一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法

1.本发明涉及微生物电化学领域，属于恩诺沙星的生物阴极降解脱毒技术领域，特别涉及一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法。


背景技术：

2.2000年至2010年，抗生素在世界范围内的使用增加了36％。据报道全球抗生素的使用量15年内大幅度上升了40％，导致大量残留不可避免的进入水体和土壤环境中，特别在水体环境中含量分布极为广泛。目前在江河湖泊、地下水、饮用水、海水以及污水处理厂中已发现几百种抗生素残留。残留的抗生素通过基因突变或者水平转移产生抗性菌(arb)和抗性基因(arg)，其会使抗生素的药效失去作用，影响了抗生素的治疗效果，对生态环境和人体健康造成严重威胁。所以，如何还原降解环境中大量残留的抗生素是一个急需解决的环境问题。
3.喹诺酮类抗生素包括环丙沙星、恩诺沙星和氧氟沙星等，被世界卫生组织定义为“最优先的极其重要的抗菌剂”，是2014年德国医院最常用的抗生素之一。这些合成抗菌药物因其高度稳定的结构而在动物和人体内不好被代谢。因此，在许多环境中，它们的残留浓度通常在μg/l到mg/l的浓度范围内。而最常用的喹诺酮类抗生素是恩诺沙星(enrofloxacin，简称enr)，因此，对enr的残留迫切需要开发有效且经济的处理方法来消除。微生物燃料电池(microbial fuel cell，简称mfc)是一种利用微生物为催化剂，是一种典型的生物电化学系统，可以从有机物的生物氧化中回收生物能量。中国专利cn107601677a公开了一种采用微生物燃料电池降解甲氧苄啶的方法，中国专利cn112473360a公开了一种微生物电解池厌氧处理氯苯废气的方法，现有技术未涉及enr在生物电化学系统中生物阴极去除性能和优势微生物群落，因此，建立一种新型、快速和高效的enr处理方法具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提出一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，通过科学配制mfc反应器的阳极液和阴极液成分，并采用厌氧污泥驯化和共代谢的作用，在生物电化学系统阴极富集降解恩诺沙星的降解菌属和产电的功能菌属，有效促进恩诺沙星的还原降解，丰富产电菌属和降解菌属的数量和种类，并使恩诺沙星降解成低毒性的代谢产物。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，包括如下步骤：
7.(1)构建mfc反应器：以有机玻璃为材料，形成阴极室和阳极室，两个极室采用离子交换膜隔开，以碳刷作为阴极电极和阳极电极，得到mfc反应器；其中，阴极电极作为工作电极，阳极电极作为对电极，饱和甘汞作为参比电极，碳刷使用前的处理方法为：在碳刷中加入丙酮溶液至浸没，浸泡22～26h后，转入0.8～1.2m盐酸溶液中浸没浸泡22～26h，最后在
水中浸没浸泡22～26h后，于马弗炉中400～500℃燃烧35～45min；
8.(2)驯化mfc反应器：包括两个驯化过程，第一个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液，两室均接种厌氧污泥，驯化mfc反应器；第二个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液，驯化mfc反应器；
9.(3)保持22～28℃运行mfc反应器，进行恩诺沙星的还原降解，利用电化学工作站监测mfc反应器的电化学特性，包括电流、阴极电位和循环伏安特性，待mfc反应器具有稳定、明显的电流和阴极电位生成，表明反应器已驯化成功并稳定运行。
10.其中，阳极液，每1l水中包括以下重量的组分：1.00～1.80g乙酸钠、0.10～0.15g kcl、0.28～0.35g nh4cl、11.45～11.65g na2hpo
4-12h2o、2.6～2.8g nah2po
4-2h2o、0.8～1.2ml wolfe维生素微量元素液和0.8～1.2ml wolfe矿质元素液；优选地，每1l水中包括以下重量的组分：1.28g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
11.阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.02～0.03g恩诺沙星、1.00～1.80g乙酸钠、0.10～0.15g kcl、0.28～0.35g nh4cl、11.45～11.65g na2hpo
