透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统HSSGNPs及其制备方法和应用

透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统hssg nps及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，涉及一种聚合物前药多生物响应给药系统的构建，特别是指透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统hssg nps及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌 (hcc)是最常见的肝癌类型，占所有病例的 75-85%。hcc患者的5年生存率仅占18%，使其成为仅次于胰腺癌的第二大致命恶性肿瘤。化疗，除手术和放射治疗外，仍是治疗肿瘤疾病的主要治疗方法。尽管各种化疗药物，包括索拉非尼、洛伐他汀、多柔比星和米托蒽醌作为单药或联合用药都用于临床治疗肝癌，但是其组织选择性差，无法有效靶向肿瘤部位，限制了治疗效果，并导致严重的副作用。因此需要高效低毒的有效药物来治疗hcc。天然化合物可用于创造新疗法。
3.香叶醇是一种天然存在的无环单萜，存在于天竺葵、香茅、樟科山苍子和蔷薇科中。它具有广泛的药理特性，包括抗氧化、抗微生物、抗炎、神经保护和抗溃疡特性，以及驱虫剂和杀虫剂特性。同时，它已被证明在体内外对肝癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、结肠癌细胞、前列腺癌和舌癌都具有抗肿瘤作用，以及在肿瘤前病变中起作用。然而，由于其溶解性弱、挥发性和生物利用度低，很难在临床治疗中发挥有利作用。在过去的十年中，自组装纳米聚合物在癌症治疗领域引起了广泛关注，因为它们具有显着增加疏水性药物溶解度、延长血液循环和提高抗癌功效的能力。最近的研究表明，当肿瘤微环境中的特定因子被激活时，生物响应纳米颗粒可能会改变其理化特性，导致药物在肿瘤细胞中的空间释放。由于许多生物因素同时在肿瘤部位发生变化，多生物响应性纳米颗粒已被证实表现出比单一刺激反应更好的肿瘤特异性药物释放能力。众所周知，透明质酸 (ha) 因其高度的生物相容性、免疫原性和亲水性而被广泛应用于生物医学领域。此外，ha可以特异性结合多种癌细胞过表达的cd44受体，因此可作为药物靶向载体用于药物递送和癌症治疗。此外，作为cd44的天然配体，ha也可以在肿瘤部位被透明质酸酶 (haase) 特异性降解。
4.据报道，氧化还原剂谷胱甘肽 (gsh) 的细胞内浓度可高达10mm，而其在细胞外液中的浓度仅为2-20μm。此外，癌细胞中gsh的含量是正常细胞的四倍。因此，可以通过添加谷胱甘肽来分解含二硫键的药物偶联物或纳米颗粒，从而达到氧化还原反应性药物释放效果。


技术实现要素：

5.本发明提出一种透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统hssg nps及其制备方法和应用，该给药系统可以对ph、gsh或haase进行响应，解决了现有香叶醇（ger）的水溶性低和生物利用度差，极大地阻碍了其向临床的转化的技术问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
一种透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统hssg nps，其具有如下结构：。
7.进一步，所述给药系统hssg nps是hssg上的亲水性基团ha与疏水性基团ger通过二硫键结合并自组装成nps来合成的。
8.进一步，所述给药系统hssg nps具有ph/谷胱甘肽/透明质酸酶响应的药物释放能力。
9.上述的给药系统hssg nps的合成路线为：具体制备方法，步骤如下：（1）将 ha（300 mg，0.792 mmol）、edc
·
hcl（0.5-2 mmol）和 nhs（109.3 mg，0.5-2 mmol）在 25℃ 搅拌下溶解在 10 ml去离子 (di) 水中以激活ha的羧基。搅拌30分钟后，将cys（535.1mg，1-5 mmol）加入上述活化的ha的nhs酯中，然后将反应混合物搅拌约24小时。之后，将反应混合物倒入透析管中(mwco 3.5kda) 并透析 72 小时。最后，通过冻干收集产物ha-cys。
10.（2）在200ml干燥圆底中准确称取ger（1.54g，10mmol）、sa（5-15 mmol）和dmap（10mg，催化量），加入50ml无水二氯甲烷。在氩气保护下加入0.001-0.02 mmol吡啶，室温搅拌24小时。反应结束后，依次用2n盐酸和h2o洗涤，有机相用硫酸镁干燥。除去溶剂后，得到黄色油状产物ger-sa。
11.（3）在温和加热条件下将 ha-cys (476mg) 溶解在3 ml甲酰胺中并冷却至25℃。
然后，将溶液用 2ml dmso 稀释。在25℃下，将 ger-sa（40-80 mg）、edc（40-80 mg）和 nhs（20-50 mg）溶解在5 ml dmf 中。搅拌 30 分钟后，将 ha-cys 溶液引入活化的ger溶液中，然后在 25℃下搅拌 24 小时。最终混合物透析72 小时（mwco 3.5kda）。通过冻干收集ha-ss-ger(hssg)。
12.（4）hssg在 0 ℃ 和 150 w 下通过探头超声仪进行超声处理，然后分散在5 ml去离子水中，超声分散液通过 0.45 μm膜过滤器过滤得hccg nps。
13.上述的给药系统hssg nps在制备靶向 cd44 受体药物中的应用。
14.上述的给药系统hssg nps在制备抗肿瘤药物中的应用，所述给药系统hssg nps的使用尺寸为101.7nm，载药效率为18.5%。
15.本发明具有以下有益效果：1、本发明的靶向和多个生物响应性hssg nps用于活性cd44 受体介导的选择性 ger 递送、多个生物响应性快速ger释放，这引起ger的细胞内积累增强以诱导癌细胞凋亡并提高抗癌活性。此外，随着酰胺键的形成，hccg前药偶联物通过己二酸二酰肼 (adh) 接头连接ha和ger，用作无反应控制。
