XRCC6基因及其编码的蛋白的应用

xrcc6基因及其编码的蛋白的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和医药领域，具体涉及xrcc6基因及其编码的蛋白的应用。


背景技术：

2.低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，hif-1)是由hif-1α和hif-1β组成异二聚体结构，是一种在低氧条件下激活的核心转录因子。目前已经证实的受hif-1转录调控的靶基因超过100个，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor a,vegfa)、肾上腺髓质素(adrenomedullin,adm)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporters 1,glut-1)等，其功能涉及细胞生存与增殖、血管新生、细胞能量代谢等。
3.研究表明，当组织或细胞处于低氧低营养的环境时，例如缺血性疾病和恶性肿瘤，hif-1会被激活并启动下游靶基因的转录表达，进而提高组织适应低氧低营养环境的能力。
4.基于此，靶向调控hif-1介导的信号通路已经成为目前缺血性疾病以及肿瘤治疗的重要手段。进一步寻找调控hif-1介导的信号通路的物质，成为亟待解决的科学问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术提供xrcc6基因及其编码的蛋白的应用，xrcc6基因和/或其编码的蛋白可应用于调控hif-1信号通路、调控hif-1下游靶基因的表达、调控hif-1的转录因子活性、调控hif-1α蛋白水平、调控细胞内皮生长因子的分泌、调控细胞糖酵解能力，还可用于制备预防和/或治疗缺血性疾病的药物，预防和/或治疗肿瘤的药物，为调控hif-1提供了全新作用靶点。
6.为解决以上技术问题，本技术提供的技术方案是xrcc6基因和/或其编码的蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下c1)至c9)中的至少一种：
7.c1)调控hif-1信号通路；
8.c2)调控hif-1下游靶基因的表达；
9.c3)调控hif-1的转录因子活性；
10.c4)调控hif-1信号通路上基因的表达；
11.c5)调控缺氧信号；
12.c6)调控细胞内皮生长因子的分泌；
13.c7)调控细胞糖酵解能力；
14.c8)预防和/或治疗缺血性疾病；
15.c9)预防和/或治疗肿瘤。
16.优选地，所述产品的功能为如下c1)至c7)中的至少一种：
17.c1)调控信号通路；
18.c2)调控hif-1下游靶基因的表达；
19.c3)调控hif-1的转录因子活性；
20.c4)调控细胞内皮生长因子的分泌；
21.c5)调控细胞糖酵解能力；
22.c6)预防和/或治疗缺血性疾病；
23.c7)预防和/或治疗肿瘤。
24.优选地，xrcc6基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
25.本发明还提供了xrcc6基因和/或其编码的蛋白的应用；所述应用为如下c1)至c7)中的至少一种：
26.c1)调控hif-1信号通路；
27.c2)调控hif-1下游靶基因的表达；
28.c3)调控hif-1的转录因子活性；
29.c4)调控hif-1信号通路上基因的表达；
30.c5)调控缺氧信号；
31.c6)调控细胞内皮生长因子的分泌；
32.c7)调控细胞糖酵解能力。
33.优选地，所述应用为如下c1)至c5)中的至少一种：
34.c1)调控hif-1信号通路；
35.c2)调控hif-1下游靶基因的表达；
36.c3)调控hif-1的转录因子活性；
37.c4)调控细胞内皮生长因子的分泌；
38.c5)调控细胞糖酵解能力。
39.本发明还提供了促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a8)中的至少一种：
40.a1)激活hif-1信号通路；
41.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
42.a3)提高hif-1的转录因子活性；
43.a4)提高hif-1信号通路上基因的表达；
44.a5)正向调控缺氧信号；
45.a6)提高细胞内皮生长因子的分泌；
46.a7)提高细胞糖酵解能力；
47.a8)预防和/或治疗缺血性疾病。
48.优选地，所述产品的功能为如下a1)至a6)中的至少一种：
49.a1)激活hif-1信号通路；
50.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
51.a3)提高hif-1的转录因子活性；
52.a4)提高细胞内皮生长因子的分泌；
53.a5)提高细胞糖酵解能力；
54.a6)预防和/或治疗缺血性疾病。
55.本发明还提供了抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或表达的含量在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下b1)至b8)中的至少一
种：
56.b1)抑制hif-1信号通路；
57.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
58.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
59.b4)抑制hif-1信号通路上基因的表达；
60.b5)负向调控缺氧信号；
61.b6)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
62.b7)抑制细胞糖酵解能力；
63.b8)预防和/或治疗肿瘤。
64.优选地，所述产品的功能为如下b1)至b6)中的至少一种：
65.b1)抑制hif-1信号通路；
66.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
67.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
68.b4)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
69.b5)抑制细胞糖酵解能力；
