小麦每穗小穗数性状相关SNP位点及其应用

小麦每穗小穗数性状相关snp位点及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种与小麦每穗小穗数相关的 snp位点及其应用。


背景技术：

2.小麦作为世界上主要的粮食作物之一,小麦产量的提高和品质的改善对全世界的粮食安全具有非常重要的意义。每穗粒数是产量构成的三因素之一，而每穗小穗数的提高对于每穗粒数的提高具有重要影响，进而有利于小麦产量的提高。因此,发掘控制小麦每穗小穗数qtl(quantitative trait loci)区段及其优异等位变异,对利用分子标记辅助选择进行穗粒数的遗传改良及主效qtl的进一步应用提供了理论依据，同时对小麦产量性状的遗传改良具有重要意义。
3.目前，研究者已经定位了大量调控每穗小穗数的qtl。小麦的小穗数通过调控每穗粒数进而影响小麦产量。四川农业大学小麦所郑有良教授研究团队利用小麦55k snp芯片和ssr标记，对冬小麦品系
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20828’与国审小麦川农16杂交创制的含有199个株系的重组自交系群体进行基因分型(liu et al.2018)，同时在三年八个生态点对该群体中小穗数的表型进行了鉴定。对每穗小穗数位点进行qtl定位，在2d、4b、5a、5b和5d染色体上共检测到了5个稳定的qtl，其中qsns.sau-2d(lod＝3.47-38.24,pve＝10.16-45.68％)在所有8个环境中均被检测到，能解释10.16-45.68％的表型变异，定位于染色体2ds上；对亲本
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20828’与川农16进行660k snp芯片分型，利用snp分型数据成功开发出与 qsns.sau-2d紧密连锁的kasp标记kasp-ax-94721936。在两个不同的遗传背景群体中利用该标记对主效qtl qsns.sau-2d进行验证，t检验结果表明含有该主效qtl的
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20828’增效位点的株系比不含该位点的株系的每穗小穗数增加 6.93％至14.72％，平均达到11.38％。进一步分析显示含有该主效qtl位点的株系与不含该位点的株系在开花期，株高，穗长，千粒重和穗粒数中均检测到显著差异(p《0.05)，说明每穗小穗数与这些性状存在一定相关。
4.张倩倩等利用“科农9204’与
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京411’衍生的重组自交系群体(kj-ril),对10 个环境下的穗粒数性状进行了分析，将qknps-2a定位在 ax-111707919-ax-111626797的78.5-83.0cm的范围内。为了进一步明确 qtl-qknps-2a的遗传效应,利用与qknps-2a紧密连锁标记ax-110454852对 kj-ril的188个家系进行遗传分析，结果表明,qknps
‑‑
2a优异单倍型能显著增加穗粒数，且能够增加穗粒重和每穗小穗数,单株产量平均增幅为3.72％；而此优异单倍型对千粒重具有负效应。利用310份品种(系)对qknps-2a应用情况进行分析,结果表明,qknps-2a优异单倍型已经被育种家选择,但利用率不高,具有较大的遗传改良空间。研究结果对穗粒数的遗传改良及主效qtl-qknps-2a的进一步应用提供了理论依据。
5.尽管目前已经定位了如此大量的与小麦每穗小穗数相关的qtl。但是，由于绝大多数这些qtl的表型贡献率较小，且在不同年限及环境间重复性差，所以这些qtl难以应用于小麦每穗小穗数的遗传改良。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种小麦每穗小穗数性状相关snp位点及其应用。
7.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
8.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的试剂盒，用于检测序列表中seq id no.1自5’末端第2430位碱基的snp位点单核苷酸多态性；所述snp 位点处的核苷酸为c或g；所述snp位点处的核苷酸为c/c纯合时，相对应的基因型是甲；所述snp位点处的核苷酸为g/g纯合时，相对应的基因型是乙；基因型甲纯合小麦的每穗小穗数大于/候选大于基因型乙纯合小麦的每穗小穗数。
9.进一步的，所述试剂盒包含序列表中seq id no.2和seq id no.3组成的引物对1f和1r，和/或序列表中seq id no.4和seq id no.5组成的引物对2f 和2r。
10.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的分子标记，其核苷酸序列为seq id no.1中5’末端2410-2525位序列。
11.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的分子标记，其核苷酸序列为seq id no.1中5’末端1856-2563位序列。