16.2、本发明的多生物响应给药系统hssg nps 具有所需的粒径仅107.1 nm，平均直径约为 110 nm，呈均匀的球形，并在不同的生理介质中保持稳定性。此外，当这些 nps 暴露于模拟肿瘤微环境中的多重特征（ph/谷胱甘肽/透明质酸酶）的缓冲液时，它们显示出加速的药物释放速率。荧光显微镜和流式细胞术的结果证实，纳米系统通过靶向cd44受体介导的内化作用被人肝癌细胞系 hepg2 和 huh7 选择性吸收。且对ph/谷胱甘肽/透明质酸酶响应的药物释放能力。
17.3、本发明的多生物响应给药系统hssg nps稳定性高，具有ha的nps 的功能化提高了其在肝癌细胞hepg2、huh7和 h22 荷瘤小鼠中的内化效率。与 ger 和 hccg nps 相比，显着促进了癌细胞的死亡并增强了对肿瘤生长的抑制，同时降低了毒性。因此，hssg nps作为简单高效的平台在肿瘤靶向药物递送和治疗方面具有巨大潜力。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1为hssg前药偶联物的合成和表征。其中(a) hssg 偶联物的合成途径。 (b) d2o中ha、cdcl3中ger、d2o中hccg和d2o中hssg 的1h nmr 光谱。(c) ha、ger、hccg和hssg的ft-ir光谱。
20.图2为hssg 和 hssg nps 的制备和表征，其中（a）hccg（左）和hssg（右）的tem图像 [比例尺：500 nm]。(b) hccg 和 hssg 的粒径分布。(c) hccg 和 hssg 在 0.1 m pbs（ph 7.4）和 0.1m pbs（含 10% fbs）中的时间依赖性粒径大小大小。(d)具有不同 ph 值 (ph = 5.5, 6.8, 7.4)。(e) 不同 gsh 浓度 (0, 10 μm和 10 mm) 在 ph = 6.8 的缓冲液中药物从ha功能化nps的体外累积释放曲线和(f)在ph = 6.8 时各种haase浓度（0、5和50 iuml-1）。数据表示为平均值
±ꢀ
s.e.m. (n = 3)。
[0021]
图3为ir780-hssg的细胞摄取。其中(a)hepg2和(b)huh-7细胞在不同时间 (0, 1, 3, 6, 12和24h) 与 ir780-hssg 相互作用的荧光图像，红色荧光表明存在ir780-hssg，蓝色荧光表明dapi阳性染色，[比例尺= 100 μm]。(c)hepg2 和(d)huh-7细胞在不同时间（0、1、3、6、12 和 24 小时）与 ir780-hssg 相互作用的流式细胞术分析，计算ir780-hssg的平均荧光强度。(e)hepg2和(f)huh-7细胞的流式细胞术分析与ir780-hssg和不同的摄取抑制剂相互作用。计算ir780-hssg的平均荧光强度。数据表示为平均值
±ꢀ
s.e.m. (n = 3, *p 《 0.05, ***p 《 0.001)。
[0022]
图4为体外细胞摄取研究。其中(a) ha、ger、hccg和hssg在24、48和72h对hepg2和huh7细胞的细胞毒性。(b)使用calcein-am/pi染色的不同制剂处理诱导的 hepg2和huh7细胞活力。[比例尺 = 200 μm]。
[0023]
图5为在体外抑制增殖并引起细胞周期停滞、细胞凋亡作用。(a) edu法检测各组hepg2和huh-7细胞的dna复制活性，[比例尺 = 100 μm]。 (b) 通过tunel法测定凋亡水平，[比例尺 = 100 μm]。(c) 分析各组的增殖率。(d)凋亡指数计算公式为：凋亡指数 =（阳性染色的凋亡细胞）/（细胞总数）
×
100%。 (e)使用流式细胞术测量用 pbs、ha、ger、hccg 和 hssg 处理的 hepg2 和 huh-7 细胞的凋亡率。(f)流式细胞仪检测用于检测 hepg2和 huh7细胞中的细胞周期分布。(g) 计算凋亡细胞的百分比 (%)。(h) 细胞周期结果的统计分析。(i) jc-1法检测的线粒体膜电位荧光图像。[比例尺 = 50 μm]。(j) 细胞凋亡蛋白表达水平的蛋白质印迹分析。（k，l）在每组中对每个因素进行光密度分析，标准化为相应的 gapdh 水平。数据表示为平均值
ꢀ±ꢀ
s.e.m. （与对照组相比，n = 3，*p 《 0.05，**p 《 0.01，***p 《 0.001；与 hssg 组相比，#p 《 0.05，##p 《 0.01，###p 《 0.001）。
[0024]
图6为体内生物分布图。（a）h22荷瘤小鼠用生理盐水、ha、ger、hcch和hssg处理两周后从宿主体内切下的肿瘤组织的光学照片。 (b) 治疗中肿瘤体积的变化。 (c) 第15天肿瘤组织的重量。 (d) 来自不同治疗组的肿瘤切片的h&e染色、ki-67 染色和tunel 染色。 [比例尺 = 50 μm] (e) h22 荷瘤小鼠在注射 ir780-hssg 后 1、3、6、12 和 24 小时的体内荧光图像。 (f) ir-780-hssg 静脉注射 24 h 后五个主要器官和肿瘤的荧光图像。数据表示为平均值
ꢀ±ꢀ
s.e.m. （n = 6）。 *p 《 0.05，***p 《 0.005；与 hssg 组相比，##p 《 0.01，###p 《 0.001。
[0025]
图7为体内抗肿瘤效率图。（a）h22荷瘤小鼠静脉注射生理盐水、ha、ger、hccg和hssg两周后体重变化。 (b) 每个治疗组在第 15 天收获的肿瘤和肿瘤重量的代表性图像。(c) 肝肾功能指标的直方图：alt、ast、urea 和 crea。 (d) 从肝、脾、肺、肾和心脏获得的典型 he 染色组织学图像。 [比例尺 = 50 μm]。
[0026]
图8为hccg 前药偶联物的合成路线。
[0027]
图9为溶血实验结果图。
[0028]
图10为hccg nps 和 hssg nps的zeta电位结果图。
具体实施方式
[0029]
本技术用到的主要试剂、药品及样品：ha（mw = 8 kda）购自bloomage freda biopharm co., ltd.（中国山东）。 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (edc
·
hcl)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮 (nhs)、
己二酸二酰肼 (adh)、胱胺二盐酸盐 (cys)、香叶醇 (ger)、琥珀酸酐(sa), 4-二甲氨基吡啶(dmap), 2-[2-[2-chloro-3-[(1,3-dihydro-3,3-二甲基-1-丙基-2h-indol-2-ylidene)ethylidene ]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基碘化吲哚 (ir780) 和 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (mtt)购自 sigma-aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。其他有机溶剂和试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。胎牛血清(fbs)购自gibco。胰蛋白酶和高糖 dulbecco 改良 eagle 培养基（dmem）购自北京日光生物科技有限公司（中国北京）。所有试剂和溶剂均直接使用。
[0030]
6周龄的实验瑞士小鼠（26
±
2g）购自河南实验动物中心（中国郑州）。
[0031]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例1本实施例的hssg的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：（1）将 ha（300 mg，0.792 mmol）、edc
·
hcl（182 mg，0.950 mmol）和 nhs（109.3 mg，0.950 mmol）在 25℃ 搅拌下溶解在 10 ml去离子 (di) 水中以激活ha的羧基。搅拌30分钟后，将cys（535.1mg，2.376mmol）加入上述活化的ha的nhs酯中，然后将反应混合物搅拌约24小时。之后，将反应混合物倒入透析管中(mwco 3.5kda) 并透析 72 小时。最后，通过冻干收集产物ha-cys。
[0033]
（2）在200ml干燥圆底中准确称取ger（1.54g，10mmol）、sa（1.20g，12mmol）和dmap（10mg，催化量），加入50ml无水二氯甲烷。在氩气保护下加入0.791g吡啶，室温搅拌24小时。反应结束后，依次用2n盐酸和h2o洗涤，有机相用硫酸镁干燥。除去溶剂后，得到黄色油状产物ger-sa。
[0034]
（3）在温和加热条件下将 ha-cys (476mg) 溶解在3 ml甲酰胺中并冷却至25℃。然后，将溶液用 2ml dmso 稀释。在25℃下，将 ger-sa（60 mg，0.132 mmol）、edc（60.8 mg，0.396 mmol）和 nhs（36.5 mg，0.396 mmol）溶解在5 ml dmf 中。搅拌 30 分钟后，将 ha-cys 溶液引入活化的ger溶液中，然后在 25℃ 下搅拌 24 小时。最终混合物透析 72 小时（mwco 3.5kda）。通过冻干收集ha-ss-ger(hssg)。
[0035]
用于比较的ha-adh-ger(hccg)缀合物的制备方法其步骤与实施例1的制备方法相同，区别在于cys 用 adh 代替。
[0036]
（4）hccg nps 和 hssg nps 的制备：将hssg 前药/ hccg前药置于0 ℃和 150 w 下通过探头超声仪进行超声处理，然后分散在5 ml去离子水中，所得超声分散液通过 0.45 μm膜过滤器过滤，即得hccg nps 和 hssg nps。
[0037]
和 hccg 结合物的结构表征，使用 nmr 光谱仪（300 hz，bruker，switzerland）记录
1 h核磁共振（nmr）光谱。傅里叶变换红外 (ft-ir) 光谱在 bruker ifs-55（瑞士）上记录。紫外可见光谱在 perkinelmer lambda 750 (norwalk ct) 上记录。
[0038]
在这项研究中，使用 cys 作为靶向加抗癌的连接键成功合成了具有氧化还原响应特性的 hssg（图 1a）。为了比较，非氧化还原反应性 hccg 前药是使用 adh 作为连接键合成的（图8）。
[0039]
如图1b所示，ha的1h nmr光谱表明信号在1.9（n-乙酰基的甲基质子）和3.0-4.0 ppm（亚甲基和羟基），属于ha的特征峰。同时，ha-cys 和 hssg 的1h nmr光谱表明 3.0-3.1 ppm 处的峰归因于 cys 的亚甲基质子，表明ha 通过 ha 的羧基和 cys 的胺基之间的酰胺键与 cys 连接。在成功获得所需产物 ger-sa后，呈黄色油状，然后使用1h nmr进行验证 (300 mhz, dmso-d6) δ 12.24 (s, 1h), 5.38-5.26 (t, j = 7.0 hz, 1h), 5.10 (t, 1h), 4.56 (d, j = 7.0 hz, 2h), 2.57-2.44 (m, 2h), 2.05 (m, 4h), 1.67 (s, 6h), 1.59 (d，3h）。此外，在hssg的1h nmr 光谱中，ger的烯烃质子在 5.3 ppm 处出现特征峰，揭示了ger 通过氧化还原响应接头 (cys) 接枝到 ha 的骨架上。ha-adh 和 hccg 的1h nmr 光谱也显示了类似的结果，证明 ger 和 ha 通过非氧化还原响应接头 (adh) 成功连接。与 ha 骨架相连的 ger 的量由ha中 n-乙酰基的特征峰与ger中烯烃的特征峰之间的积分比计算。根据1h nmr谱积分值，ger在hssg和hccg前药中的接枝率和取代度（ds）分别为42%/18.5%和38%/15.4%。
[0040]
在图1c 中，在ha的 ft-ir 光谱中观察到的1616 cm-1
处的吸收峰归因于 ha 的羰基伸缩振动。相比之下，该吸收峰在 ha-cys 的 ft-ir 光谱中下降，这是可能是由于ha的羧基。此外，ha-cys 的 ft-ir 光谱在 1633 和 1557 cm-1
处显示出新产生的峰，属于酰胺 i (nc=o) 的伸缩振动和酰胺 ii (cn-h) 的弯曲振动，表明ha 和cys 之间新形成了酰胺键。此外，在hssg 的ft-ir 光谱中观察到1540 和1375 cm-1
处的峰的出现，表明酰胺键的特征峰发生了变化。此外，特征峰明显出现在1670 和 2974 cm-1
是由于引入了ger。这些类似的结果也显示在ha-adh和hccg的ft-ir光谱中。
[0041]