70.b6)预防和/或治疗肿瘤。
71.本发明还提供了促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质的应用；所述应用为如下a1)至a7)中的至少一种：
72.a1)激活hif-1信号通路；
73.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
74.a3)提高hif-1的转录因子活性；
75.a5)正向调控缺氧信号；
76.a6)提高细胞内皮生长因子的分泌；
77.a7)提高细胞糖酵解能力。
78.优选地，所述应用为如下a1)至a5)中的至少一种：
79.a1)激活hif-1信号通路；
80.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
81.a3)提高hif-1的转录因子活性；
82.a4)提高细胞内皮生长因子的分泌；
83.a5)提高细胞糖酵解能力。
84.本发明还提供了抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质的应用；所述产品的功能为如下b1)至b7)中的至少一种：
85.b1)抑制hif-1信号通路；
86.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
87.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
88.b4)抑制hif-1信号通路上基因的表达；
89.b5)负向调控缺氧信号；
90.b6)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
91.b7)抑制细胞糖酵解能力。
92.优选地，所述产品的功能为如下b1)至b5)中的至少一种：
93.b1)抑制hif-1信号通路；
94.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
95.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
96.b4)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
97.b5)抑制细胞糖酵解能力。
98.本发明还提供了一种产品，所述产品为产品甲或产品乙，所述产品甲包括促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质；
99.所述产品甲的功能为如下a1)至a8)中的至少一种：
100.a1)激活hif-1信号通路；
101.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
102.a3)提高hif-1的转录因子活性；
103.a4)提高hif-1信号通路上基因的表达；
104.a5)正向调控缺氧信号；
105.a6)提高细胞内皮生长因子的分泌；
106.a7)提高细胞糖酵解能力；
107.a8)预防和/或治疗缺血性疾病。
108.优选地，所述产品甲的功能为如下a1)至a5)中的至少一种：
109.a1)激活hif-1信号通路；
110.a2)提高hif-1下游靶基因的表达；
111.a3)提高hif-1的转录因子活性；
112.a4)提高细胞内皮生长因子的分泌；
113.a5)提高细胞糖酵解能力；
114.a6)预防和/或治疗缺血性疾病；
115.抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质；
116.所述产品乙的功能为b1)至b8)中的至少一种：
117.b1)抑制hif-1信号通路；
118.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
119.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
120.b4)抑制hif-1信号通路上基因的表达；
121.b5)负向调控缺氧信号；
122.b6)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
123.b7)抑制细胞糖酵解能力。
124.优选地，所述产品乙的功能为b1)至b6)中的至少一种：
125.b1)抑制hif-1信号通路；
126.b2)抑制hif-1下游靶基因的表达；
127.b3)抑制hif-1的转录因子活性；
128.b4)抑制细胞内皮生长因子的分泌；
129.b5)抑制细胞糖酵解能力；
130.b6)预防和/或治疗肿瘤。
131.优选地，所述促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质为xrcc6基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
132.所述抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质为沉默xrcc6基因的试剂。
133.优选地，所述载体选自质粒、病毒或dna片段。
134.优选地，所述载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(polya)序列。载体中有抗菌素抗性基因，以利于载体在宿主细胞，如细菌中繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。
135.优选地，所述xrcc6基因过表达载体是根据xrcc6基因核苷酸序列seq id no.1进行体外化学合成其dna后克隆到载体中。
136.优选地，所述xrcc6基因过表达载体是将序列如seq id no.1所示的xrcc6基因片段插入到pcdna3.1( )载体的bamhi和xhoi位点之间。
137.优选地，所述促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质为xrcc6基因过表达载体；
138.所述抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质为沉默xrcc6基因的sirna。
139.优选地，所述xrcc6基因过表达载体为xrcc6基因过表达质粒。
140.优选地，所述sirna的核苷酸序列如seq id no.2所示，5
’‑
gttctatggtaccgagaaa-3’。
