一种鉴别植物油种类的方法

1.本发明涉及一种鉴别植物油种类的方法，特别涉及一种通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪鉴别植物油种类的方法。本发明属于食品检测技术领域。


背景技术：

2.食用植物油种类繁多，种类不同，其具体成分和营养价值也不同。受总产量，营养价值，生产成本和消费群体等因素的影响，不同植物油的价格差异非常大。不同种类的植物油具有不同的固有特性，如色泽、气味、营养价值、特殊的化学成分和脂肪酸组成。根据上述差异，可利用理化方法可建立分析不同植物油的方法。目前主要采用电导率法、核磁共振、红外光谱法、太赫兹时域光谱法、拉曼光谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法以及色谱质谱联用技术等对食用植物油进行掺假鉴别。
3.例如christy等将近红外光谱和化学计量学有效结合起来用于橄榄油中大豆油、葵花籽油、玉米油、核桃油和榛子油等掺假物的定性、定量鉴别，建立了525种掺假混合油波谱扫描数据的定性定量分析模型，区分掺假植物油。核磁共振、紫外光谱、红外光谱和拉曼光谱等光谱学方法对植物进行区分，不需要复杂前处理，操作简单迅速，但必须建立有效的数据库，并结合化学计量学对数据进行统计分析才能用于实际样品的定性或定量识别。色谱法和质谱法主要通过分析不同植物油中的脂肪酸、植物甾醇、甘油三酯等的种类及含量来区分各种植物油。不同的食用植物油脂肪酸组成与含量均不相同，掺伪后必然会改变其脂肪酸的组成和含量。分析油品中脂肪酸组成和含量，再与其对应的纯品油脂肪酸构成比较，可快速鉴别是否掺伪。然而，不同产地、不同品种可影响食用植物油的脂肪酸组成和含量，限制了该方法的应用。利用pcr技术检测植物种子特异dna片段，进而判断植物油种类，但是该方法只适用于已知转基因序列的转基因植物提炼植物油种类的鉴别，实际应用受限。
4.目前对于各种食用植物油的掺伪检测方法研究较多，各种方法都有其优缺点。目前所有方法都是基于某一类物质含量的差异、整体光谱图的差异，或者结合化学计量法进行区分，但都没有鉴定出的不同植物油的特异成分，不能具体定性掺杂植物油的种类，都不是属于肯定或确定的定性方法。
5.不同植物油在组分种类或含量上有一定差别，利用理化方法分析不同植物油的组成成分，可以对植物油进行区分。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪鉴别植物油种类的方法。
7.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
8.本发明通过高效液相色谱串联飞行时间质谱联用仪检测了9种不同的常见食用植物油的成分，依据检测标准筛选每种植物油的成分，然后比较分析筛选出每种植物油的特
异成分；通过高效液相色谱串联飞行时间质谱联用仪获得特异成分的保留时间、质荷比和二级质谱图，用于不同植物油的种类鉴别分析；最后通过不同品牌的同种植物油、不同加工方式的植物油和调和油，确定不受品牌、产地和加工方式影响的植物油的特异成分，基于上述确定的特异成分，可用于不同植物油种类的快速特异的鉴定，为评估植物油种类、质量和掺假鉴别提供有利帮助。
9.具体的，本发明的一种鉴别植物油种类的方法，所述的植物油包括花生油、大豆油、芥花油、橄榄油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、稻米油、亚麻籽油、调和油，所述的方法采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪对植物油进行检测分析，包括以下步骤：
10.(1)在15ml ep管中先后加入800μl植物油和1600μl甲醇，漩涡混合器涡旋两分钟，于4℃冰箱静置12小时，取上清液400μl待测；
11.(2)采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪对植物油进行检测分析其中，高效液相色谱条件为：采用acquityuplc beh c18柱，规格为150mm