4-12h2o、2.6～2.8g nah2po
4-2h2o、0.8～1.2ml wolfe维生素微量元素液和0.8～1.2ml wolfe矿质元素液；优选地，每1l水中包括以下重量的组分：0.025g恩诺沙星、1.28g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液。
12.其中，wolfe维生素微量元素液，每1l水中包括以下重量的组分：1～3mg维生素h、1～3mg叶酸、8～12mg盐酸吡哆醇、4～6mg硫胺素、4～6mg核黄素、4～6mg烟酸、4～6mg d-泛酸钙、0.05～0.2mg维生素b12、4～6mg对氨基苯甲酸和4～6mg硫辛酸；
13.wolfe矿质元素液，每1l水中包括以下重量的组分：1～2g次氮基三乙酸、2～4g mgso4·
7h2o、0.2～0.8g mnso4·
h2o、0.5～1.5g nacl、0.05～0.15g feso4·
7h2o、0.05～0.15g cocl2·
6h2o、0.05～0.15g cacl2、0.05～0.15g znso4·
7h2o、0.005～0.015g cuso4·
5h2o、0.005～0.015g alk(so4)2·
12h2o、0.005～0.015g h3bo3和0.005～0.015g na2moo4·
2h2o。
14.进一步说明，阴极室和阳极室的体积比为1：1。
15.进一步说明，步骤(2)中，第一个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液，两室均接种厌氧污泥进行驯化，6～8天为1次循环，驯化后重新接种厌氧污泥和注入阳极液与阴极液反复循环，共进行3-4次循环；所述第二个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液进行驯化，6～8天为1次循环，驯化后重新注入阳极液和阴极液反复循环，共进行3-4次循环。
16.优选地，步骤(2)中，所述第一个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液，两室均接种厌氧污泥进行驯化，7天为1次循环，驯化后分别取出阳极液体积总量的2/3、阴极液体积总量的2/3和底部的厌氧污泥，重新接种厌氧污泥、注入阳极液和的阴极液补足至原体积反复循环，共进行3次循环；所述第二个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入阳极液和阴极液进行驯化，7天为1次循环，驯化后分别取出阳极液体积总量的2/3和阴极液体积总量的2/3，重新注入阳极液和阴极液补足至原体积反复循环，共进行3次循环。
17.进一步说明，第一个驯化过程，阳极室的厌氧污泥和阳极液的体积比为1：4～5，阴极室的厌氧污泥和阴极液的体积比为1：4～5；第二个驯化过程，阳极室中阳极液与阴极室中阴极液的体积比为1：1。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过对生物阴极共代谢基质(碳源)进行调控，科学配制阳极液和阴极液，采用厌氧污泥驯化，可有效促进enr的还原降解，且丰富阳极和阴极生物膜的微生物群落，进一步丰富产电菌群和降解菌群的数量和种类，还可降低enr代谢产物的毒性。本发明不需要外部电源的输入，且提供的阳极液和阴极液温和，适宜微生物的生长繁殖，尤其是产电细菌和降解细菌，可提高反应器的导电性能，进而广泛地适用于各种废水的水质特征，并适用于各种电极材料制备的该反应器，而电极无需使用昂贵的催化剂，具有成本低、高效和环保的优点。
附图说明
19.图1为本发明mfcs反应器碳刷上的微生物电子显微镜扫描图；
20.图2为本发明mfcs反应器对恩诺沙星还原降解的阴极出水浓度和降解效率的变化情况，注：a为恩诺沙星的降解效率图，b为恩诺沙星还原降解的阴极出水浓度图；
21.图3为本发明mfcs反应器的在菌属水平上细菌的群落结构组成。
具体实施方式
22.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
23.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
24.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.实施例1
26.一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，mfc反应器的阳极室和阴极室分别注入阳极液和阴极液：
27.阳极液，每1l水中包括以下重量的组分：1.28g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