141.优选地，所述产品选自药物、试剂、宿主细胞和试剂盒种任意一种。
142.优选地，所述产品为药物或试剂。
143.优选地，所述的调控为在低氧条件下的调控。
144.优选地，所述的激活为在低氧条件下的激活。
145.优选地，所述的提高为在低氧条件下的提高。
146.优选地，所述的抑制为在低氧条件下的抑制。
147.优选地，所述hif-1下游靶基因为vegfa基因、adm基因和glut-1基因。
148.优选地，所述细胞内皮生长因子的分泌为所述脐静脉内皮细胞和肝癌细胞细胞内皮生长因子的分泌。
149.优选地，所述细胞糖酵解能力为脐静脉内皮细胞和肝癌细胞的糖酵解能力。
150.优选地，所述预防和/或治疗缺血性疾病产品为促进心肌梗死后心肌再生药物。
151.所述肿瘤为肝癌。
152.优选地，所述脐静脉内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。
153.优选地，所述应用为非诊断和治疗目的。
154.优选地，所述低氧条件为1％o2低氧条件。
155.本技术与现有技术相比，其详细说明如下：
156.xrcc6基因、和/或、xrcc6基因编码的蛋白可以调控hif-1信号通路，调控hif-1下
游靶基因的表达，调控hif-1的转录因子活性，进而可以调控hif-1信号通路上基因的表达和缺氧信号；同时，可以调控细胞内皮生长因子的分泌，调控细胞糖酵解能力，可用于制备预防和/或治疗由hif-1α介导的疾病的药物，特别是，预防和/或治疗缺血性疾病及肿瘤。
157.本发明检测了过表达或沉默xrcc6后人脐静脉内皮细胞和肝癌细胞中hif-1下游靶基因在常氧和低氧条件下的表达量变化情况，同时检测了其在对细胞内皮生长因子的分泌以及细胞糖酵解能力的影响，为揭示xrcc6在调控hif-1介导的低氧应激反应中的作用机制奠定基础。
158.同时，本发明的结果显示xrcc6参与调控低氧条件下hif-1下游靶基因的表达，并参与调控细胞应对低氧刺激而激活的促血管新生和糖酵解过程，进一步说明xrcc6的过表达可能对缺血性疾病的治疗有促进作用，而xrcc6的沉默则对肿瘤的治疗有促进作用，这为研究防治缺血性疾病以及肿瘤的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
159.促进xrcc6基因的表达的物质、和/或、提高xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质可以激活hif-1信号通路，提高hif-1下游靶基因的表达，提高hif-1的转录因子活性，提高细胞内皮生长因子的分泌，提高细胞糖酵解能力，用于制备预防和/或治疗缺血性疾病的药物；进一步，促进xrcc6表达的试剂可用于制备缺血性疾病再生治疗的药物，特别是可用于制备促进心肌梗死后心肌再生的药物。
160.抑制xrcc6基因的表达的物质、和/或、抑制xrcc6基因编码的蛋白活性和/或含量的物质可以抑制hif-1信号通路，抑制hif-1下游靶基因的表达，抑制hif-1的转录因子活性，抑制细胞内皮生长因子的分泌，抑制细胞糖酵解能力，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物；进一步，抑制xrcc6表达的试剂可用于制备肿瘤治疗的药物，特别是可用于制备高表达xrcc6基因的肝癌治疗的药物。
附图说明
161.图1为本发明实施例2免疫荧光法检测人脐静脉内皮细胞在常氧(normoxia)或低氧(hypoxia)处理8h后细胞中xrcc6蛋白(绿色荧光)以及hif-1α蛋白(红色荧光)的定位和变化情况；
162.图2为本发明实施例3xrcc6过表达载体的结构及验证结果；
163.其中，图2a为环状载体质粒pcdna3.1( )结构以及xrcc6基因片段插入位点的示意图；
164.图2b为本发明xrcc6基因过表达载体质粒的酶切鉴定结果。
165.图3为本发明实施例4在人脐静脉内皮细胞中研究xrcc6基因过表达对低氧条件下hif-1下游靶基因及细胞功能的影响；
166.其中，
167.图3a为细胞中xrcc6基因的mrna水平；
168.图3b为β-actin作为内参，hif-1α蛋白水平；
169.图3c1为细胞中hif-1下游靶基因vegfa的表达；
170.图3c2为细胞中hif-1下游靶基因adm的表达；
171.图3c3为细胞中hif-1下游靶基因glut-1的表达；
172.图3d为xrcc6基因过表达的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮
生长因子(vegf)含量；
173.图3e1为xrcc6基因过表达的培养基中葡萄糖消耗水平；
174.图3e2为xrcc6基因过表达的培养基中的乳酸生成水平。
175.图4为本发明实施例5在肝癌细胞中研究xrcc6基因沉默对低氧条件下hif-1下游靶基因及细胞功能的影响；
176.其中，
177.图4a为细胞中xrcc6基因的mrna水平；
178.图4b为β-actin作为内参，hif-1α和xrcc6蛋白水平；
179.图4c1为细胞中hif-1下游靶基因vegfa的表达；
180.图4c2为细胞中hif-1下游靶基因adm的表达；
181.图4c3为细胞中hif-1下游靶基因glut-1的表达；
182.图4d为xrcc6沉默的细胞的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮生长因子(vegf)含量；
183.图4e1为xrcc6沉默的细胞的葡萄糖消耗水平；
184.图4e2为xrcc6沉默的细胞的乳酸生成水平。
具体实施方式
185.本领域技术人员可以借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
186.x-射线修复交叉互补蛋白6(xrcc6)，又叫ku70蛋白，是一种广泛表达的核蛋白,其在dna双链破裂修复,dna复制,基因转录调控,端粒结构的维持等多种细胞活动中,均扮演着重要角色。与hif-1α的表达规律相似，xrcc6蛋白在肝癌，乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中也呈高表达,而且xrcc6蛋白随着肿瘤恶性度的升高表达得越强烈。然而极少有文献报道xrcc6蛋白对hif-1信号通路的直接调控关系，尤其是xrcc6蛋白在肿瘤以及其他缺血性疾病的病理进展以及治疗过程中的潜在作用尚不清晰。本发明通过蛋白互作组寻找到了调控hif-1的转录活性的全新作用靶点(即xrcc6蛋白)，通过干预xrcc6基因的表达，来调节细胞或组织应对缺血缺氧环境的适应性，从而为缺血性疾病以及肿瘤的病理进展和治疗提供新的研究思路和药物开发靶点。
