TET2作为靶标在治疗缺血性血管疾病中的应用

tet2作为靶标在治疗缺血性血管疾病中的应用
技术领域
1.本发明涉及tet2作为靶标在治疗缺血性血管疾病中的应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.在创伤愈合、肌肉和骨骼修复、缺氧和慢性缺血等情况下，血管生成对组织再生或修复至关重要。肢体缺血是最常见的外周动脉疾病之一，与包括中风和心肌梗死在内的心血管事件的发生有关。20世纪90年代末，人类首次尝试用基因疗法来治疗严重的肢体缺血性疾病。到目前为止，除了血管内治疗外，几乎没有其他的治疗方法来恢复缺血组织的血流。因此，寻找血管生成的关键调节因子作为治疗靶点，对促进活体血流恢复具有重要意义。
3.tet(ten-eleven translocation)蛋白是新近发现的一类dna去甲基酶，其催化活性依赖于α-酮戊二酸(α-kg)和fe
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。tet家族包括tet1、tet2和tet3三位成员。tet蛋白可以氧化5-甲基胞嘧啶(5mc)生成5-羟甲基胞嘧啶从而启动dna的去甲基化过程。tet2蛋白最早在白血病患者体内发现，因其在造血过程中具有重要作用，早期的研究结果主要集中在tet2与血液系统恶性肿瘤的关系上。随着研究的不断深入，研究者们发现tet2在其他疾病发生中也具有不可替代的作用。心血管方面，martin,k.a团队发现dna去甲基酶tet2通过维持平滑肌特异基因启动子区的dna低甲基化水平，参与调控动脉粥样硬化等血管损伤过程。sano s团队发现tet2通过影响髓系单核巨噬细胞m1与m2表型的分化，参与调控急性心肌缺血损伤过程。由此提示tet2在心血管疾病的发生发展中具有重要作用。然而，迄今为止尚没有研究揭示内皮细胞中tet2在缺血性血管疾病的血管新生中是否发挥调控作用及其具体机制。
4.血管新生发生于机体多种生理病理过程中，已成为诸多病理过程的标志之一。该过程中会有大量驻留细胞以及动员细胞细胞积极参与，其中内皮细胞发挥了重要作用。毛细血管壁中的内皮细胞会以“出芽”的方式获得侵袭和动员能力，并在vegf的引导下内皮细胞不断迁移与增殖，促进“芽”的不断伸长。内皮细胞以这种方式逐渐融合，形成连续的管腔，进而血管新生。缺血性血管疾病中，靶向内皮细胞，增强内皮细胞功能，将有望成为临床治疗的有效靶点。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是：如何通过血管生成的关键调节因子促进活体血流恢复，从而实现治疗缺血性血管疾病特别是外周动脉疾病的目的。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了抑制tet2表达和/或活性的试剂在制备治疗缺血性血管疾病的药物中的应用。
7.优选地，所述的抑制tet2表达和/或活性的试剂包括tet2的特异性sirna。
8.优选地，所述tet2的特异性sirna的序列为：ggguaagccaagaaagaaatt或
agaaagaaauccaggugaatt。
9.本发明还提供了一种用于治疗缺血性血管疾病的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述活性成分包括抑制tet2表达和/或活性的试剂。
10.优选地，所述的抑制tet2表达和/或活性的试剂包括tet2的特异性sirna。
11.优选地，所述tet2的特异性sirna的序列为：ggguaagccaagaaagaaatt或agaaagaaauccaggugaatt。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
13.1.本发明在细胞水平通过成管以及transwell实验，验证了tet2在内皮细胞成管以及侵袭中的作用，本发明在动物水平用内皮细胞特异性tet2敲除鼠验证了tet2在血流恢复中的作用，本发明为治疗缺血性血管疾病特别是外周动脉疾病寻找到了新的治疗靶点，具有良好的临床应用前景；
14.2.本发明提供了tet2在制备治疗缺血性血管疾病药物中的应用，通过组织特异性敲除tet2可实现显著改善下肢缺血模型中的血流恢复，靶向内皮细胞缺失tet2，有望实现缺血性血管疾病特别是外周动脉疾病的精准治疗。
附图说明
15.图1为rt-qpcr检测缺氧处理不同时间后tet2的mrna表达水平；
16.图2为蛋白质免疫印迹法检测缺氧处理不同时间后tet2蛋白表达水平；
17.图3为rt-qpcr检测huvec细胞分别转染siscramble(nc)和si-tet2(sitet2-1、sitet2-2和sitet2-3)24h后tet2的mrna表达水平；
18.图4为蛋白质免疫印迹法检测huvec细胞分别转染siscramble(nc)和sitet2(sitet2-1、sitet2-2和sitet2-3)24h后tet2蛋白表达水平；
19.图5为matrigel成管实验检测内皮细胞成管能力的结果；