hccg nps 和 hssg nps的表征：通过 jem 1400 jeol 透射电子显微镜（日本东京）在 200kv 加速电压下观察形态。
[0042]
载药量 (dlc) 由下式获得根据1h nmr谱积分值，ger在hssg前药中的接枝率和取代度（ds）为42%/18.5%。
[0043]
这些胶束水溶液中的zeta电位、大小和多分散指数 (pdi) 是通过在 malvern zeta sizer nanos90 (uk) 上的动态光散射 (dls) 检测的；并在透射电子显微镜（tem，jeol jem-1200ex 显微镜，日本）上记录每个胶束的结构和形态。
[0044]
hssg nps 的形成归因于高度亲水的ha和难溶于水的ger。由于前药的两亲性，hssg 前药偶联物可以在水溶液中自组装成纳米颗粒。由hssg 组装的氧化还原敏感纳米粒子和由hccg形成的氧化还原不敏感纳米粒子进行tem和dls以评估形态和尺寸分布。结果证实了hssg（图2a，左）和 hccg np（图2a，右）的均匀球形形态。此外，根据粒径分布结果，hssg 和 hccg nps的粒径约为138.5 和107.1 nm（图2b），多分散指数较低（pdi《0.200），表明形成了具有窄单峰分布的纳米系统。大小和球形的特性可能有助于增强渗透和保留效果以及细胞内吞作用。zeta电位结果显示 hssg（图10a）和 hccg np（图10b）都显示出大约
ꢀ‑
15 mv 的负表面电荷。负电荷归因于ha壳，这可能会减少纳米颗粒与血液成分相互作用期间血浆蛋白的非特异性吸附。因此，稍微负的 zeta 电位可能有助于这些纳米颗粒在血液中具有更好的稳定性并增加血液循环时间。
[0045]
药物稳定性是药物递送纳米系统医学应用中的一个重要因素。hssg nps 的尺寸
稳定性在 pbs 和补充有10% fbs 的 pbs 中测定。如图 2c 所示，hssg 和 hccg nps 的尺寸在 48 小时孵育内没有显示出显着变化，表明这些纳米颗粒足够稳定，可以达到血液循环中的肿瘤部位，最终改善药物输送。
[0046]
实施例2本实施例的hssg的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：（1）将 ha（300 mg，0.792 mmol）、edc
·
hcl（383 mg，2 mmol）和 nhs（230.1 mg，2 mmol）在 25℃ 搅拌下溶解在 10 ml去离子 (di) 水中以激活ha的羧基。搅拌30分钟后，将cys（1126.1mg，5mmol）加入上述活化的ha的nhs酯中，然后将反应混合物搅拌约24小时。之后，将反应混合物倒入透析管中(mwco 3.5kda) 并透析 72 小时。最后，通过冻干收集产物ha-cys。
[0047]
（2）在200ml干燥圆底中准确称取ger（1.54g，10mmol）、sa（1.50g，15mmol）和dmap（10mg，催化量），加入50ml无水二氯甲烷。在氩气保护下加入1.582g吡啶，室温搅拌24小时。反应结束后，依次用2n盐酸和h2o洗涤，有机相用硫酸镁干燥。除去溶剂后，得到黄色油状产物ger-sa。
[0048]
（3）在温和加热条件下将 ha-cys (476mg) 溶解在3 ml甲酰胺中并冷却至25℃。然后，将溶液用 2ml dmso 稀释。在25℃下，将 ger-sa（80 mg，0.518 mmol）、edc（80 mg，0.521 mmol）和 nhs（50 mg，0.542 mmol）溶解在5 ml dmf 中。搅拌 30 分钟后，将 ha-cys 溶液引入活化的ger溶液中，然后在 25℃ 下搅拌 24 小时。最终混合物透析 72 小时（mwco 3.5kda）。通过冻干收集ha-ss-ger(hssg)。
[0049]
用于比较的ha-adh-ger(hccg)缀合物的制备方法其步骤与实施例1的制备方法相同，区别在于cys 用 adh 代替。
[0050]
（4）hccg nps 和 hssg nps 的制备：将hssg 前药/ hccg前药置于0 ℃和 150 w 下通过探头超声仪进行超声处理，然后分散在5 ml去离子水中，所得超声分散液通过 0.45 μm膜过滤器过滤，即得hccg nps 和 hssg nps。
[0051]
实施例3本实施例的hssg的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：（1）将 ha（300 mg，0.792 mmol）、edc
·
hcl（95 mg，0.5 mmol）和 nhs（57.5 mg，0.50 mmol）在 25℃ 搅拌下溶解在 10 ml去离子 (di) 水中以激活ha的羧基。搅拌30分钟后，将cys（225.2mg，1mmol）加入上述活化的ha的nhs酯中，然后将反应混合物搅拌约24小时。之后，将反应混合物倒入透析管中(mwco 3.5kda) 并透析 72 小时。最后，通过冻干收集产物ha-cys。
[0052]
（2）在200ml干燥圆底中准确称取ger（1.54g，10mmol）、sa（0.5g，5mmol）和dmap（10mg，催化量），加入50ml无水二氯甲烷。在氩气保护下加入0.0791g吡啶，室温搅拌24小时。反应结束后，依次用2n盐酸和h2o洗涤，有机相用硫酸镁干燥。除去溶剂后，得到黄色油状产物ger-sa。
[0053]
（3）在温和加热条件下将 ha-cys (476mg) 溶解在3 ml甲酰胺中并冷却至25℃。然后，将溶液用 2ml dmso 稀释。在25℃下，将 ger-sa（40 mg，0.088 mmol）、edc（40 mg，0.261 mmol）和 nhs（20 mg，0.217 mmol）溶解在5 ml dmf 中。搅拌 30 分钟后，将 ha-cys 溶液引入活化的ger溶液中，然后在 25℃ 下搅拌 24 小时。最终混合物透析 72 小时
（mwco 3.5kda）。通过冻干收集ha-ss-ger(hssg)。
[0054]
用于比较的ha-adh-ger(hccg)缀合物的制备方法其步骤与实施例1的制备方法相同，区别在于cys 用 adh 代替。
[0055]
（4）hccg nps 和 hssg nps 的制备：将hssg 前药/ hccg前药置于0 ℃和 150 w 下通过探头超声仪进行超声处理，然后分散在5 ml去离子水中，所得超声分散液通过 0.45 μm膜过滤器过滤，即得hccg nps 和 hssg nps。