×
2. 1mm，1.7μm，以0.1％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，以梯度淋洗的方式对植物油中的成分进行分离；正离子模式下的梯度淋洗方法为：0-0.5min，98％0.1％甲酸水溶液， 2％乙腈；0.5-3min，30％-98％0.1％甲酸水溶液，2％-70％乙腈；3-10min，2％-30％0.1％甲酸水溶液，70％-98％乙腈；10-12min，2％0.1％甲酸水溶液，98％乙腈；12-14min， 2％-98％0.1％甲酸水溶液，98％-2％乙腈；14-16min，98％0.1％甲酸水溶液，2％乙腈；
12.四级杆飞行时间质谱的条件为：电喷雾离子源；正离子模式毛细管电压分别为 3.0kv/2.8kv；锥孔电压：35v；温度：110℃；锥孔气流量：12l/hr；脱溶剂气温度： 320℃；脱溶剂气流量：720l/hr；碰撞气体，氩气；
13.(3)数据采集：数据采集范围均为50至1000，数据收集采用中心模式，频率为 0.48s，数据每10s校正一次，数据采集时间为0至16min；
14.(4)获得待检植物油的包括保留时间、质荷比和峰面积在内的数据集，与不同植物油中的特异物质的保留时间、质荷比、碎片离子和二级质谱图进行比较，确定植物油的种类。
15.其中，优选的，为确保质荷比的准确性和可重复性，使用亮氨酸-脑啡肽为内标对采集的质谱信号进行实时校正，正离子，[m h] ＝556.2771。
[0016]
其中，优选的，正离子模式下，花生油、大豆油、芥花油、橄榄油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、稻米油、亚麻籽油中的特异物质的保留时间、质荷比、碎片离子如下表1-9：
[0017]
表1
[0018][0019]
表2
[0020][0021]
表3
[0022][0023]
表4
[0024][0025][0026]
表5
[0027][0028]
表6
[0029]
[0030]
表7
[0031][0032]
表8
[0033][0034][0035]
表9
[0036][0037]
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0038]
本发明提供了一种常见食用植物油的种类鉴别方法，将大豆油、花生油、玉米油、葵花籽油、亚麻籽油、菜籽油、芝麻油、橄榄油、稻米油、调和油等中国常见的食用植物油进行超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪检测分析，筛选每种植物油的特异物质，获取准确的质荷比和二级质谱图，构成植物油种类鉴别的候选成分列表，然后在多种调和用油和其他品牌的植物油进行验证，确定食用植物油种类的鉴别成分，利用上述物质可准确鉴定食用植物油的种类，包括调和油中的植物油种类，检测速度快、效率高，适合分析大批量样品，具有较好的应用前景。
附图说明
[0039]
图1a-b为不同种类的植物油的高效液相色谱图；
[0040]
图2为不同的植物油之间的分离趋势；
[0041]
其中：b表示调和油；ca表示菜籽油；co表示玉米油；o表示橄榄油；p表示花生油；r表示稻米油；s1表示脱色豆油；s2表示非脱色豆油；
[0042]
图3a-b为9种植物油pos特异物质提取色谱图；
[0043]
图4为花生油特异物质msms质谱图；
[0044]
图5为大豆油特异物质msms质谱图；
[0045]
图6为芥花油特异物质msms质谱图；
[0046]
图7为橄榄油特异物质msms质谱图；
[0047]
图8为芝麻油特异物质msms质谱图；
[0048]
图9为玉米油特异物质msms质谱图；
[0049]
图10为葵花籽油特异物质msms质谱图；
[0050]
图11为稻米油特异物质msms质谱图；
[0051]
图12为亚麻籽油特异物质msms质谱图；
[0052]
图13a-d为植物油特异物质验证pos色谱图。