12.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的引物，用于检测小麦基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性，所述的snp位点对应于seq id no.1所示序列自5’末端第2430位碱基；所述snp位点处的核苷酸为c或g；所述snp 位点处的核苷酸为c/c纯合时，相对应的基因型是甲；所述snp位点处的核苷酸为g/g纯合时，相对应的基因型是乙。
13.进一步的，所述引物为序列表中seq id no.2和seq id no.3组成的引物对1f和1r，和/或序列表中seq id no.4和seq id no.5组成的引物对2f和 2r。
14.所述的试剂盒、分子标记、引物用于鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的用途。
15.所述的试剂盒、分子标记、引物用于小麦分子标记育种和/或小麦辅助育种的用途。
16.一种鉴定或辅助鉴定小麦每穗小穗数性状的方法，包括如下步骤：
17.a、对待测小麦基因组dna中任意一段包含如下snp位点的dna片段进行pcr 扩增，并将该pcr扩增产物进行酶切鉴定；所述snp位点对应于seq id no.1 所示序列自5’末端第2430位碱基；
18.b、确定待测小麦的基因型，所述snp位点处的核苷酸为c/c纯合时，相对应的基因型是甲；所述snp位点处的核苷酸为g/g纯合时，相对应的基因型是乙；
19.c、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的每穗小穗数性状：基因型甲纯合小麦的每穗小穗数大于/候选大于基因型乙纯合小麦的每穗小穗数。
20.作为本发明的一种优选技术方案，步骤a中：所述的pcr扩增的dna片段为seq id no.1中5’末端2410-2525bp；所述的pcr扩增的特异性引物对为seqid no.2和seq id no.3组成的引物对1f和1r，seq id no.4和seq id no.5 组成的引物对2f和2r；所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组dna为模板，以引物1f和1r为引物对扩增得到pcr产物；将此pcr产物稀释10倍，以其作为模板，以引物2f和2r为引物对扩增得到pcr产物；用限制性内切酶smai酶切pcr产物。
21.作为本发明的一种优选技术方案，步骤b中：若pcr产物可以被切开，则该核苷酸多
态性位点为c/c，基因型为甲；若pcr产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为g/g，基因型为乙。
22.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明开发的snp存在两种基因型：基因型甲(c)、基因型乙(g)，这两种基因型的纯合类型中，每穗小穗数大小为：基因型甲纯合的小麦》基因型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述snp的dcaps标记；实验证明，通过检测所述该snp，即可找到每穗小穗数较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种的农业实践和/或相关科学研究中均具有重要意义。
附图说明
23.图1是本发明的snp开发dcaps标记酶切产物电泳检测结果；其中，泳道 m为分子量标准；泳道c为被smai切开的条带，泳道g为不能被smai切开的条带。
具体实施方式
24.以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
25.应当理解，当在本技术说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素的存在或添加。
26.还应当理解，在本技术说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
27.如在本技术说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。
[0028]
另外，在本技术说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0029]
在本技术说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本技术的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
[0030]
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库 (http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。
[0031]
实施例1、与小麦每穗小穗数相关的snp及其pcr-酶切多态性检测
[0032]
1.1、扩增含小麦该snp的基因组片段的特异引物及序列分析
[0033]
在小麦基因组上的基因arf3启动子区发现1个snp，对应于序列表1自5’末端的第
2430位、；该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：
[0034]
基因型甲：c
[0035]
基因型乙：g
[0036]
根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物pcr扩增分别包含该 snp位点在内的dna片段：
[0037]
f1：cggagggagtatgtgctcaaactag(seq id no：2)；
[0038]