187.本发明以人xrcc6基因为研究对象，采用分子以及细胞生物学方法研究其在缺血性疾病以及肿瘤治疗中的应用。第一次证实了xrcc6在人脐静脉内皮细胞和肝癌细胞中的应用，通过过表达和沉默xrcc6基因证实其能够影响低氧条件下hif-1蛋白下游靶基因的表达，同时还证实其参与调控人脐静脉内皮细胞和肝癌细胞分泌血管内皮生长因子并提高人脐静脉内皮细胞和肝癌细胞中的糖酵解能力，进一步说明xrcc6可能在组织缺血损伤后或肿瘤进展过程中发挥促进血管新生以及增强细胞的适应性能量代谢的作用。因此，促进xrcc6表达的试剂可用于制备促进缺血性疾病再生治疗的药物，抑制xrcc6表达的试剂可用于制备肿瘤治疗的药物。
188.本发明通过分子生物学技术改变人脐静脉内皮细胞和肝癌细胞中xrcc6基因的表达量，证实：xrcc6基因的过表达可以显著增加低氧条件下内皮细胞中hif-1下游靶基因vegfa，adm，glut1的表达，增加低氧条件下细胞血管内皮生长因子的分泌，提高细胞糖酵解能力；xrcc6基因的沉默则显著抑制低氧条件下肝癌细胞中hif-1下游靶基因vegfa，adm，glut1的表达，减少低氧条件下细胞血管内皮生长因子的分泌，抑制细胞糖酵解能力；
189.具体的验证试验及结果为如下：
190.1、本发明通过蛋白互作组技术(即co-ip联合蛋白质谱技术)检测到，在低氧条件下人脐静脉内皮细胞的细胞核里与hif-1α有相互作用的蛋白复合体中显著富集到的蛋白共有99个，其中包含xrcc6蛋白，说明xrcc6与hif-1α在低氧条件下有相互作用关系(表2)。
191.2、本发明通过免疫荧光技术检测到，在低氧条件下人脐静脉内皮细胞中xrcc6和hif-1α均显著共定位于细胞核中(图1)。
192.3、本发明通过southern blot凝胶实验检测到，xrcc6基因过表达载体经过bamhi和xhoi两个限制性内切酶酶切后得到2000bp左右的基因片段，即xrcc6的基因片段(图2)。
193.4、本发明通过转染人脐静脉内皮细胞空载(vehicle)或xrcc6过表达载体(xrcc6oe)并给予常氧或低氧(1％o2)处理后，对细胞内xrcc6基因、hif-1α蛋白、hif-1下游靶基因、培养基中内皮生长因子含量、培养基中葡萄糖消耗以及乳酸生成的变化情况进行检测。结果显示在低氧条件下，相比与空载转染的细胞，xrcc6过表达载体转染的细胞中xrcc6基因的mrna含量显著升高(图3a)；xrcc6过表达对hif-1α蛋白含量没有影响(图3b)，但显著提高了hif-1下游的靶基因vegfa，adm以及glut-1的mrna含量(图3c1-图3c3)；xrcc6过表达显著提高了培养基中内皮生长因子的分泌(图3d)，促进了培养基中葡萄糖的消耗并增加了乳酸的生成(图3e)。
194.5、本发明通过转染肝癌细胞错配sirna(mismatch)或xrcc6基因sirna(sixrcc6)并给予常氧或低氧(1％o2)处理后，对细胞内xrcc6基因和蛋白、hif-1α蛋白、hif-1下游靶基因、培养基中内皮生长因子含量、培养基中葡萄糖消耗以及乳酸生成的变化情况进行检测。结果显示在低氧条件下，相比与mismatch转染的细胞，sixrcc6转染的细胞中xrcc6基因的mrna含量(图4a)和蛋白含量(图4b)均显著降低；xrcc6基因沉默对hif-1α蛋白含量没有影响(图3b)，但显著降低了hif-1下游的靶基因vegfa，adm以及glut-1的mrna含量(图4c1-图4c3)；xrcc6沉默显著降低了培养基中内皮生长因子的分泌(图4d)，降低了培养基中葡萄糖的消耗并减少了乳酸的生成(图4e1、图4e2)。
195.本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
196.本发明实施例中所用的原料及试剂，如无特殊说明，均为市售产品。
197.本发明实施例中，常氧调节设置为37℃、5％co2、21％o2；低氧条件设置为37℃、5％co2、1％o2。
198.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
199.实施例1：hif-1α互作蛋白组学研究
200.1.材料
201.1.1细胞
202.实验所需的人脐静脉内皮细胞系(ea.hy926)购自中国科学院细胞库，培养于含有
10％灭活胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、庆大霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100u/ml)的dmem培养基中。细胞培养条件为37℃、5％co2。
203.1.2主要试剂及耗材
204.(1)细胞核提取试剂包括细胞破碎溶液(1
×
pbs；0.05％吐温20)、蔗糖溶液(0.3m蔗糖；10mm hepes-naoh ph 7.9；1％triton-x100；2mm mgoac)以及甘油缓冲液(25％甘油；10mm hepes-naoh ph7.9；0.1mm edta；5mm mgoac)，上述试剂均购自美国sigma公司。
205.(2)np-40裂解液购自美国life technology公司；蛋白酶抑制剂购自中国碧云天公司；蛋白浓度测定bca试剂盒购自美国thermo公司；磁珠(dynabeads proteing)购自美国life technology公司；山羊抗hif-1α抗体(af1935)购自美国rd公司。
206.2.方法
207.2.1细胞低氧处理
208.当接种人脐静脉内皮细胞的十层细胞工厂的细胞融合度达到80％时，将细胞工厂置于低氧孵箱中培养8h，低氧条件设置为37℃、5％co2、1％o2。
209.2.2细胞收集
210.低氧处理完毕后，取出细胞工厂，弃去培养基。加入200ml pbs清洗残留的培养基，弃去pbs，再加入200ml的pbs进行二次清洗并弃去pbs。目的是将残留的培养基和血清清洗干净，避免影响到后续胰酶的消化过程。加入100ml的胰酶，使胰酶均匀分布在每一层。消化至大量细胞脱落时，加入500ml含10％小牛血清的培养基终止消化。吸出细胞悬液至50ml离心管。加入500ml pbs清洗细胞工厂，将残留在细胞工厂壁上的细胞清洗下来，以此收集足够量的细胞。再把含有细胞的pbs吸出，收集到50ml离心管中。离心(1500r/min)5分钟，弃去培养基，得到细胞团。