具体实施方式
[0053]
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0054]
实施例1鉴别植物油种类的方法的建立
[0055]
1材料与试剂
[0056]
筛选实验植物油：一级大豆油、三级大豆油(九三粮油工业有限公司)，花生油 (山东鲁花集团有限公司)，菜籽油(呼伦贝尔合适佳食品有限公司)，橄榄油(北京市品利食品有限公司)，稻米油(华润五丰有限公司)，玉米油(山东西王食品有限公司)，芝麻油(青岩寺牌，水代法制取，原料为白芝麻)，亚麻籽油，调和油：各种植物油比例为葵花籽油25％、菜籽油24％、玉米油18.9％、大豆油18％、花生油 6％、稻米油5％、胡麻油2.5％、芝麻油0.6％(益海嘉里集团)，均在哈尔滨市当地超市购买并在4℃下储存待检。
[0057]
验证实验植物油：调和油1(多力)成分：葵花籽油(68％)、玉米油(15％)、芥花油(15％)、花生油(1％)、芝麻油(1％)；调和油2(营养家)成分：玉米油(37％)，芥花油(35％)，稻米油(13％)，花生油(10％)，亚麻籽油(5％)；调和油3(贝蒂斯)成分：葵花籽油(88％)，橄榄油(12％)。
[0058]
大豆原油(九三，黑龙江)、大豆三级油(九三，巴西)，大豆一级油(九三，美国)，橄榄油(鲁花)，橄榄油(奥莱奥)，花生油(胡姬花)，亚麻籽油(多润)，芝麻油(老恒和)，芝麻油(六必居)。
[0059]
试剂：乙腈、甲醇(购于fisher公司，色谱纯)；亮氨酸-脑啡肽(购于waters 公司，色谱纯)；超纯水(由milli-q超纯水系统制备，购于millipore公司)；标准品(购于sigma公司，阿拉丁试剂(上海)有限公司)。
[0060]
1.2仪器与设备
[0061]
超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用仪(色谱：acquityuplc；质谱： micromass q-tofwaters公司，美国)；低温高速离心机(eppendorf公司，德国)；漩涡混合器。
[0062]
1.3实验方法
[0063]
1.3.1样品前处理
[0064]
15ml ep管中先后加入800μl植物油和1600μl甲醇，漩涡混合器涡旋两分钟，于 4
℃冰箱静置12小时，取上清液400μl待测。
[0065]
1.3.2色谱/质谱条件
[0066]
色谱条件：采用acquityuplc beh c18柱(150mm
×
2.1mm，1.7μm，waters， usa)以0.1％甲酸水溶液(a液)和乙腈(b液)作为流动相，以梯度淋洗的方式对芝麻油中成分进行分离。正离子模式下的梯度淋洗方法为：0-0.5min，2％乙腈；0.5-3min，2％-70％乙腈；3-10min，70％-98％乙腈；10-12min，98％乙腈；12-14min，98％-2％乙腈；14-16min，2％乙腈。负离子模式下的梯度淋洗方法为：0-0.5min，2％乙腈；0.5-3min， 2％-70％乙腈；3-10.5min，70％-98％乙腈；10.5-12.5min，98％乙腈；12.5-14min，98％-2％乙腈；14-16min，2％乙腈。自动进样室温度4℃；柱温为35℃；流动相流速为0.35ml/min；进样量为4μl。
[0067]
质谱条件：电喷雾离子源；正/负离子模式毛细管电压分别为3.0kv/2.8kv；锥孔电压：35v；温度：110℃；锥孔气流量：12l/hr；脱溶剂气温度：320℃；脱溶剂气流量：720l/hr；碰撞气体，氩气。为确保质荷比的准确性和可重复性，亮氨酸-脑啡肽 (leucine enkephalin，le)为内标对采集的质谱信号进行实时校正(正离子，[m h] ＝ 556.2771；负离子：[m-h]-＝554.2615)。数据采集范围均为50至1000，数据收集采用中心模式，频率为0.48s，数据每10s校正一次，数据采集时间为0至16min。
[0068]
1.3.3数据分析
[0069]