[0056]
应用例1：nps 的多生物响应药物释放曲线癌细胞中的特异性药物释放对于纳米疗法治疗癌症至关重要。众所周知，肿瘤微环境是高度酸性的，具有异常的氧化还原状态，并含有大量的透明质酸酶。因此，在各种缓冲液中探索了 ha 功能化 nps 的多生物响应药物释放特性。
[0057]
最初，在具有不同ph值（7.4、6.5 和 5.5）的缓冲液中评估了 hssg 和 hccg nps 的ger释放行为，这些缓冲液用于模拟不同生物环境中的 ph 值，分别包括血浆（ph 7.4），肿瘤微环境 (ph 6.0-6.8) 和溶酶体 (ph 5.5)。如图 2d 所示，在 ph 7.4 的缓冲液中，hssg 和 hccg 在96小时内的 ger 释放百分比分别约为 20.0% 和 13.8%，表明 hssg 和 hccg nps 在中性介质中保留了大部分的负载药物。降低缓冲液的 ph 值，nps 中 ger 的释放速率明显增加。特别是，在孵育 96 h 后，hssg 和 hccg nps 释放到酸性缓冲液（ph 5.5）中的 ger 累积百分比分别达到 74.7% 和 69.9%，明显高于缓冲液（ph 7.4）。这些结果意味着 hssg 和 hccg nps 呈现出持续的和 ph 响应的药物释放方式。
[0058]
此外，ger 通过二硫键（对gsh敏感）和酰胺键（对gsh不敏感）锚定在 ha 链上，这有望赋予 hssg np 以 gsh的责任。为了验证这一点，我们将 np 暂停在含有不同 gsh 浓度（0.1、1 和 10 mm）的缓冲液（ph 6.8），并进一步量化了它们的 ger 释放行为。如图 2e 所示，随着 gsh 浓度的增加，nps 的药物释放速率显着加快，在缓冲液（ph 6.8；gsh：10 mm）中孵育 96 小时后，大约 70.2% 的药物从 hssg nps 中累积释放，表明 hssg nps 显示出强大的 gsh 响应药物释放能力。相反，hccg nps 没有表现出这种特征。
[0059]
ha 可以被肿瘤部位大量存在的haase降解。因此推测具有 ha 表面功能化的 nps 可以由于 ha 的降解而被部分破坏，导致药物释放加速是合理的。图 2f 显示了含有在各种haase浓度（0.5、5和50 iuml-1
）的缓冲液（ph 6.8）中 hssg nps 中 ger 的释放曲线。显然，随着haase浓度的增加，胃食管反流的释放率增加。特别是，在缓冲液（ph 6.8；haase 50 iuml-1
）中孵育 96 小时后，累积的 ger 释放百分比从 28.5% 增加到 86.4%。
[0060]
由于多种刺激共存于肿瘤微环境中，因此确定了这些刺激的协同效应。结果表明，gsh 和haase在酸性介质中均能在 96 小时内诱导 ger 快速释放。这些发现清楚地证明了刺激对 hssg nps 药物释放特性的协同作用，这有利于最大限度地减少药物在血液循环过程中的过早释放量，并获得足够的细胞内药物量。
[0061]
应用例2：体外细胞摄取研究1、细胞培养lx-2人肝星状细胞系和人肝癌细胞系hepg2和huh7购自中国科学院细胞库（中国上海）。所有三种细胞都在添加了10% 胎牛血清 (fbs)、100
ꢀµ
g/ml 链霉素和 100 u/ml 青霉素的 dulbecco's 改良 eagle's 培养基中培养。细胞在 37 ℃在95% 空气和5% co2的湿润气氛中在 37 ℃下生长。
[0062]
、体外细胞摄取研究荧光显微镜和流式细胞术可分别用于定性和定量研究细胞摄取。ir 780 标记的透明质酸纳米粒的制备：首先，羧化ir780 由ir 780 和6-氨基己酸制备。接下来，根据实施例1中的程序合成hssg。最后，将羧化的ir780和具有游离氨基的透明质酸纳米颗粒hssg的水分散体酰胺化，得到ir780标记的透明质酸纳米颗粒（ir780-hssg）。准确称取10mg ir780，溶于5ml甲醇中，加入8mg dcc和5mg dmap，室温搅拌1小时使羧基活化。反应后，通过重结晶纯化。适量加入hssg水分散液中，磁力搅拌反应24小时，然后透析（mwco 3.5kda）48小时，除去未反应的ir780和杂质，冷冻干燥得到ir 780 标记的透明质酸纳米粒子 ir780-hssg。上述反应在黑暗环境中进行。
[0063]
对于荧光显微镜实验，将细胞用 ir780-hssg（含有 1
ꢀµ
g/ml ir780）在 37 ℃ 下处理 1、3、6、12 和 24 小时。然后，将细胞用pbs洗涤两次，用4%多聚甲醛溶液固定20分钟，并用dapi染色15分钟。使用荧光倒置显微镜（olympus bx43 ckx31）获得荧光图像。 ir780 的激发波长为 633 nm，记录在 700 到 800 nm 之间的发射光谱。
[0064]
流式细胞术实验中细胞的处理方式与荧光显微镜实验相同。之后，将细胞用pbs洗涤3次并重悬于500μl pbs中，通过流式细胞仪(cyto flex，beckman)检测细胞摄取效率。
[0065]
细胞摄取是癌症治疗中化学治疗药物医学转化的基本要求，因为这些药物主要在细胞内发挥抗癌作用。因此，分别使用荧光显微镜和fcm对nps的细胞摄取曲线进行了定性和定量研究。
[0066]
dapi 是一种用于标记细胞核的蓝色荧光染料，而 ir780 是一种红色荧光探针，通常用作荧光探针来追踪纳米粒子的生物分布。因此，可以通过ir780荧光的变化来观察药物在细胞内的释放行为。如图 3a和3b 所示，在没有 ir780-hssg nps 处理的对照细胞中没有观察到红色荧光信号。与此形成鲜明对比的是，用ir780-hssg纳米颗粒处理的细胞在孵育24小时后主要在细胞质中显示出明显的绿色荧光。这些观察结果可归因于纳米颗粒的有效细胞吸收和在hepg2和huh7细胞微环境（酸性ph、氧化还原状态和大量haase）的刺激下快速释放ger。
[0067]
为了进一步验证ir780-hssg的细胞摄取效率，采用流式细胞仪进行定量分析。图3c和3d中的流式细胞仪直方图显示，随着培养时间的延长，ir780-hssg nps处理细胞后，huh 7细胞中ir780的荧光强度逐渐增加，hepg2细胞中的荧光强度在6 h达到峰值（图3c）。这些结果表明 ir780-hssg nps 在孵育后实现了高细胞内化效率和强荧光强度，这与图3a和3b 中的结果非常吻合。因此，hssg nps 可以被 hepg2 和 huh7 细胞成功内化。