28.阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.025g恩诺沙星、1.28g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
29.其中，wolfe维生素微量元素液，每1l水中包括以下重量的组分：2mg维生素h、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg硫胺素、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg d-泛酸钙、0.1mg维生素b12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸；
30.wolfe矿质元素液，每1l水中包括以下重量的组分：1.5g次氮基三乙酸、3g mgso4·
7h2o、0.5g mnso4·
h2o、1g nacl、0.1g feso4·
7h2o、0.1g cocl2·
6h2o、0.1g cacl2、0.1g znso4·
7h2o、0.01g cuso4·
5h2o、0.01g alk(so4)2·
12h2o、0.01g h3bo3和0.01g na2moo4·
2h2o。
31.实施例2
32.一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，mfc反应器的阳极室和
阴极室分别注入阳极液和阴极液：
33.阳极液，每1l水中包括以下重量的组分：1.00g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
34.阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.02g恩诺沙星、1.00g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
35.其中，wolfe维生素微量元素液，每1l水中包括以下重量的组分：2mg维生素h、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg硫胺素、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg d-泛酸钙、0.1mg维生素b12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸；
36.wolfe矿质元素液，每1l水中包括以下重量的组分：1.5g次氮基三乙酸、3g mgso4·
7h2o、0.5g mnso4·
h2o、1g nacl、0.1g feso4·
7h2o、0.1g cocl2·
6h2o、0.1g cacl2、0.1g znso4·
7h2o、0.01g cuso4·
5h2o、0.01g alk(so4)2·
12h2o、0.01g h3bo3和0.01g na2moo4·
2h2o。
37.实施例3
38.一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，mfc反应器的阳极室和阴极室分别注入阳极液和阴极液：
39.阳极液，每1l水中包括以下重量的组分：1.68g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
40.阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.03g恩诺沙星、1.80g乙酸钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；
41.其中，wolfe维生素微量元素液，每1l水中包括以下重量的组分：2mg维生素h、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg硫胺素、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg d-泛酸钙、0.1mg维生素b12、5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸；
42.wolfe矿质元素液，每1l水中包括以下重量的组分：1.5g次氮基三乙酸、3g mgso4·
7h2o、0.5g mnso4·
h2o、1g nacl、0.1g feso4·
7h2o、0.1g cocl2·
6h2o、0.1g cacl2、0.1g znso4·
7h2o、0.01g cuso4·
