机器人；
15.(4)将步骤(3)制备的表面部分包覆有单层生物素化酶层的酵母仿生免疫微纳生物机器人与链霉亲和素共孵育，之后离心洗涤，收集沉淀，即得表面部分包覆有单层生物素化酶层和单层链霉亲和素酶层的酵母仿生免疫机器人；
16.(5)将步骤(4)制备的表面部分包覆有单层生物素化酶层和单层链霉亲和素酶层的酵母仿生免疫机器人再与生物素化的酶共孵育，即得双层生物素化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人；
17.(6)重复步骤(4)到步骤(5)，得到多层生物素化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人。
18.优选地，所述载药酵母微囊与掩蔽溶液的质量比为1：(0.01-0.25)，这样的质量比能够保证载药酵母微囊进行部分掩蔽，避免出现因为载药酵母微囊被全部掩蔽而导致无法修饰上生物素化酶的情况。
19.优选地，步骤(2)中，所述载药酵母微囊与活化剂的质量比为1：(40-80)。
20.进一步地，所述掩蔽溶液包括但不限于乙二醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、麦芽糖醇、木糖醇及山梨醇中的至少一种。
21.进一步地，所述活化剂为羟基活化剂，包括但不限于甲苯磺酰基氯、溴化氰、二琥珀酰亚胺碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、羰基二咪唑、高碘酸钠、n-乙酰-d-半乳糖胺、半乳糖氧化酶、氯乙酸或异硫氰酸酯。
22.进一步地，步骤(3)中，所述生物素化的酶相对于所述表面部分活化酵母微囊过量添加，一方面可以保证生物素化的酶成功修饰，另一方面，过量的酶还可以回收重复利用。
23.本发明还提供上述酵母仿生免疫微纳生物机器人在药物运输上的应用，特别是用于制备炎症疾病药物。
24.所述炎症疾病包括但不限于肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、肺炎、神经退行性疾病、关节炎、膀胱炎、胃溃疡、结肠炎、糖尿病、子痫前期的一种或多种。
25.本发明的有益效果包括以下几个方面：
26.1.本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人以酵母细胞壁微囊为底盘细胞，酵母细胞壁微囊来源于可食用酵母细胞，具有优良生物相容性；
27.2.酵母细胞壁自身具有免疫学效应，可靶向巨噬细胞，刺激巨噬细胞产生白介素10(il10)等抗炎因子；
28.3.本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人通过多层组装扩展大大增加了生物酶的含量，从而提高酵母仿生免疫微纳生物机器人的驱动力。
附图说明
29.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人的制备过程示意图；
31.图2为酵母细胞壁微囊和多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人的扫描电镜图对比图；
32.图3为单层脲酶和多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在尿素溶液中的运动轨迹对比图；
33.图4为单层脲酶和多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在粘液中的扩散结果对比图；
34.图5为多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在0.9％生理盐水和3％高盐溶液中的运动轨迹图；
35.图6为小鼠胃溃疡的治疗效果对比图，其中图6(1)给对小鼠口服游离的姜黄素后的治疗效果图，图6(2)为给小鼠口服单层脲酶修饰的载姜黄素酵母免疫微纳机器人的治疗效果图，图6(3)为给小鼠口服多层脲酶修饰的载姜黄素酵母免疫微纳机器人的治疗效果图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.本发明提供了一种酵母仿生免疫微纳生物机器人及其制备方法，酵母仿生免疫微纳生物机器人，包括酵母细胞壁微囊、载药纳米粒和生物素化酶层及链霉亲和素层，其中，生物素化酶层和链霉亲和素层多层组装扩展并修饰在酵母细胞壁微囊的部分外表面，载药纳米粒包裹于酵母细胞壁微囊内部。
38.在一些具体实施例中，酵母细胞壁微囊取自酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母、膜璞毕赤酵母、美极梅奇酵母、红冬孢酵母和假丝酵母中的一种或多种。
39.在一些具体实施例中，载药纳米粒中的纳米粒可选自带电脂质聚合物纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒和白蛋白纳米粒中的一种或多种。
40.在一些具体实施例中，载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物、基因药物、重金属捕获剂、病毒捕获剂或细菌捕获剂中的一种或多种。
41.生物素化酶层中的酶可选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶、胰蛋白酶、
乙酰胆碱酯酶、脱氧核糖核酸酶(dna酶)和三磷酸腺苷酶(atp酶)中的一种或多种。