20.图6为transwell实验检测内皮细胞侵袭能力的结果；
21.图7为多普勒扫描成像结果及定量统计结果；其中，wt代表野生小鼠，cdh5-tet2代表tet2敲除小鼠；
22.图8为免疫荧光染色检测毛细血管密度的结果；其中，wt代表野生小鼠，cdh5-tet2代表tet2敲除小鼠；
23.图9为实时荧光定量pcr检测各实验组下肢缺血小鼠组织中vegf的表达水平；其中，wt代表野生小鼠，cdh5-tet2代表tet2敲除小鼠；
24.图10为elisa检测各实验组下肢缺血小鼠组织中vegf总蛋白水平；其中，wt代表野生小鼠，cdh5-tet2代表tet2敲除小鼠。
具体实施方式
25.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
26.实施例1缺氧与内皮细胞中tet2相关性检测
27.为了验证缺氧是否影响内皮细胞中tet2的表达水平，分别通过rt-qpcr法和蛋白质免疫印迹法检测了人脐静脉内皮细胞(huvec)缺氧处理不同时间tet2的转录和表达水
平，结果如图1、2所示，tet2的转录和蛋白表达水平随着缺氧时间依赖性下调。
28.实施例2抑制tet2增强内皮细胞成管以及侵袭能力
29.(1)huvec细胞tet2的敲除：
30.为进一步考察tet2是否参与了调控血管新生，在细胞水平上，本实施例在huvec细胞中用lipofectamine 3000(invitrogen)，根据说明书，分别转染siscramble(nc组，阴性对照组)，sitet2(实验中采用了三对干扰序列进行实验，分别为：sitet2-1/sirna-1：acaagaaaguagaggguautt，sitet2-2/sirna-2：ggguaagccaagaaagaaatt，sitet2-3/sirna-3：agaaagaaauccaggugaatt)，转染24h后，分别通过rt-qpcr和蛋白质免疫印迹法检测了人脐静脉内皮细胞(huvec)tet2的转录和蛋白表达水平，如图3、4所示，结果表明tet2被成功敲除。
31.(2)matrigel成管实验检测内皮细胞成管能力：
32.实验前一天将matrigel置于冰盒中，放入4度冰箱，使胶能过夜缓慢融化。24孔板铺上一层200μl基底膜基质(美国bd生物科学，圣地亚哥，ca)铺好后放入37度培养箱30分钟。接下来，将成功敲除tet2的huvec细胞及阴性对照组huvec细胞收集计数并铺板(1
×
105细胞/孔)，在缺氧情况下再孵育6小时，采集图像，使用imagej软件(nih)对毛细管网络长度进行量化，检测内皮细胞功能的改变，结果如图5所示，结果表明内皮细胞中tet2缺失明显促进内皮细胞成管能力。
33.(3)transwell迁移侵袭实验检测内皮细胞侵袭能力：
34.将成功敲除tet2的huvec细胞及阴性对照组huvec细胞(1
×
104细胞/孔)铺板在transwell小室的上室中，下室更换无血清培养基，在缺氧情况下再孵育24小时。次日，用4％多聚甲醛溶液固定小室中细胞，再用1％的结晶紫溶液染色，最后用棉棒去除上室中的细胞，采集图像，使用imagej软件统计细胞个数，检测内皮细胞的侵袭能力，结果如图6所示，表面tet2敲除的内皮细胞侵袭能力显著增强。
35.实施例3小鼠内皮细胞敲除tet2加速了缺血组织中的血流恢复
36.(1)构建内皮细胞tet2条件敲除小鼠
37.通过cre-floxp技术，构建了tet2-flox小鼠，将其与cdh5-ert2-cre小鼠杂交，成功获得内皮细胞tet2特异性条件敲除小鼠。
38.(2)构建下肢缺血模型
39.所有实验小鼠wt和tet2ko小鼠在股动脉结扎术前一天备皮，用脱毛膏对腹部和双下肢进行脱毛。戊巴比妥钠8mg/ml按10ml/kg进行腹腔注射麻醉。小鼠仰卧位，双下肢胶带固定，暴露右下肢手术视野。沿着血管走向剪开2.5-3厘米的纵形切口，显微镊小心钝性分离，暴露血管和神经。股总动脉有两条向上的动脉分支，以此为定位，分离此处的股动脉。下方表浅处的股浅动脉也分离出来。线穿过股动脉下方，打结，线缝好皮肤，形成下肢缺血模型。激光多普勒灌注血流观察是否手术成功，多普勒扫描结果显示皮tet2敲除小鼠下肢血流恢复相比野生型对照组明显增强，如图7所示。免疫荧光染色检测毛细血管密度结果显示tet2敲除小鼠下肢肌肉组织毛细血管密度相比野生型对照组明显增多，如图8所示。
40.(3)检测模型小鼠下肢缺血组织中的vegf的表达
41.由于下肢缺血组织中的vegf的表达高峰期在术后3d或7d，因此造模3d、7d后，下肢肌肉组织进行vegf的mrna以及elisa检测。实时荧光定量pcr检测组织中vegf的表达水平结
果显示tet2敲除小鼠下肢肌肉组织vegf转录水平相比野生型对照组明显升高，如图9所示。elisa检测结果显示tet2敲除小鼠下肢肌肉组织vegf总蛋白水平相比野生型对照组明显增多，如图10所示。
42.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。