[0068]
应用例3：内吞途径测定在6孔板中培养总共3
×
10
5 hepg2和huh7细胞/孔并孵育24小时。弃去旧培养基，分别加入配制好的10.0μg/ml渥曼青霉素、50.0μg/ml染料木素、10.0μg/ml cpm和10mg/ml ha的培养基。在细胞培养箱中预处理后1 小时后，加入 ir780-hssg nps 溶液（含 1g/ml ir780）。然后连续培养3 h，处理细胞，fcm检测荧光强度。
[0069]
纳米粒子增强细胞对药物吸收的机制是纳米药物研究的一个重要方面。根据之前的报道，纳米粒子进入癌细胞有两条主要途径，被动扩散和主动内吞作用。为了更好地解释细胞吸收机制，通过流式细胞术研究了hssg nps的细胞摄取途径。三种不同的内吞抑制剂渥曼青霉素、盐酸氯丙嗪 (cpm) 和染料木黄酮分别用于抑制巨胞饮作用、网格蛋白介导的
内吞作用和小窝蛋白介导的内吞作用。添加不同抑制剂后，通过流式细胞仪定量测量平均荧光强度。可以看出，通过添加染料木黄酮、渥曼青霉素和 cpm 三种抑制剂，hepg2 和 huh7 细胞对 ir 780-hssg nps 的摄取不同程度地降低。hepg2 和 huh7 细胞对 hssg 的细胞摄取是由细胞膜穴样内陷介导的途径、巨胞饮作用介导的途径和网格蛋白介导的途径共同介导的。此外，具有 ha 预孵育细胞的 ir780-hssg 的竞争性抑制实验表明ha 处理的吸收率显着下降，分别约为 30% 和 45%。结果表明，cd44 特异性受体介导的内吞作用对于 ir780-hssg nps 的细胞内递送很重要。
[0070]
应用例4：体外细胞毒性研究为了研究hssg纳米系统对体外癌细胞活性的抑制作用，采用mtt法对人肝癌细胞系hepg2和huh7的细胞活性进行了评价。
[0071]
分为透明质酸组（ha）、游离香叶醇组（ger）、非氧化还原香叶醇组（hccg）和氧化还原敏感香叶醇组（hssg）对人肝癌细胞株hepg2、huh7和人肝癌细胞存活率的影响。mtt法对星状细胞系lx-2进行评价。
[0072]
将处于对数生长期的细胞接种到 96 孔板中。细胞培养（37℃，5% co2）24小时后，将100μl不同浓度的药物加入96孔板中。每个浓度设3个复孔，设对照组。继续培养24、48、72 h后，倒出上清液，加入20 μl浓度为0.5 mg/ml的mtt溶液。继续培养4 h后，弃上清，加入100 μl dmso。在酶标仪（multiscan，thermo，usa）上测量每组在 490 nm 处的吸光度。计算处理细胞的存活率百分比并与未处理的对照细胞进行比较。细胞活力 (%) = 药物处理细胞的 od/培养基处理细胞的 od
ꢀ×ꢀ
100%。
[0073]
确定了 hssg nps 对人肝星状细胞 lx-2 细胞的毒性，图4中的结果表明这些 nps 对 lx-2 细胞的细胞毒性低于对hepg2 和huh7 细胞的细胞毒性（0
‑ꢀ
400μm)，即使在共孵育 48 小时后，由于ha 的高生物相容性。
[0074]
接下来，研究了 hccg 和 hssg nps 对 hepg2 和 huh7 细胞的抗癌活性（图4a）。发现随着孵育时间的延长和药物浓度的增加，nps的细胞毒性增加。此外，与hccg nps和游离ger相比，hssg nps对hepg2和huh7细胞显示出明显的细胞生长抑制作用；同时，游离 ger 的毒性最弱（图 4a）。因此，可以推测 hccg nps 可以以前药的形式发挥细胞毒性，尽管它没有氧化还原反应，因此 hccg nps 比单独的 ger 在降低癌细胞活力方面更有效，因为 cd44 受体介导的增强细胞活性的组合吸收、释放药物的细胞毒性以及未释放前药的一定程度的细胞毒性。同时，可以预测 hssg nps 在治疗癌症方面将具有更好的治疗效果。通过软件计算hepg2和huh7细胞处理24h、48h和72h后的ic50值。结果表明，暴露72小时后，hccg nps对hepg2和huh7细胞的ic 50 值分别为90.31和77.58 μm，而hssg nps的ic 50 值分别为27.24和27.79μm。可以看出，氧化还原反应性 hssg nps 的细胞增殖抑制作用约为非氧化还原 hccg nps 的3倍，这是由于 hssg nps 的氧化还原反应性药物释放。说明hssg nps的氧化还原作用非常显着，具有明显的细胞杀伤作用。
[0075]
为了进一步研究，我们分别为 hepg2 和 huh7 细胞采用了80和100μm 的纳米粒子中香叶醇的浓度。因为它被证明是24小时内抑制细胞增殖的近似中值有效浓度。
[0076]
为了在体外直观地评估药物的治疗效果，通过用不同的处理孵育 hepg2 和 huh7 细胞，然后用钙黄绿素-am（绿色荧光）和碘化丙啶 pi 对活细胞和死细胞进行共染色来进行活/死检测。红色荧光），分别（图 4b）。如图所示。如图 4b 所示，hepg2 和 huh7 细胞在
ger等效浓度分别为 80和100μm 时，可以清楚地观察到 hssg nps 对应于死细胞的红色荧光范围，而对于其他组，红色荧光范围要小得多。结果与 mtt 测量的结果一致。
[0077]
应用例5：在体外抑制增殖并引起细胞周期停滞hepg2 和 huh7 细胞接种在细胞培养皿中，然后与 ha、ger、hccg 和 hssg nps（分别为 80μm 和100μm）孵育 24 小时。然后，将处理过的细胞用calcein-am（绿色，活细胞）染色 30 分钟，用 pi（红色，死细胞）染色 2-5 分钟。最后，通过荧光倒置显微镜（olympus bx43 ckx31）对细胞进行成像。
[0078]
使用 cell-light edu apollo 567 体外成像试剂盒（ribobio，广州，广东，中国）按照制造商的说明进行 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (edu) 掺入测定。 hepg2 和 huh7 细胞以2
ꢀ×ꢀ
104个细胞/孔的速度导入 96 孔板。药物处理24小时后，用10μm edu孵育2小时，然后培养24小时。然后，将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 30 分钟，然后在室温下用 0.5% triton x-100 溶液处理 15 分钟。接着，每孔加入200μl apollo溶液，避光孵育30分钟。使用荧光显微镜（olympus bx43 ckx31）获取荧光图像。细胞增殖率（%）=（edu阳性细胞数）/（细胞总数）