42.该酵母仿生免疫微纳生物机器人通过多层组装扩展，大大增加了生物酶的含量，从而提高酵母仿生免疫微纳生物机器人的驱动力，同时，底盘酵母细胞壁微囊，主要成分为β-1,3-葡聚糖，其可被巨噬细胞特异性内吞，可刺激免疫细胞产生白介素10(il10)等抗炎因子，从而发挥抗炎作用。因此，本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人特别适用于制备炎症疾病的治疗与检测的药物。炎症相关疾病包括但不限于肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、肺炎、神经退行性疾病、关节炎、膀胱炎、胃溃疡、结肠炎、糖尿病、子痫前期的一种或多种。
43.本发明还提供上述酵母仿生免疫微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
44.(1)将载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁微囊内得到载药酵母微囊；
45.(2)在步骤(1)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽溶液，掩蔽溶液将载药酵母微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽，掩蔽溶液包括但不限于乙二醇、甘油、丙二醇水溶液、聚乙二醇、麦芽糖醇、木糖醇及山梨醇的至少一种；载药酵母微囊与掩蔽溶液的质量比优选为1：(0.01-0.25)。
46.之后加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽溶液上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化；活化剂为羟基活化剂，包括但不限于甲苯磺酰基氯、溴化氰、二琥珀酰亚胺碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、羰基二咪唑、高碘酸钠、n-乙酰-d-半乳糖胺、半乳糖氧化酶、氯乙酸、异硫氰酸酯；载药酵母微囊与活化剂的质量比优选为1：(40-80)。
47.(3)将生物素化的酶与步骤(2)制备的表面部分活化酵母微囊共孵育，得到表面部分包覆有单层生物素化酶层的酵母仿生免疫微纳机器人；
48.(4)将步骤(3)制备的表面部分包覆有单层生物素化酶层的酵母仿生免疫微纳生物机器人与链霉亲和素共孵育，之后离心洗涤，收集沉淀，即得表面部分包覆有单层生物素化酶层和单层链霉亲和素酶层的酵母仿生免疫机器人；
49.(5)将步骤(4)制备的表面部分包覆有单层生物素化酶层和单层链霉亲和素酶层的酵母仿生免疫机器人再与生物素化的酶共孵育，即得双层生物素化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人；
50.(6)重复步骤(4)到步骤(5)，得到多层生物素化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人。
51.实施例1
52.一种酵母仿生免疫微纳生物机器人制备方法，包括以下步骤：
53.(1)将1mg载药阳离子纳米粒与10mg酵母细胞壁混合，在37℃孵育24h，阳离子由于静电作用，包埋沉积入负电荷的酵母细胞壁内，之后后用超纯水洗涤4次，收集沉淀，即得载药酵母微囊；
54.(2)将10mg载药酵母微囊溶于0.1mg甘油水溶液中，混合均匀，之后倒入平皿中，甘油能够将载药酵母微囊束缚于平皿上，50℃干燥2小时，之后用超纯水洗涤3次，以洗去多余的甘油。加入400mg羰基二咪唑活化剂，羰基二咪唑活化剂能够浮于甘油掩蔽溶液的上方，室温25℃活化2小时，之后用超纯水洗涤3次，以除去羰基二咪唑。
55.(3)加入1mg生物素化的脲酶，室温25℃孵育6小时，之后用超纯水洗涤3次，以除去
未反应的脲酶，即得单层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人；
56.(4)加入0.25mg链霉亲和素，室温25℃孵育30min；之后用超纯水洗涤3次；
57.(5)加入1mg生物素化的脲酶，室温25℃孵育6小时，之后用超纯水洗涤3次，以除去未反应的脲酶，即得双层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人；
58.(6)重复步骤(4)和步骤(5)，即得多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人。
59.图1为酵母仿生免疫微纳生物机器人的制备示意图，其中，a为酵母细胞壁微囊，b为载药纳米粒，将载药纳米粒引入酵母细胞壁微囊中，得到载药酵母微囊c。加入掩蔽剂d，进行半面掩蔽，再加入活化剂r进行半面活化，然后加入生物素化酶e以及链霉亲和素f，使得载药酵母微囊c表面修饰上多层生物素化酶，然后溶解掩蔽剂，得到酵母仿生免疫微纳生物机器人g。
60.图2中，图2(1)为酵母细胞壁微囊的扫描电镜图(bar＝1μm)，图2(2)为多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人扫描电镜图(bar＝1μm)，可以看出，脲酶修饰在酵母微囊的部分外表面。
61.图3为单层脲酶和多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在尿素溶液中的运动轨迹对比图，其中，图3(1)为单层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人10s内在10mm尿素溶液中的运动轨迹，长度为15.32μm，平均速度为1.53μm/s；图3(2)为多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人10s内在10mm尿素溶液中的运动轨迹，长度为40.35μm，平均速度为4.03μm/s。可以看出，相同时间内，多层脲酶的运动长度比单层脲酶的运动长度多25.03μm，平均速度多1.25μm/s。(bar＝5μm)说明多层酶修饰酵母仿生免疫微纳生物机器人大大提高了现有的单层酶修饰的运动速度。