211.2.3细胞核提取
212.将细胞工厂培养得到的细胞用冰上预冷的pbs-pmsf清洗2次后加入100ml预冷的破碎溶液，在50ml离心管中静置5分钟后于4℃，3200
×
g，离心10分钟。随后再用预冷pbs-pmsf将细胞团洗2次(3200
×
g，离心10分钟)并将沉淀重悬于100ml蔗糖溶液中。随后涡旋混合后于4℃，3200
×
g离心10分钟，弃上清。随后将沉淀重悬于50ml蔗糖溶液中于4℃，3200
×
g离心10分钟，弃上清。随后通过涡旋将沉淀重悬于甘油缓冲液中，体积加至100ml，于4℃，3200
×
g离心10分钟，弃上清。最后得到的沉淀即为细胞核，通过涡旋将细胞核重悬于等体积的甘油缓冲液中备用。
213.2.4蛋白提取及浓度测定
214.每个十层的细胞工厂所提取到的细胞核中加入40ml pbs，重悬细胞核后于4℃，1500
×
g离心5分钟，弃上清，重复2次。随后加入6mlnp-40裂解缓冲液，重悬细胞核并均匀分装在6个1.5ml离心管中，置于冰上裂解。每10分钟涡旋混匀一次，裂解60分钟。随后于4℃，12000
×
g离心20分钟，弃去沉淀，得到蛋白裂解液。参照bca试剂盒的说明书测定样品的蛋白浓度。
215.2.5免疫共沉淀(co-ip)
216.取15ml离心管，将hif-1α抗体(10μg)稀释在200ul的pbs中(含tween-20)随后加入50μl磁珠，在室温旋转孵育10分钟。随后将离心管置于磁力架上，并弃去上清。用200μl含有tween-20的pbs重悬磁珠抗体复合物，温和吹打清洗后置于磁铁上，弃去上清。加入蛋白裂
解液样品，并轻柔吹打重悬磁珠抗体复合物。在室温旋转孵育10分钟，使抗原结合到磁珠抗体复合物上。随后用pbs清洗“磁珠-抗体-抗原”复合物3次，每次用200μl。随后用100μl的ph2.8的50mm的甘氨酸洗液重悬“磁珠-抗体-抗原”复合物，并将之转移到一个新的15ml离心管中。随后将理性置于磁铁上并弃去上清，加20μl的洗脱液，室温旋转孵育2分钟，使复合物解离。最后离心管置于磁铁上，转移出含有洗脱下抗原和抗体的上清，即hif-1α及其结合的蛋白复合体溶液。
217.2.6蛋白质谱分析
218.免疫共沉淀得到的蛋白样品交与上海中科新生命公司进行label free quantitative ms质谱分析。
219.3.结果
220.3.1总蛋白含量检测结果
221.低氧处理组的细胞总共三批样品。为满足label free质谱所需的蛋白量(约100μg)，质谱分析前对细胞核总蛋白量进行了检测。结果如下表：
222.表1
223.样品名蛋白浓度蛋白总量hypoxia 10.418μg/μl237.220μghypoxia 20.308μg/μl189.320μghypoxia 30.430μg/μl249.400μg
224.3.2蛋白质谱检测结果
225.蛋白质谱分析得到的低氧条件下细胞核中的与hif-1α相互作用的蛋白共鉴定出99个，其中包含xrcc6蛋白，具体鉴定出的蛋白列表明细见表2。
226.表2为人脐静脉内皮细胞的细胞核裂解液经hif-1α抗体免疫共沉淀后蛋白质谱分析得到的与hif-1α蛋白发生显著相互作用的蛋白列表，其中包含xrcc6蛋白，又称ku70蛋白。
227.表2
228.[0229][0230]
实施例2：常氧和低氧条件下xrcc6与hif-1α蛋白的变化和定位关系
[0231]
1.材料
[0232]
1.1细胞
[0233]
实验所需的人脐静脉内皮细胞系(ea.hy926)购自中国科学院细胞库，培养于含有10％灭活胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、庆大霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和
青霉素(100u/ml)的dmem培养基中。细胞培养条件为37℃、5％co2。
[0234]
1.2主要试剂及耗材
[0235]
12孔板圆形细胞爬片购自上海优宁维生物科技股份有限公司；triton-x100购自于美国sigma公司；山羊抗hif-1α抗体(af1935)购自美国rd公司；dapi、小鼠抗xrcc6抗体(ma5-13110)、alexa fluor 594标记羊抗兔二抗以及alexa fluor 488标记羊抗小鼠二抗均购自美国invitrogen公司。
[0236]
2.方法
[0237]
低氧处理组：
[0238]
2.1细胞爬片制备
[0239]
(1)准备无菌细胞爬片：将玻璃爬片浸泡于酒精24h以上，使用时取出用pbs清洗干净，放于12孔板；
[0240]
(2)向12孔板加入1ml培养基，降低表面张力；
[0241]
(3)将胰酶消化好的细胞均匀分散地接种到12孔板，每孔接种3-5
×
104个细胞，过夜培养待细胞贴壁；
[0242]
(4)当细胞密度长到60％时，给予低氧处理8h；低氧条件设置为37℃、5％co2、1％o2；
[0243]
(5)收集细胞：弃去上清，用预冷的pbs清洗3次；
[0244]
(6)固定：在通风橱中倒入预冷4％多聚甲醛，固定10min；
[0245]
(7)漂洗：用pbs在摇床上漂洗10min，共3次；浸泡于pbs可放于4℃冰箱待染色。
[0246]
2.2免疫荧光染色
[0247]
(1)将已经固定的细胞爬片取出，恢复室温；
[0248]
(2)打孔：0.1％tritonx-100(pbs配制)，室温打孔10min；
[0249]
(3)漂洗：用pbs在摇床上漂洗10min，共3次；
[0250]
(4)封闭：1％bsa37℃条件下孵育1h封闭非特异性结合位点；
[0251]
(5)一抗孵育：37℃共孵育山羊抗hif-1α抗体和小鼠抗xrcc6抗体1h，随后转至4℃孵育过夜；
[0252]
(6)复温：组织切片从4℃拿出，室温放置30min；
[0253]
(7)漂洗：用pbs在摇床上漂洗10min，共3次；
[0254]
(8)二抗孵育：37℃共孵育兔抗山羊二抗和山羊抗小鼠二抗1h；
[0255]
(9)漂洗：用pbs在摇床上漂洗10min，共3次；
[0256]
(10)复染细胞核：使用dapi复染细胞核，室温5min；
[0257]
(11)漂洗：用pbs在摇床上漂洗10min，共3次；
[0258]
(12)封片：使用缓冲甘油封片。所有切片置于4℃保存并尽快采图；