5h2o、0.01g alk(so4)2·
12h2o、0.01g h3bo3和0.01g na2moo4·
2h2o。
43.根据上述实施例1～3的阳极液和阴极液的配方，一种利用生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的方法，包括如下步骤：
44.(1)以有机玻璃为材料，形成阴极室和阳极室，阴极室和阳极室的体积均为28ml，采用离子交换膜隔开两个极室，以碳刷作为阴极电极和阳极电极，得到mfc反应器，有效体积为27ml,其中，阴极电极作为工作电极，阳极电极作为对电极，饱和甘汞作为参比电极，碳刷尺寸为3cm
×
3.5cm，碳刷使用前的处理方法为：将碳刷浸没浸泡在丙酮溶液中24h，然后在1m盐酸溶液中浸没浸泡24h，再在去离子水中浸没浸泡24h后，于马弗炉中450℃燃烧40min；
45.(2)驯化mfc反应器：包括两个驯化过程，第一个驯化过程：分别向mfc反应器的阳
极室和阴极室注入22ml阳极液和22ml阴极液，两室均接种5ml厌氧污泥进行驯化，7天后分别取出阳极室中15ml阳极液，阴极室中15ml阴极液和反应器底部的厌氧污泥，重新接种厌氧污泥和注入15ml阳极液与15ml阴极液反复循环，7天为1次循环，共进行3次循环，驯化mfc反应器，碳刷上附着厌氧污泥3ml；第二个驯化过程：取出mfc反应器的阳极液、阴极液和沉积在mfc反应器底部的厌氧污泥，分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入24ml阳极液和24ml阴极液进行驯化，7天后取出阳极室中16ml阳极液和阴极室中16ml阴极液，重新注入16ml阳极液和16ml阴极液反复循环，7天为1次循环，共进行3次循环，驯化mfc反应器；
46.(3)保持25℃运行mfc反应器，进行恩诺沙星的还原降解，利用电化学工作站监测mfc反应器的电化学特性，包括电流、阴极电位和循环伏安特性，待mfc反应器具有稳定、明显的电流和阴极电位生成，并且能稳定降解恩诺沙星，表明反应器已驯化成功并稳定运行。
47.对比例1
48.根据实施例1的生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的相同方法，其区别在于：采用葡萄糖替换阴极液的乙酸钠，葡萄糖添加量为0.94g，具体配方为：阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.025g恩诺沙星、0.94g葡萄糖、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；wolfe维生素微量元素液和wolfe矿质元素液的组分及配比同实施例1。
49.对比例2
50.根据实施例1的生物阴极共代谢系统还原降解恩诺沙星的相同方法，其区别在于：采用碳酸氢钠替换阴极液的乙酸钠，碳酸氢钠添加量为2.84g，具体配方为：阴极液，每1l水中包括以下重量的组分：0.025g恩诺沙星、2.84g碳酸氢钠、0.13g kcl、0.31g nh4cl、11.55g na2hpo
4-12h2o、2.77g nah2po
4-2h2o、1ml wolfe维生素微量元素液和1ml wolfe矿质元素液；wolfe维生素微量元素液和wolfe矿质元素液的组分及配比同实施例1。
51.一、实验检测
52.实验分析方法：(a)碳刷上微生物的附着分析：利用扫描电子显微镜(日本hitachi公司，s-3000n)来观察碳刷上微生物的附着情况，群落分布及其形态特征。
53.(b)高效液相色谱仪分析：从阴极室采集2ml水样，用0.22μm的针状过滤器过滤，通过液相色谱(hplc，lc1100，america，色谱柱为zorbax eclipse xdb c-8(150mm
×
4.6mm，5μm)测试反应器运行时阴极出水中的enr浓度，计算生物电化学降解enr的降解率。体系中的流动相为55％甲醇溶液(a)和45％水溶液(b)，流速为1mlmin-1
，测试波长为278nm。
54.(c)还原速率常数k值：mfc反应器中enr的降解符合一级动力学模型，以共代谢基质(碳源)为单因素变量时，还原速率常数k值反映了不同共代谢基质对enr去除性能的影响，一级动力学模型的方程为：lnct＝-kt lnc0，其中c
t
(mg/l)和c0(mg/l)分别为t时刻和0时刻enr的浓度，k(h-1
)为去除速率常数，半衰期(h)可以计算为：t1/2＝ln2/k。