62.图4为载药酵母微囊和多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在1％仿生粘液中以10mm尿素为底物，3min的扩散结果对比图。其中图4(1)为载药酵母微囊的扩散结果，图4(2)为多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人的扩散结果。可见，载药酵母微囊3min中内仍然聚集在一起。而多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在1％仿生粘液中仍然具有活性，且快速均匀的向四周扩散(bar＝100μm)。说明：多层脲酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人能够在粘液内自主运动，大大提高了粘液屏障的穿透性。
63.实施例2
64.一种酵母仿生免疫微纳生物机器人制备方法，包括以下步骤：
65.(1)将1mg载药纳米粒与10mg酵母细胞壁混合，在37℃孵育24h，之后用超纯水洗涤4次，收集沉淀，即得载药酵母微囊。
66.(2)将5mg载药酵母微囊溶于1.25mg甘油中，混合均匀，之后倒入平皿中，甘油能够将载药酵母微囊束缚于平皿上，50℃干燥2小时，之后用超纯水洗涤3次，以洗去多余的甘油。加入250mg羰基二咪唑活化剂，羰基二咪唑活化剂能够浮于甘油掩蔽溶液的上方，室温25℃活化2小时，之后用超纯水洗涤3次，以除去羰基二咪唑。
67.(3)加入1mg生物素化的葡萄糖氧化酶，室温25℃孵育6小时，之后用超纯水洗涤3次，以除去未反应的葡萄糖氧化酶，即得单层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人。
68.(4)加入0.25mg链霉亲和素，室温25℃孵育30min；之后用超纯水洗涤3次。
69.(5)加入1mg生物素化的葡萄糖氧化酶，室温25℃孵育6小时，之后用超纯水洗涤3
次，以除去未反应的葡萄糖氧化酶，即得双层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人。
70.(6)重复步骤(4)和步骤(5)，即得多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人。
71.图5为多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在0.9％生理盐水和3％高盐溶液中的10s内运动轨迹图(bar＝5μm)。其中，图5(1)为多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在20mm葡萄糖溶液中加入0.9％的生理盐水，其运动速度为2.34μm/s，图5(2)为多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人在3％高盐溶液中的运动轨迹图，当加入3％的高盐溶液后，其运动速度为2.30μm/s。可见，在生理情况和高盐溶液中，多层葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生免疫微纳生物机器人仍然保持高的自主运动，盐溶液几乎不对机器人运动产生影响，其原因为：葡萄糖氧化酶分解葡萄糖，从而在酵母机器人表面形成葡萄糖浓度差，从而引起酵母仿生免疫微纳生物机器人的自扩散泳，而与粒子浓度无关。
72.实验例
73.胃中幽门螺旋杆菌可以通过表面产生的脲酶分解尿素，中和胃酸，从而穿透胃粘液层，基于此仿生原理，可以将多层酶修饰的酵母免疫微纳机器人用于胃部疾病的治疗。在小鼠的饮用水中，每天添加10％的乙醇溶液，从而造成胃溃疡。从第三天开始，每隔两天给小鼠口服游离的姜黄素(free cur)、单层脲酶修饰的载姜黄素酵母免疫微纳机器人(cur@monoy-robot)和多层脲酶修饰的载姜黄素酵母免疫微纳机器人(cur@multy-robot)三种药物的姜黄素当量为10μg/g。第8天腹腔注射活性氧荧光探针(l-012)，根据荧光强弱确认胃溃疡治疗效果。
74.从图6可见，小鼠口服10％的乙醇后，第8天进行小动物成像，对照组有强烈的荧光，说明胃溃疡引起强烈的炎症反应，模型造模成功。当口服free cur后(参见图6(1))，荧光强度并没有明显降低，说明free cur口服后几乎很少到达胃壁。而口服cur@monoy-robot后(参见图6(2))，荧光强度略有降低，说明单层脲酶修饰的免疫酵母微纳机器人对胃溃疡有一定的治疗效果，口服cur@multy-robot后(参见图6(3))，荧光强度最弱，说明多层脲酶修饰的免疫酵母微纳机器人对胃溃疡有明显的治疗效果。总体结果表明，多层脲酶修饰的酵母免疫微纳机器人优于单层脲酶修饰的治疗效果。
75.综上，本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人以酵母细胞壁微囊为底盘细胞，酵母细胞壁来源于可食用酵母细胞，具有优良生物相容性；其次，酵母细胞壁自身具有免疫学效应，可靶向巨噬细胞，刺激巨噬细胞产生抗炎因子；此外，本发明提供的酵母仿生免疫微纳生物机器人通过多层组装扩展大大增加了生物酶的含量，从而提高酵母仿生免疫微纳生物机器人的驱动力。
76.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。