[0259]
(13)在激光共聚焦显微镜下观察并采图。每个区域采集3-5个视野，阳性表达区域的大小和光密度使用ipp 6.0软件进行统计分析。
[0260]
常氧(normoxia)处理组：和低氧处理组的区别仅在于氧气含量：2.1细胞爬片制备中(4)当细胞密度长到60％时，给予低氧处理8h；常氧条件设置为37℃、5％co2、21％o2。
[0261]
3.结果
[0262]
免疫荧光的检测结果表明，低氧(hypoxia)条件下,人脐静脉内皮细胞中的hif-1α
蛋白(红色荧光)与xrcc6蛋白(绿色荧光)均主要定位于细胞核中(图1a)。免疫荧光的统计结果显示：在常氧(normoxia)条件hif-1α蛋白表达量较低，低氧(hypoxia)处理后8h后，hif-1α蛋白含量显著升高(约5倍)。但低氧处理对xrcc6蛋白含量没有显著影响(图1b)。
[0263]
实施例3：xrcc6基因过表达质粒的构建与鉴定
[0264]
1.材料
[0265]
1.1质粒
[0266]
pcdna3.1( )空载质粒购自于生工生物工程(上海)股份有限公司；xrcc6过表达质粒是委托生工生物工程(上海)股份有限公司根据根据seq id no.1所示的xrcc6基因序列通过化学合成法合成xrcc6基因序列并插入至pcdna3.1( )空载质粒中构建而成。
[0267]
1.2主要试剂及耗材
[0268]
限制性内切酶(bamhi和xhoi)购自于日本takara公司；感受态dh5α购自于天根生化科技有限公司；质粒小提试剂盒(plasmid mini kit i)购自美国omega公司。
[0269]
2.方法
[0270]
2.1质粒转化大肠杆菌、挑去单克隆、质粒小提
[0271]
取含有氨苄西林抗性的lb琼脂培养板于室温(15℃-25℃)中平衡30min备用。将公司提供的插入xrcc6基因片段的pcdna3.1( )质粒转入感受态大肠杆菌dh5α，取50μldh5α与10μl连接产物充分混匀，冰浴30min，42℃热激90s，然后冰浴3min，加入1mllb培养基，于37℃摇床中转摇45min后，10000rpm离心2min，弃去上清，将产物均匀涂抹在上述lb琼脂培养板上，37℃倒置培养12h。随机挑取单克隆菌落数个，分别接种于5ml含有50μg/ml氨苄西林的lb培养基中，200rpm/37℃转摇12h，最后利用质粒小提试剂盒提取质粒。
[0272]
2.2质粒鉴定
[0273]
对提取的质粒dna进行xhoi和bamhi双酶切鉴定，双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，位置大小正确后将质粒送至成都擎科生物有限公司测序，将测序结果与xrcc6基因序列进行比对。比对正确后命名为pcdna3.1( )-xrcc6，即xrcc6基因过表达质粒。
[0274]
3.结果
[0275]
xrcc6基因的过表达质粒结构和基因插入序列的示意图如图2a所示。图2b显示的是双酶切产物的电泳结果，从图中可以看出酶切的片段大小在2000bp左右，符合xrcc6基因的片段大小(1830bp)。后续的质粒测序结果也证实了构建的xrcc6基因过表达质粒的序列是完全正确的。
[0276]
实施例4：xrcc6基因过表达对低氧条件下人脐静脉内皮细胞中hif-1下游靶基因及细胞功能的影响
[0277]
1.材料
[0278]
1.1细胞
[0279]
实验所需的人脐静脉内皮细胞系(ea.hy926)购自中国科学院细胞库，培养于含有10％灭活胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、庆大霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100u/ml)的dmem培养基中。细胞培养条件为37℃、5％co2。
[0280]
1.2主要试剂及耗材
[0281]
lipofectamine
tm 3000购自于美国thermo fisher scientific公司；trizol试剂购自美国invitrogen公司；逆转录试剂盒以及premix ex taq
tmⅱ试剂盒均购自于
日本takara公司；所有pcr引物均由成都擎科生物有限公司合成；ripa裂解液以及蛋白酶复合物均购自于中国碧云天公司；山羊抗hif-1α抗体(af1935)购自美国rd公司；兔抗山羊igg/辣根酶标记二抗购自于中杉金桥公司；人血管内皮生长因子酶联免疫吸附检测试剂盒购自于中国碧云天公司；葡萄糖检测试剂盒以及乳酸检测试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。
[0282]
2.方法
[0283]
2.1 xrcc6过表达质粒瞬时转染人脐静脉内皮细胞
[0284]
将ea.hy926内皮细胞消化后计数，按105个细胞/孔均匀接种在六孔板中，加入2ml培养基，过夜培养。当细胞融合度达到60-70％时进行转染。按照lipofectamine
tm 3000的操作手册将pcdna3.1( )-xrcc6质粒转染入ea.hy926细胞(1μg/孔)，对照组转染pcdna3.1( )空载。培养8-10h后更换完全培养基终止转染。
[0285]
2.2 rt-qpcr法检测基因表达变化
[0286]
将转染空载或pcdna3.1( )-xrcc6质粒的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集细胞，pbs洗涤3次，按照trizol试剂操作手册提取细胞总rna。使用takara逆转录试剂盒去除基因组dna后进行rna逆转录。使用takara的premix ex taq
tmⅱ试剂盒进行rt-qpcr扩增。xrcc6基因引物序列：
[0287]
上游引物为5
’‑
gctagaagacctgttgcggaa-3’，
[0288]
下游为5
’‑
tgttgagcttcagctttaacctg-3’；
[0289]
vegfa基因引物序列：
[0290]
上游为5
’‑
ttgccttgctgctctacctcca-3’，
[0291]
下游5
’‑
gatggcagtagctgcgctgata-3’；
[0292]
adm基因引物序列：
[0293]
上游为5
’‑
caaggaatagtcgcgcaagc-3’，
[0294]
下游5
’‑
tgacacgccgtgagaaatca-3’；
[0295]
glut-1基因引物序列：
[0296]
