一种基于三维支架的细胞培养方法与流程

1.本发明涉及医疗器械技术领域，具体为一种基于三维支架的细胞培养方法。


背景技术：

2.生物支架通过模拟人体天然微环境的理化特性，能有效促进干细胞的自我更新、增殖以及定向分化等，近年来被广泛应用于再生医学领域，一般在下肢静脉溃疡的护理中，需要用到生物支架，组织引导再生膜技术是目前临床应用较成功的组织工程应用性技术，其基本原理是：利用膜技术将组织缺损区与周围组织隔离，阻挡周边纤维细胞/组织的侵入，为缺损内的组织生长创造一定的有利环境。其具有制作简单、组织适用性强、临床操作简便等独有特点。目前此类膜在骨科学，牙科学、神经、血管再生方面皆有广泛深入研究。目前已有胶原膜材料(如biogide)、透明质酸(如hyaff 11)用于临床。
3.但是，该传统的支架只能运用于缺损组织的表面修复，无法形成立体结构，使再生组织充分长入支架，则会阻挡大分子营养物质、细胞因子的传递或交流，影响组织再生，同时局部降解产物较多，排泄不畅，影响组织生成。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于三维支架的细胞培养方法，以解决传统支架只能运用于缺损组织的表面修复，无法形成立体结构，使再生组织充分长入支架，则会阻挡大分子营养物质、细胞因子的传递或交流，影响组织再生，同时局部降解产物较多，排泄不畅，影响组织生成的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于三维支架的细胞培养方法，包括三维支架，所述三维支架包括以下重量百分比组分：聚合物91.85～98.05％和液体1.95～8.15％；
6.其中，所述聚合物包括以下重量百分比组分：si28.5～37.4％、si-oet21～28％、si-oh1.2～4.6％和si-o25.6～39.4％。
7.优选的，所述液体包括以下重量百分比组分：水1.3～4.1％、乙醇0.38～3.26％和硝酸0.04～0.19％。
8.优选的，所述三维支架为三维结构支架。
9.优选的，所述三维支架为网状结构。
10.一种基于三维支架的细胞培养方法，包括以下步骤：
11.s1、将聚合物、水、乙醇和硝酸一起放入搅拌罐内进行水解缩合反应，反应时间为15～29h；
12.s2、然后将步骤s1中反应后的原料放入蒸发釜内，反应时间为4～8h，并通入压缩空气，蒸发过程中释放出水和乙醇；
13.s3、然后将步骤s2中的原料进行熟化处理，温度控制在2～6℃，并且粘度控制在40～70pa
·
s；
14.s4、然后将步骤s3中的纺丝纤维进行纺丝切割，并通入压缩空气，质量控制在380～480mg；
15.s5、最后将步骤s4中的纤维敷料进行包装，并对其进行辐照灭菌，即可得到三维支架。
16.优选的，所述步骤s1中，温度为35～41℃，搅拌转速为100～140转/分钟。
17.优选的，所述步骤s2中，温度为52～79℃，搅拌转速为110～150转/分钟。
18.优选的，所述步骤s2中，原料粘度为0.6～1.9pa
·
s。
19.优选的，所述步骤s4中，纺丝纤维压缩比为16～26％。
20.优选的，所述步骤s4中，纺丝纤维密度为73～123mg/cm3。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.本发明通过提供一个促进皮肤组织生长的三维结构支架，可以作为细胞增殖和毛细血管的生长支架，促进目标细胞生长、增殖、分化等，并形成一定的组织，从而促进伤口愈合，并且三维结构的支架可提供一个缺损内部细胞组织充分长入的空间，而且在伤口愈合过程中逐渐被吸收并被组织取代，可用于下肢静脉溃疡皮肤组织创伤修复。
附图说明
23.图1为本发明的制备方法流程图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：
26.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种基于三维支架的细胞培养方法，包括三维支架，所述三维支架包括以下重量百分比组分：si32.6％、si-oet21.4％、si-oh3％、si-o35.6％、水4.1％、乙醇3.26％和硝酸0.04％。
27.其中，所述三维支架为三维结构支架。
28.其中，所述三维支架为网状结构。
29.一种基于三维支架的细胞培养方法，包括以下步骤：
30.s1、将聚合物、水、乙醇和硝酸一起放入搅拌罐内进行水解缩合反应，反应时间为18h，温度为37℃，搅拌转速为120转/分钟；
31.s2、然后将步骤s1中反应后的原料放入蒸发釜内，反应时间为6h，温度为65℃，搅拌转速为130转/分钟，并通入压缩空气，蒸发过程中释放出水和乙醇，原料粘度为1.2pa
·
s；
32.s3、然后将步骤s2中的原料进行熟化处理，温度控制在4℃，并且粘度控制在60pa
·
s；
33.s4、然后将步骤s3中的纺丝纤维进行纺丝切割，并通入压缩空气，质量控制在420mg，纺丝纤维压缩比为21％，密度为103mg/cm3；
34.s5、最后将步骤s4中的纤维敷料进行包装，并对其进行辐照灭菌，即可得到三维支架。
35.实施例2：
36.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种基于三维支架的细胞培养方法，包括三维支架，所述三维支架包括以下重量百分比组分：si34.5％、si-oet25％、si-oh2.5％、si-o33.3％、水2.7％、乙醇1.45％和硝酸0.1％。