×
100%。
[0079]
为了评估 hssg nps 在肝细胞增殖中的作用，我们进行了edu测定。结果表明，在与calcein-am/pi 染色相同的处理下，hepg2 和 huh7 细胞在 24 小时的增殖率仅为 5.3% 和分别为 6.4%。
[0080]
相应地，随后进行细胞周期分析以了解治疗效果的机制（图 5h）。53、55 对于 ha、ger 和 hccg np，g2/m、g1 和 s 期的细胞比例类似于对照的细胞周期分布。相比之下，用 hssg nps 处理 hepg2 和 huh7 细胞导致 s 种群增加和 g2/m 种群减少。此外，当分别将 hssg nps 与 ger 和 hccg nps 进行比较时，更多的细胞在s期停滞，而在 g2/m 期停滞的细胞更少。具体而言，与对照组相比，用 hssg nps 处理的 hepg2 和 huh7 细胞在进入 s 期后 g2/m 群体都减少了近 15%，从而大大诱导了细胞周期停滞。细胞周期重新分布表明hssg nps可以显着抑制细胞增殖。
[0081]
应用例6：体外诱导凋亡作用根据制造商的协议，原位细胞死亡检测试剂盒（beyotime biotechnology，shanghai，china）用于末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（tunel）。将hepg2和huh7细胞以2
×
104个细胞/孔的速度导入96孔板，药物处理24小时。用pbs洗涤后，细胞在4%多聚甲醛中固定30分钟，然后用1% triton x-100溶液在室温下处理10分钟。然后每孔加入200μl tunel溶液，37℃避光孵育80分钟，荧光染料染色。 4', 6-二脒基-2-苯基吲哚 (dapi) 用于在室温下暗处染色细胞核 5 分钟。使用荧光显微镜（olympus bx43 ckx31）获取荧光图像。使用 image j 软件对 tunel 阳性细胞进行计数。
[0082]
与calcein-am/pi染色一样，经过各种处理后，根据试剂盒用jc-1对细胞进行染色。之后，我们使用（olympus bx43 ckx31）捕捉荧光图像。结果如图5所示。
[0083]
从细胞中提取总蛋白质。进行蛋白质印迹以确定靶蛋白的表达水平。结果如图5所示。购买一抗，包括 anti-bax、anti-bad、anti-bcl-xl、anti-bcl-2、anti-cleaved caspase-3、anti-cleaved caspase-9、anti-cleaved parp 和 anti-gapdh 抗体来自proteintech（芝加哥，伊利诺伊州，美国）。辣根过氧化物酶偶联二抗购自 cst。通过增强的化学发光系统（fluorchem q，proteinsimple，usa）对蛋白质进行可视化。使用 image j 软
件对条带进行半定量。结果为标准化的gapdh的表达水平。
[0084]
在6孔板中培养总共3
×
10
5 hepg2和huh7细胞/孔并孵育24小时。然后更换新鲜培养基，分别用pbs、ha、ger、hccg和hssg处理细胞24h。通过使用 yf
®
488-annexin v 和 pi 细胞凋亡检测试剂盒（美国光大公司，苏州，中国）或细胞周期试剂盒（光大公司，加利福尼亚州，美国）染色来检测凋亡细胞和细胞周期，并使用flowjo软件进行分析.每个测定重复三次。
[0085]
为了进一步阐明 hssg nps 抑制 hepg2 和 huh7 细胞生长的功能，我们还进行了 tunel（tdt介导的 dutp nick-end labeling）检测。如图 5b 所示，hssg nps 组比其他组有更多的凋亡细胞相同条件下的组。对于定量分析，对每个样品进行计数并将结果表示为 tunel 阳性细胞的百分比。结果显示hssg组hepg2和huh 7细胞的凋亡率分别为12%和21%，明显高于其他组（图5d）。
[0086]
此外，在用不同的纳米颗粒制剂处理后，使用 yf488-膜联蛋白 v/pi 双染色通过流式细胞术检测细胞凋亡。如图 5e 所示，左下、右下和右上象限代表有活力的、早期凋亡和晚期凋亡/坏死区，分别。结果表明，对照组和ha组几乎没有细胞凋亡。用ger、hccg nps 和 hssg nps 处理的 hepg2 和 huh7 细胞的凋亡率依次增加（图5g）。在所有组中，hssg nps 组对 hepg2 和 huh7 细胞的凋亡作用最强，分别导致约 14% 和 41% 的细胞发生凋亡。
[0087]
为了揭示体外抗肿瘤效率的潜在机制，通过 jc-1 染色检测线粒体膜电位 (δψm)，当线粒体功能障碍时，线粒体膜电位 (δψm) 可通过线粒体中 jc-1 聚集体转化为 jc-1 单体导致细胞凋亡。线粒体。如图 5i 所示，与 hssg np 一起孵育的 hepg2 和 huh7 细胞具有来自 jc-1 单体染色的最亮绿色荧光。再次证明导致线粒体功能障碍的hssg nps比hccg nps更能促进hepg2和huh 7细胞的凋亡。然后，我们通过蛋白质印迹测试了凋亡蛋白的表达。细胞凋亡可由许多 bcl-2 家族蛋白调节，包括抗细胞凋亡蛋白如bcl-xl 和 bcl-2，以及促凋亡蛋白如 bad 和 bax47。caspase 被多种凋亡刺激激活，parp 可以被激活的 caspase-3 进一步裂解，导致凋亡级联反应的发生。如图 5j 所示，hssg nps 可以通过上调人肝癌细胞的凋亡指数增加凋亡指数。调节裂解的 cas-3、9 和裂解的 parp 的蛋白质水平，表明激活了线粒体介导的细胞凋亡途径。
[0088]
应用例7：体内生物分布荧光成像对于体内荧光成像，首先通过静脉注射（ir780 浓度为 10 μg kg-1）给 h22 荷瘤小鼠注射 ir780-hssg nps。在不同的注射后时间（1、3、6、12 和 24 小时）获得荧光图像。随后，心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤在注射24小时后被分离并拍照（ivis lumina xrms 系列 iii，美国）。
[0089]