上游为5
’‑
ctgaagtcgcacagtgaata-3’，
[0297]
下游5
’‑
tgggtggagttaatggagta-3’；
[0298]
actin基因引物序列：
[0299]
上游为5
’‑
ccacgaaactaccttcaactcc-3’，
[0300]
下游5
’‑
gtgatctccttctgcatcctgt-3’。
[0301]
pcr反应条件为95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环后再72℃延伸6min。以2-δδct
值(ct代表循环阈值)表示基因mrna的相对表达量。每组实验均重复7次。
[0302]
2.3 western blot检测蛋白表达变化
[0303]
(1)将转染空载或pcdna3.1( )-xrcc6质粒的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集细胞，pbs洗涤3次，按照6孔板每孔加入100μl含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上静置15min后用细胞刮将细胞刮下，收集到1.5mlep管中。使用超声仪裂解细胞，超声程序为：30％input，超声3s，停3s，共超声18s(总时间)。充分裂解后，12000g离心5min，取上清后使用bca试剂盒检测裂解液中的蛋白浓
度。
[0304]
(2)取30μg蛋白样品进行sds-page电泳，将凝胶电泳后的蛋白湿转到pvdf膜，以5％脱脂牛奶溶液室温封闭1h，选择合适的抗体，经一抗二抗结合孵育，以0.1％tbst洗膜4次，每次10min，以便充分去除多余二抗。最后用pbs洗pvdf膜1次，共5min。将pvdf膜转移到干净pbs中，按照1:1配制用辣根过氧化物酶hrp ecl显色液，现配现用，用fusion机器对条带曝光，使用ipp 6.0软件进行统计分析。
[0305]
2.4培养基血管内皮生长因子含量检测
[0306]
将转染空载或pcdna3.1( )-xrcc6质粒的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集培养基，500g离心5min，取上清。依据碧云天的人血管内皮生长因子酶联免疫吸附检测试剂盒(human vegf elisa kit)的操作手册检测不同处理组样品中培养基上清中vegf蛋白的含量。通过每个样品对应组中的细胞总蛋白量来对每个样品的vegf含量进行归一化后进行统计分析。每组实验均重复5次。
[0307]
2.5培养基葡萄糖消耗及乳酸生成检测
[0308]
将转染空载或pcdna3.1( )-xrcc6质粒的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集培养基，500g离心5min，取上清。根据普利莱的葡萄糖氧化酶法测定试剂盒(glucose oxidase method,god)和南京建成的乳酸(lacticacid)测试盒的操作手册检测不同处理组样品培养基上清中葡萄糖和乳酸的含量。通过计算各实验组与常氧空载对照组(normoxia vehicle)之间的葡萄糖及乳酸含量差值，得到葡萄糖摄取量和乳酸生成量后进行统计分析。每组实验均重复4次。
[0309]
3.结果
[0310]
空载(vehicle)或xrcc6过表达载体(xrcc6 oe)转染细胞48h后，给予细胞常氧(normoxia)或低氧(hypoxia)处理8h后，进行检测，结果见图3，图3显示了在人脐静脉内皮细胞中研究xrcc6基因过表达对低氧条件下hif-1下游靶基因及细胞功能的影响；
[0311]
图3a为细胞中xrcc6基因的mrna水平；
[0312]
图3b为β-actin作为内参，hif-1α蛋白水平；
[0313]
图3c1为细胞中hif-1下游靶基因vegfa的表达；
[0314]
图3c2为细胞中hif-1下游靶基因adm的表达；
[0315]
图3c3为细胞中hif-1下游靶基因glut-1的表达；
[0316]
图3d为xrcc6基因过表达的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮生长因子(vegf)含量；
[0317]
图3e1为xrcc6基因过表达的培养基中葡萄糖消耗水平；
[0318]
图3e2为xrcc6基因过表达的培养基中的乳酸生成水平。
[0319]
图3所示结果显示，xrcc6基因过表达载体转染人脐静脉内皮细胞48h并经常氧或低氧处理8h后，细胞中xrcc6基因的mrna水平均显著升高(图3a)，但对低氧诱导的hif-1α蛋白的蓄积没有影响(图3b)。检测hif-1下游靶基因mrna水平的变化情况，显示xrcc6过表达显著增强了低氧条件下细胞中hif-1下游靶基因vegfa，adm以及glut-1的表达(图3c1-图3c3)。低氧条件下，xrcc6过表达的细胞的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮生长因子(vegf)显著升高(图3d)。低氧条件下，xrcc6过表达的细胞的葡萄糖摄取以及乳酸生成都显著升高(图3e)，xrcc6过表达提高了低氧条件下细胞的糖酵解能力。
[0320]
实施例5：xrcc6基因沉默对低氧条件下肝癌细胞中hif-1下游靶基因及细胞功能的影响
[0321]
1.材料
[0322]
1.1细胞
[0323]
实验所需的人肝癌细胞系(hepg2)购自中国科学院细胞库，培养于含有10％灭活胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)、庆大霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100u/ml)的dmem培养基中。细胞培养条件为37℃、5％co2。
[0324]
1.2主要试剂及耗材
[0325]
lipofectamine
tm rnaimax购自于美国thermo fisher scientific公司；trizol试剂购自美国invitrogen公司；逆转录试剂盒以及premix ex taq
tmⅱ试剂盒均购自于日本takara公司；错配sirna以及xrcc6 sirna(核心序列为seq id no.2，5
’‑