r1：ttcaaaataatggtcagactgctctcc(seq id no：3)；
[0039]
f2：caaacagggttgtatcatactgc(seq id no：4)；
[0040]
r2：ggtgctattaattaacccgg(seq id no：5)；
[0041]
以f1和r1为引物对pcr扩增的靶序列如序列表的序列1所示的1856-2563 位序列；以f2和r2为引物对pcr扩增的靶序列如序列表的序列1所示的 2410-2525位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被smai识别。
[0042]
1.2、pcr-酶切多态性检测及基因分型方法的建立
[0043]
1)提取待测小麦的基因组dna；
[0044]
2)以步骤1)的基因组dna为模板，用引物f1和r1进行pcr扩增，pcr 扩增的体系(20μl)为：ddh2o7μl、taqmix 10μl、引物f1(10μmol/l)和引物r1(10μmol/l)各1μl、模板(20ng/μl)1μl。
[0045]
pcr扩增条件为94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30次循环；72℃ 10min，16℃保存。
[0046]
3)将步骤2)的pcr产物稀释10倍，以其为模板，用引物f2和r2进行pcr扩增，pcr扩增的体系(20μl)为：ddh2o7μl、taqmix 10μl、引物f2 (10μmol/l)和引物r2(10μmol/l)各1μl、模板(20ng/μl)1μl。
[0047]
pcr扩增条件为94℃2min；94℃30s，52℃30s，72℃15s，32次循环；72℃ 10min，16℃保存。
[0048]
4)将步骤3)得到的pcr产物用smai酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录pcr产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：
[0049]
若所述酶切产物为两个片段，则待测小麦在所述位点为c纯合(表示为c/c) 的小麦(图1中的泳道c)；
[0050]
若所述酶切产物为一个片段，则待测小麦在所述位点为g纯合(表示为g/g) 的小麦(图1中的泳道g)。
[0051]
5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下i、ii两种类型：
[0052]
i：c/c(即基因型甲纯合)；
[0053]
ii：g/g(即基因型乙纯合)；
[0054]
所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
[0055]
1.3、利用dcaps标记对自然群体进行分型并与每穗小穗数性状进行关联分析
[0056]
以320份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1 所示。
[0057]
表1小麦自然群体中所述多态性位点的情况
[0058]
[0059]
[0060]
[0061][0062]
实施例2、taarf3-3a基因多态性位点与小麦每穗小穗数的关联分析
[0063]
2018年，在中国科学院农业资源研究中心栾城实验站(河北栾城)的旱地， 2019年在中国科学院农业资源研究中心衡水实验农场(河北栾城和衡水)的旱地和水地种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的每穗小穗数，用tassel2.1 软件对每穗小穗数和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型 群体结构(mlm (q k))方法进行分析，以p《0.05为显著性水平，结果如表 2所示。
[0064]
表2自然群体中taarf3-3a基因多态性位点的情况与每穗小穗数的关联分析结果
[0065][0066]
表2的关联分析结果表明，表1所示的320份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的每穗小穗数差异均达到显著水平(p《0.05)。其中，类型i的小麦每穗小穗数高于类型ii的小麦每穗小穗数。几个环境中，类型i的小麦材料的每穗小穗数分别较ii的小麦高0.38、0.43、0.45、0.43和0.37个小穗。对自然群体的研究表明，类型i是提高小麦每穗小穗数的优异基因型。
[0067]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
[0068]
综上实施例可见，本发明公开了一种与小麦每穗小穗数相关的snp位点及其应用。本发明通过对小麦自然变异群体中arf3-a基因启动子区的遗传变异分析，发现有一个snp，对应于序列表1自5’末端第2430位，该snp存在两种基因型：基因型甲(c)、基因型乙(g)。通过关联分析证明，这两种基因型的纯合类型中，每穗小穗数大小为：基因型甲纯合的小麦》基因型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述snp的dcaps标记。实验证明，通过检测所述该snp，即可找到每穗小穗数较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。
[0069]
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。