为了确认体内 ir780-hssg nps 的肿瘤内化和积累能力，使用 h22 荷瘤小鼠作为肿瘤异种移植模型。通过xenogen ivis lumina 系统在预定时间点监测 ir780-hssg 的肿瘤积累和生物分布.在 ir780-hssg nps 注射后 0、1、3、6、12 和 24 小时获得体内延时图像（图6e）。注射后一小时，ir780-hssg nps 开始在肝脏、肾脏和肿瘤中显着积累。肿瘤中 ir780 的信号在注射后 3 小时最高，此后缓慢下降（图6e）。在所有测量的时间点，在肝脏和肿瘤中都发现了强信号。肝吸收的这种增加可以通过透明质酸受体在肝窦内皮细胞上的内吞作用过度表达来解释。此外，给药后24小时仍可在肿瘤部位观察到荧光信号，这表明纳
米颗粒在体内具有较长的保留时间。nps 在肿瘤靶向方面的成功归因于被动增强渗透和保留 (epr) 效应和主动、ha受体介导的细胞内化的组合。60 24 小时后，小鼠被安乐死，并取出组织进行成像 (图6f)。与我们体内生物分布研究的结果相似，ir780 的荧光信号主要分布在肿瘤处。同时，肝脏和肾脏的荧光信号弱于肿瘤。基于ha的纳米粒子的这种显着的肿瘤靶向能力可能是由于胶束大小合适和ha的亲水壳，这可以通过 ha-cd44 相互作用增强 nps 的细胞摄取并促进在肿瘤组织中的积累。因此，它是可以预见，hssg nps有助于提高药物利用效率和更好的治疗效果。
[0090]
应用例8：体内抗肿瘤功效h22 荷瘤小鼠被用作模型用于评估加载 ger 的纳米粒子的抗肿瘤作用。当移植瘤体积达到约150mm3时，将小鼠随机分为5组（每组6只），给药剂量如下：生理盐水组、ha组（15.5mg/kg）、游离ger组(1.0mg btz/kg)、hccg组(1.0mg ger/kg)和hssg组(1.0mg ger/kg)。上述制剂每2天尾静脉注射一次，期间每天称重，用游标卡尺测量肿瘤的长度（l：mm）和宽度（w：mm）。根据以下公式计算肿瘤体积（vtumor）：v
tumor
=w2×
l/2为了评估 hssg nps 的化疗效果，h22荷瘤裸鼠通过尾静脉注射不同制剂（生理盐水、ha、ger、hccg nps 和 hssg nps）。尽管所有组的肿瘤生长速率（图 6b）都有上升趋势，但注射 ha 和 ger 的小鼠肿瘤大小的生长速率显着高于用 hssg nps 和 hccg nps 治疗的组。这表明含有ha的nps起到了靶向作用，使药物更集中在肿瘤部位，从而获得更好的治疗效果。此外，与hccg nps处理的小鼠相比，hssg nps处理的小鼠的肿瘤体积生长有更好的抑制作用，这表明癌细胞摄入hssg nps后，氧化还原反应性hssg nps在作用下引起二硫键断裂并释放ger高浓度的谷胱甘肽，从而起到化疗作用。注射生理盐水和ha的小鼠的肿瘤生长速度最快。同时，注射14天后的肿瘤（图6a）和肿瘤重量（图6c）的光学照片也证明了hssg nps处理的小鼠的肿瘤重量最小，治疗效果最好。
[0091]
为了进一步证实体内抗肿瘤作用，切除肿瘤进行 he 染色测定、ki-67 和 tunel 测定。如图6d所示，在he染色中，对照组表现出肿瘤组织的典型特征，如细胞核大而深染，细胞质较少。相比之下，治疗组的肿瘤组织表现出不同程度的坏死，如细胞核皱缩和细胞质面积增加。hssg nps 组显示出最大的肿瘤坏死区域。图6d 显示了用 ki-67 进行免疫组织化学染色的图像。结果显示，ki-67阳性细胞数量最多的是生理盐水处理组。然而，用 hssg nps 处理后 ki-67 阳性细胞的数量减少了。此外，通过tunel切片分析各组肿瘤细胞的凋亡情况（图6d）。dapi将细胞核染成蓝色，肿瘤细胞的细胞核dna在早期凋亡过程中被破坏，并被fitc标记为绿色.在生理盐水、ha、ger和hccg nps组中几乎没有观察到绿色荧光。在hssg nps 中发现了大面积的绿色荧光，表明药物诱导了肿瘤细胞的凋亡。这些数据表明hssg nps 对细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的促进作用比其他药物更好。
[0092]
应用例9：全身毒性评估将健康小鼠的血样收集在装有肝素的容器中，并以1500 rpm 的速度离心 10 分钟以获得红细胞（rbcs）。用 pbs 洗涤和稀释后，rbcs与hssg 和 hccg nps 混合，分散在不同浓度的 pbs中，并在 37℃ 下孵育。孵育3小时后，将混合溶液离心，并在 570 nm（a
sample
）处测量上清液的吸光度。同时，将红细胞与 pbs 和水混合，分别作为阴性对照（apbs）和阳性对照（a
water
）。溶血百分比由(a
sample-a
pbs
)/(a
water-a
pbs
)
×
100%计算。
[0093]
治疗14天后，处死所有小鼠，收集肿瘤并称重。小心切除心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等主要脏器，加入4.0%（w/v）多聚甲醛保存，石蜡包埋，进一步制备免疫组化切片。将样品切成 7 μm厚的切片并使用苏木精和伊红染色。将肿瘤组织切成 5 μm厚的切片，并使用兔多克隆 cd31 抗体（1:200）和兔多克隆抗 ki-67 抗体（1:500）染色。此外，利用tunel（转移酶介导的dutp-生物素缺口末端标记）和免疫荧光标记物（fitc标记物）研究肿瘤细胞的凋亡情况，并比较不同制剂组肿瘤细胞的凋亡情况，评价和分析治疗效果。各组效果。使用荧光显微镜观察载玻片。
[0094]
进行溶血测试以研究 hssg 和血液中的 hccg np（图9）。在测试范围内未观察到可见的溶血作用。功能标志物，包括肌酐 (crea)、尿素、天冬氨酸转氨酶 (ast) 和丙氨酸转氨酶 (alt)，均通过血液生化检测。第14天的 crea、尿素、ast 和 alt 水平在不同的组（图7b 和7c）。此外，不同治疗后的体重未发现明显异常（图7a）。体重体、主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的he染色和血液生化结果表明，hssg nps 治疗是安全且生物相容的。此外，主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的苏木精。伊红 (he) 染色显示所有组中均无明显损伤（图7d）。
[0095]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。