一种卵子玻璃化冷冻保护液的制备方法

1.本发明涉及一种玻璃化冷冻液及其制备方法，属于人类辅助生殖技术领域。


背景技术：

2.人卵(卵子或卵细胞)低温保存是重要的辅助生殖技术，在女性生育力保 存、不育症治疗、防控卵巢过度刺激综合症风险和避免胚胎冷冻有关的法律、 伦理等方面发挥着重要的作用。我国是人口大国，随着经济、社会的发展，生 育力受到年龄(女性在35岁后生育力急剧下降)和疾病威胁(如患癌女性的放 疗和化疗可严重损伤卵巢机能)的女性大量增多，对卵低温保存的需求日益增 强，因此提供一种新的卵子玻璃化冷冻保护液的制备方法是必须解决的技术问 题。


技术实现要素：

3.针对上述之缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种卵子玻璃化冷冻 保护液的制备方法，本发明所采用的技术方案是，一种卵子玻璃化冷冻保护液 的制备方法，包括以下步骤：量取2.8-3.2ml pbi、1.6-1.8g蔗糖，将蔗糖置于 pbi中，溶解，再加入1.8-2.2ml胎牛血清、1.3-1.7ml乙二醇、1.3-1.7ml二甲 基亚砜，用pbi定容至10ml，将18-22μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合 即得卵子玻璃化冷冻液。
4.所述的pbi培养液的制备方法，包括以下步骤：称取0.1份葡萄糖、0.0036 份丙酮酸钠、0.0075份盘尼西林、0.0050份硫酸链霉素、0.4000份牛血清白蛋 白混合，得第一混合物，将第一混合物溶解在100mlpbs中，得第一溶液，当 第一溶液渗透压为266～294mosm时，即得pbi培养液。
5.所述的金属螯合剂edta溶液的制备方法，包括以下步骤：称取 0.6204gedta，加入5ml超纯水后混匀，加入1n naoh直到edta溶解，调ph 值到7.2-7.4，最后定容到10ml即得0.1m edta母液。
6.优选的，包括以下步骤：量取2.8ml pbi、1.6g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入1.8ml胎牛血清、1.3ml乙二醇、1.3ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将18μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
7.优选的，包括以下步骤：量取3.2ml pbi、1.8g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入2.2ml胎牛血清、1.7ml乙二醇、1.7ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将22μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
8.优选的，包括以下步骤：量取3.0ml pbi、1.7g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入2.0ml胎牛血清、1.5ml乙二醇、1.5ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将20μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
9.优选的，包括以下步骤：量取2.8ml pbi、1.8g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入1.8ml胎牛血清、1.7ml乙二醇、1.3ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将22μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
10.本发明制备方法与现有技术相比，本发明方法简单易操作，本发明原料来 源广泛，易取得，成本低，本发明方法制得的冷冻液内添加有乙二醇、二甲基 亚砜、蔗糖，不仅可以有效地保存卵子、胚胎及组织细胞的活力，增加卵子、 胚胎存活率和相应的成功率，从而提高辅助生殖技术的成功率，同时，也为辅 助生殖技术的安全性提供了有力保证，是卵子玻璃化冷冻保护液的制备方法上 的一大创新。
具体实施方式
11.下面结合具体实施实施方式对本发明做进一步说明：
12.一种卵子玻璃化冷冻保护液的制备方法，其特征在于，量取2.8-3.2ml pbi、 1.6-1.8g蔗糖，将蔗糖置于pbi中，溶解，再加入1.8-2.2ml胎牛血清、1.3-1.7ml 乙二醇、1.3-1.7ml二甲基亚砜，用pbi定容至10ml，将18-22μl的0.1m edta 溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
13.所述的pbi培养液的制备方法，包括以下步骤：称取0.1份葡萄糖、0.0036 份丙酮酸钠、0.0075份盘尼西林、0.0050份硫酸链霉素、0.4000份牛血清白蛋 白混合，得第一混合物，将第一混合物溶解在100ml pbs中，得第一溶液，当 第一溶液渗透压为266～294mosm时，即得pbi培养液。
14.所述的金属螯合剂edta溶液的制备方法，包括以下步骤：称取 0.6204gedta，加入5ml超纯水后混匀，加入1n naoh直到edta溶解，调ph 值到7.2-7.4，最后定容到10ml即得0.1m edta母液。
15.具体的，包括以下步骤：量取2.8ml pbi、1.6g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入1.8ml胎牛血清、1.3ml乙二醇、1.3ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将18μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
16.具体的，包括以下步骤：量取3.2ml pbi、1.8g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入2.2ml胎牛血清、1.7ml乙二醇、1.7ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将22μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
17.具体的，包括以下步骤：量取3.0ml pbi、1.7g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入2.0ml胎牛血清、1.5ml乙二醇、1.5ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将20μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
18.具体的，包括以下步骤：量取2.8ml pbi、1.8g蔗糖，将蔗糖置于pbi中， 溶解，再加入1.8ml胎牛血清、1.7ml乙二醇、1.3ml二甲基亚砜，用pbi定容 至10ml，将22μl的0.1m edta溶液与上述pbi混合即得卵子玻璃化冷冻液。
19.本发明方法制备的卵子玻璃化冷冻液具体使用时，采用封闭式载体即麦管， 单麦管管壁与双麦管管壁相比较薄，冻存与解冻过程中单麦管内温度传导过快， 温差过大，易导致管壁炸裂，损伤卵子，由此使用双麦管法冻存。具体使用步 骤如下(以小白鼠为例)：
20.(1)将mhtf、透明质酸酶、pbi、平衡液、玻璃化冷冻液放到co2培 养箱中预热至少30min。
21.(2)在腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)12-14h后用颈椎脱臼法处 死小鼠。
22.(3)无菌操作下打开腹腔，剪下输卵管壶腹部并放到预热好的mhtf。
23.(4)在解剖显微镜下用1ml注射器针头从壶腹部膨大部位划出卵团细胞。
24.(5)将卵团细胞转移至透明质酸酶中，消化3min左右得到单个的带有放 射冠的卵子。
25.(6)将单个的带有放射冠的卵子一分钟内通过三滴pbi，进行清洗。
26.(7)将带有放射冠的卵子转移到平衡液中平衡9～10min。
27.(8)将带有放射冠的卵子转移到冷冻液中。操作温度分别设置为37℃和 22℃。
28.(9)分别在30～40s、＞40～90s、＞90～180s内通过三滴玻璃化冷冻液。
29.(10)将含有放射冠的卵的冷冻液体积分别控制在＞0.1～0.5μl、＞0.5～1.0 μl。
30.(11)玻璃化液装载到一个端部半切除的0.25ml冷冻麦管端部，将装载的 麦管轻轻插入一个0.5ml保护冷冻麦管内(保护麦管两端密封)。
31.(12)液氮(-196℃)中保存。
32.卵子冷冻一直是生育力研究的重难点之一，寻求合适的冻融技术一直是科 技工作者研究的重点，本发明方法提供的卵子玻璃化冷冻保护液，通过快速降 温形成一种粘稠的无结构的玻璃化状态，避免冰晶的形成，从而有效的保护好 卵子。玻璃化冷冻技术可以保证在卵子在冻存液中脱水时，胞内大分子物质和 进入到卵子内的冻存液增加胞内溶液粘稠度，从而保证卵子在剧烈的快速降温 过程中损害降至最小。