55.(d)微生物群落分析：利用illumina miseq高通量测序技术分析碳刷生物膜上微生物的丰度和多样性，其扩增区域为细菌v3-v4区，计算阳极生物膜产电菌群数量(以comamonas,petrimonas,rhodococcus,rhodopseydomonas,geobacter,aquamicrobium,pseudomonas,sphaerochaeta计)，阴极生物膜降解菌数量(以delftia,bosea,stenotrophomonas,rhodopseudomonas,reyranella,sphingomonas,bradyrhizobium,comamonas,brevundimonas,tissierella,mesotoga,sphingopyxis,syntrophorhabdus,
syntrophobacter,thermovirga,thiobacillus,rhodococcus,paracoccus计)，结果如图3，注：图3中mfc-2-a为实施例1的生物阳极，mfc-1-c为对比例1、mfc-2-c为实施例1、mfc-3-c为对比例2和mfc-4-c为对照组的阴极生物膜上的细菌群落组成，和下表1：
56.[0057][0058]
采用阴极液未添加碳源(乙酸钠、葡萄糖和碳酸氢钠)作为对照组，实验结果如图1～2和表2所示，注：图1和图2中mfc-1为对比例1、mfc-2为实施例1、mfc-3为对比例2和mfc-4为对照组，表2如下：
[0059][0060]
由上表可知，实施例1对enr具有高的降解率，96h可达到91.5％，此时阴极出水的enr浓度降低约为2.12mg/l，产电菌群和降解菌群丰富，表明本发明采用科学配比的阴极液和阳极液，并结合特定的厌氧污泥驯化方式和共基质的培养模式，可丰富产电菌群和降解菌群的数量，从而有效促进enr的快速还原降解，并降低enr代谢产物的毒性，本发明构建的mfc反应器对enr的降解具有高效环保的优点。
[0061]
对比例1和对比例2的阴极采用不同的碳源，enr的降解率有所降低，降解菌群也有所减少，由图1可知，不同碳源喂养的生物阴极，微生物的附着情况不同，表明碳源对mfc反应器的阳极和阴极生物膜的功能菌属的组成和结构会产生一定影响，从而改变产电菌和降解菌的菌落丰富度和多样性。
[0062]
此外，mfc反应器中enr的降解符合一级动力学模型，与葡萄糖(2.22
×
10-2
～6.05
×
10-2
)、碳酸氢钠(1.31
×
10-2
～3.21
×
10-2
)为共代谢基质和无碳源(9.59
×
10-3
～2.42
×
10-2
)的还原速率常数k相比，乙酸钠(2.57
×
10-2
～6.40
×
10-2
)的还原速率常数k较大，表明不同共代谢基质对生物阴极降解enr有影响，而且在以有机碳源为共代谢基质情况下还原降解更为彻底。因此，在不同共代谢基质条件下，生物电化学生物阴极还原降解enr符合k
乙酸钠
》k
葡萄糖
》k
碳酸氢钠
》k
无
。
[0063]
对比例3
[0064]
本对比例与实施例1的区别在于，驯化mfc反应器不同，具体步骤为：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入22ml阳极液和22ml阴极液，两室均接种5ml厌氧污泥进行驯化，7天后取出反应器底部的厌氧污泥和阴阳极液后再重新接种5ml厌氧污泥和注入21ml阳极液与21ml阴极液反复循环，共进行6次循环，驯化mfc反应器；其余步骤同实施例1。
[0065]
由实验结果可知，96h的enr降解率为87.76％。
[0066]
对比例4
[0067]
本对比例与实施例1的区别在于，驯化mfc反应器不同，具体步骤为：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入20ml阳极液和20ml阴极液，两室均接种7ml厌氧污泥进行驯化，10天后取出反应器底部的厌氧污泥和阴阳极液再重新接种7ml厌氧污泥和注入19ml阳极液与19ml阴极液反复循环，共进行3次循环；第二个驯化过程：分别向mfc反应器的阳极室和阴极室注入24ml阳极液和24ml阴极液进行驯化，10天后取出反应器中的阴阳极液重新注入24ml阳极液和24ml阴极液反复循环，共进行3次循环；其余步骤同实施例1。
[0068]
由实验结果可知，96h的enr降解率为88.72％。
[0069]
综上所述，本发明采用不同类型的碳源来配制阴极液和阳极液，利用特定比例的厌氧污泥和enr驯化微生物，探讨生物阴极共代谢基质调控mfc反应器对enr的还原降解，可丰富阳极和阴极生物膜的产电菌群和降解菌群的群落组成，有效地促进enr的降解，并降低enr代谢产物的毒性，本发明降解enr的方法高效且环保，对抗生素废水的处理有一定的指导作用。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。