gttctatggtac cgagaaa-3’)均由成都擎科生物有限公司合成；ripa裂解液以及蛋白酶复合物均购自于中国碧云天公司；山羊抗hif-1α抗体(af1935)购自美国rd公司；小鼠抗xrcc6抗体(ma5-13110)购自美国invitrogen公司。兔抗山羊igg/辣根酶标记二抗以及山羊抗小鼠igg/辣根酶标记二抗均购自于中杉金桥公司；人血管内皮生长因子酶联免疫吸附检测试剂盒购自于中国碧云天公司；葡萄糖检测试剂盒以及乳酸检测试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。
[0326]
2.方法
[0327]
2.1 xrcc6基因沉默
[0328]
将hepg2肝癌细胞消化后计数，按105个细胞/孔均匀接种在六孔板中，加入2ml培养基，过夜培养。当细胞融合度达到60-70％时进行转染。按照lipofectamine
tm rnaimax的操作手册将xrcc6特异性sirna(sixrcc6)转染入hepg2细胞(5ng/孔)，对照组转染错配sirna(mismatch)。培养24h后更换完全培养基终止转染。
[0329]
2.2rt-qpcr法检测基因表达变化
[0330]
将转染mismatch或sixrcc6的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集细胞，pbs洗涤3次，按照trizol试剂操作手册提取细胞总rna。使用takara逆转录试剂盒去除基因组dna后进行rna逆转录。使用takara的premix ex taq
tmⅱ试剂盒进行rt-qpcr扩增。xrcc6、vegfa、adm、glut-1以及actin基因引物序列见结果4。pcr反应条件为95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环后再72℃延伸6min。以2-δδct
值(ct代表循环阈值)表示基因mrna的相对表达量。每组实验均重复3次。
[0331]
2.3 westernblot检测蛋白表达变化
[0332]
(1)将转染mismatch或sixrcc6的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集细胞，pbs洗涤3次，按照6孔板每孔加入100μl含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。冰上静置15min后用细胞刮将细胞刮下，收集到1.5mlep管中。使用超声仪裂解细胞，超声程序为：30％input，超声3s，停3s，共超声18s(总时间)。充分裂解后，12000g离心5min，取上清后使用bca试剂盒检测裂解液中的蛋白浓度。
[0333]
(2)取30μg蛋白样品进行sds-page电泳，将凝胶电泳后的蛋白湿转到pvdf膜，以5％脱脂牛奶溶液室温封闭1h，选择合适的抗体，经一抗二抗结合孵育，以0.1％tbst洗膜4次，每次10min，以便充分去除多余二抗。最后用pbs洗pvdf膜1次，共5min。将pvdf膜转移到
干净pbs中，按照1:1配制用辣根过氧化物酶hrpecl显色液，现配现用，用fusion机器对条带曝光，使用ipp6.0软件进行统计分析。
[0334]
2.4培养基血管内皮生长因子含量检测
[0335]
将转染mismatch或sixrcc6的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集培养基，500g离心5min，取上清。依据碧云天的人血管内皮生长因子酶联免疫吸附检测试剂盒(human vegf elisa kit)的操作手册检测不同处理组样品中培养基上清中vegf蛋白的含量。通过每个样品对应组中的细胞总蛋白量来对每个样品的vegf含量进行归一化后进行统计分析。每组实验均重复4次。
[0336]
2.5培养基葡萄糖消耗及乳酸生成检测
[0337]
将转染mismatch或sixrcc6的细胞培养48h后进行相应的常氧或低氧处理8h，随后收集培养基，500g离心5min，取上清。根据普利莱的葡萄糖氧化酶法测定试剂盒(glucose oxidase method,god)和南京建成的乳酸(lacticacid)测试盒的操作手册检测不同处理组样品培养基上清中葡萄糖和乳酸的含量。通过计算各实验组与常氧错配sirna对照组(normoxia mismatch)之间的葡萄糖及乳酸含量差值，得到葡萄糖摄取量和乳酸生成量后进行统计分析。每组实验均重复4次。
[0338]
3.结果
[0339]
错配sirna(mismatch)或xrcc6基因sirna(sixrcc6)转染细胞48h后，给予细胞常氧(normoxia)或低氧(hypoxia)处理8h后，进行检测，检测结果见图4显示了在肝癌细胞中研究xrcc6基因沉默对低氧条件下hif-1下游靶基因及细胞功能的影响；
[0340]
其中，
[0341]
图4a为细胞中xrcc6基因的mrna水平；
[0342]
图4b为β-actin作为内参，hif-1α和xrcc6蛋白水平；
[0343]
图4c1为细胞中hif-1下游靶基因vegfa的表达；
[0344]
图4c2为细胞中hif-1下游靶基因adm的表达；
[0345]
图4c3为细胞中hif-1下游靶基因glut-1的表达；
[0346]
图4d为xrcc6沉默的细胞的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮生长因子(vegf)含量；
[0347]
图4e1为xrcc6沉默的细胞的葡萄糖消耗水平；
[0348]
图4e2为xrcc6沉默的细胞的乳酸生成水平。
[0349]
图4所示结果显示，hepg2肝癌细胞中xrcc6基因沉默48h并经常氧或低氧处理8h后，细胞中xrcc6基因的mrna水平(图4a)和蛋白水平(图4b)均显著降低，但对低氧诱导的hif-1α蛋白的蓄积没有影响(图4b)。检测hif-1下游靶基因mrna水平的变化情况，显示xrcc6沉默显著降低了低氧条件下细胞中hif-1下游靶基因vegfa，adm以及glut-1的表达(图4c1-图4c3)。低氧条件下，xrcc6沉默的细胞的培养基上清中的促进细胞生长和血管新生的血管内皮生长因子(vegf)显著降低(图4d)。低氧条件下，xrcc6沉默的细胞的葡萄糖摄取以及乳酸生成都显著降低(图4e1、图4e2)，xrcc6沉默降低了低氧条件下细胞的糖酵解能力。
[0350]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。