37.一种基于三维支架的细胞培养方法，包括以下步骤：
38.s1、将聚合物、水、乙醇和硝酸一起放入搅拌罐内进行水解缩合反应，反应时间为18h，温度为37℃，搅拌转速为120转/分钟；
39.s2、然后将步骤s1中反应后的原料放入蒸发釜内，反应时间为6h，温度为65℃，搅拌转速为130转/分钟，并通入压缩空气，蒸发过程中释放出水和乙醇，原料粘度为1.2pa
·
s；
40.s3、然后将步骤s2中的原料进行熟化处理，温度控制在4℃，并且粘度控制在60pa
·
s；
41.s4、然后将步骤s3中的纺丝纤维进行纺丝切割，并通入压缩空气，质量控制在420mg，纺丝纤维压缩比为21％，密度为103mg/cm3；
42.s5、最后将步骤s4中的纤维敷料进行包装，并对其进行辐照灭菌，即可得到三维支架。
43.实施例3：
44.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种基于三维支架的细胞培养方法，包括三维支架，所述三维支架包括以下重量百分比组分：si32.75％、si-oet24.4％、si-oh3％、si-o32.6％、水4.1％、乙醇3.26％和硝酸0.19％。
45.一种基于三维支架的细胞培养方法，包括以下步骤：
46.s1、将聚合物、水、乙醇和硝酸一起放入搅拌罐内进行水解缩合反应，反应时间为18h，温度为37℃，搅拌转速为120转/分钟；
47.s2、然后将步骤s1中反应后的原料放入蒸发釜内，反应时间为6h，温度为65℃，搅拌转速为130转/分钟，并通入压缩空气，蒸发过程中释放出水和乙醇，原料粘度为1.2pa
·
s；
48.s3、然后将步骤s2中的原料进行熟化处理，温度控制在4℃，并且粘度控制在60pa
·
s；
49.s4、然后将步骤s3中的纺丝纤维进行纺丝切割，并通入压缩空气，质量控制在420mg，纺丝纤维压缩比为21％，密度为103mg/cm3；
50.s5、最后将步骤s4中的纤维敷料进行包装，并对其进行辐照灭菌，即可得到三维支架。
51.综合以上实施例所述，本发明通过提供一个促进皮肤组织生长的三维结构支架，可以作为细胞增殖和毛细血管的生长支架，促进目标细胞生长、增殖、分化等，并形成一定的组织，从而促进伤口愈合，并且三维结构的支架可提供一个缺损内部细胞组织充分长入的空间，而且在伤口愈合过程中逐渐被吸收并被组织取代，可用于下肢静脉溃疡皮肤组织创伤修复。
52.产品及其降解产物：
53.产品为原硅酸的非结晶聚酯，其在形式、组成、结构、化学行为和降解产物方面与晶态二氧化硅完全不同。产品降解后，含硅的降解产物为原硅酸[sio(oh)2]4，与硅溶胶之间也存在差异。从化学角度而言，硅溶胶颗粒与本产品的区别在于乙氧基，硅溶胶颗粒中的乙氧基含量极低，与水相遇后，形成的原硅酸含量极低或根本未形成。本产品含有相对较高的乙氧基含量(最高可达30％)。这些乙氧基可避免纤维发生缩合反应，导致形成很难降解/无法降解的-si-o-si-链。因此，不要混淆硅产品或其降解产物与晶态二氧化硅、硅胶或硅溶胶(无定形)。原硅酸在中性ph环境时是惰性的，但在饱和溶液中能缩合形成硅酸二聚体和小的寡聚体。原硅酸的缩合降低了其溶解度，从而降低了生物利用度，然而在体内生理环境中不会发生这种缩合，因为从来不会达到饱和条件。
[0054]
另一个降解产物乙醇，由于乙氧基水解，乙醇在水或生理液体中从纤维中释放出来。在水环境下，以一片敷料(技术要求规格430
±
50mg)理论上计算乙醇的最大释放量：产品中乙醇的含量包括游离乙醇(技术要求不大于wt.6％)和乙氧基(技术要求wt.20
±
10％)水解后的乙醇，所以乙醇的最大释放量应为：480mg
×
(30 6)％≈173mg＝0.173g。在人体中，这些释放的酒精会迅速扩散到人体血液中，而正常成人血液中都含有少量乙醇，正常人体血液中所含乙醇含量约为0.003％。我们按照最恶劣的情况来分析，如果一片敷料在瞬间释放出全部乙醇，按照人体5l血液量(成人常规血液量)计算乙醇浓度百分比为：0.173g/0.8g/ml/5000ml≈0.004％(0.8g/ml为乙醇密度)，这接近人体血液中正常的乙醇含量。从另一方面来看，在实际临床应用中，产品使用过程和伤口环境都需要保持湿润状态，而一片敷料至少使用约50ml生理盐水才能浸润，不考虑组织液堆积的情况，按照上述乙醇瞬间降解后的释放量0.173g，转换乙醇最大释放体积为：0.173g/0.8g/ml≈0.2ml，则乙醇的局部体积浓度约为0.2ml/50ml＝0.4％，这远远低于产生消毒效果的乙醇含量(根据资料70％～75％的酒精用于消毒)。
[0055]
产品使用要点：产品可随意剪裁直至适合伤口大小；使用前清创：以确保创面无坏死组织及伤口边缘包含活体组织；湿性作用环境：干燥状态下将该基于三维支架的细胞培养方法应用在伤口上，然后使用无菌生理盐水对其进行润湿；结合二级敷料使用：二级敷料用于固定并维持伤口湿润环境；敷料的更换：纤维融入到肉芽组织中更换，或其他外界因素导致产品的剥离脱落时更换。
[0056]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0057]
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。