将检测获得原始数据导入markerlynx(version 4.1，waters，usa)软件进行色谱峰提取、峰对齐和峰面积归一化等预处理。markerlynxapextrack参数设置如下：5％高度处的峰宽，1秒；峰间基线噪声(自动计算)和采集参数设置如下：保留时间范围为0.5-10.5分钟；质量范围50-1000da；峰高5％时的狭缝宽度，1秒；峰间基线噪声 (自动计算)；质量误差范围，0.05da；保留时间误差范围，0.1分钟；最小峰强度值，100；噪声消除水平，6.0；脱同位素数据，是。经峰提取和对齐后，对分子离子丰度进行归一化处理，消除样品体积和浓度的影响。通过上述步骤的处理，获取包括保留时间(retention time，rt)、质荷比和峰面积等在内的数据集。通过pareto-scaling 的模式对数据进行标准化处理，并使用ez-info(version 2.0.0.0，waters)软件进行多元统计分析，主成分分析(pca)、最小二乘判别分析(pls-da)，观察组间的分类趋势。为判断模型是否过拟合，通过simca-p 14.1(version 14.1，umetrics)软件对 pls-da模型进行200次随机置换检验。
[0070]
1.3.4成分鉴定
[0071]
按照以下标准确定每种植物油中的潜在成分：信噪比大于20；峰强度大于500；可获得准确的二级质谱图。
[0072]
1.3.5植物油的候选特异成分
[0073]
该成分只在一种植物油被检出，其他种类的植物油不能检出，我们认为是该植物油的候选特异成分，具有鉴别植物油种类的潜力。
[0074]
1.3.6植物油特异成分的验证与确定
[0075]
市场购买其他不同品牌的植物油和调和油，利用相同的检测方法对每种植物油进行检测，然后在获得的数据中验证上一步筛选出的植物油特异成分，如果在不同品牌或调和油中获得验证，我们将这些物质称之为植物油的特异物质，提供植物油特异物质的提取色谱图、二级质谱图，通过比对特异成分的保留时间、质荷比和二级质谱图，用于不同种类植物油的鉴别。
[0076]
2.实验结果：
[0077]
2.1植物油质谱图
[0078]
每种植物油的色谱图如图1a-b，初步证实植物油的成分是不一样的，每种植物油可能存在其特异成分。由图2可知，不同的植物油之间有明显的分离趋势，进一步说明每种植物油的成分是不一样的。
[0079]
2.2物质筛选
[0080]
依据信噪比大于20，峰强度大于500的标准筛选物质，在9种植物油共获取1225 个物质(芝麻油240个；花生油113个；葵花油110个；亚麻籽油125个；玉米油124 个；芥花油92个；稻米油120个；橄榄油131个；三级(非脱色)大豆油170个，表 10所示)，且都通过uplc-q/tof msms获取了二级质谱图。
[0081]
表10常见9种植物油正负离子模式下特异成分及二级谱图数目
[0082][0083]
2.2.1正离子模式下物质筛选
[0084]
在esi 中，共筛选923个物质，有135个物质在2种及以上的植物油中被检测出： 3个物质在10种油中存在；4个物质在9种油中存在；4个物质在8种油中存在；6 个物质在7种油中存在；6个物质在6种油中存在；8个物质在5种油中存在；10个物质在4种油中存在；33个物质在3种油中存在；61个物质在2种油中存在。
[0085]
正离子模式下，445个物质只在一种植物油中被检测出：芝麻油55个；非脱色豆油68个；脱色豆油18个；花生油28个；葵花油54个；亚麻籽油46个；玉米油38 个；芥花油41个；稻米油50个；橄榄油47个。
[0086]
2.2.2负离子模式下物质筛选
[0087]
在esi-中，共筛选392个物质，有46个物质在2种及2种以上的植物油中被检测出：7个物质在9种油中存在；3个物质在7种油中存在；1个物质在5种油中存在； 6个物质在4种油中存在；9个物质在3种油中存在；20个物质在2种油中存在。
[0088]
负离子模式下一种植物油中被检测出的物质210个：芝麻油112个；非脱色豆油 10个；花生油9个；葵花油8个；亚麻籽油9个；玉米油9个；芥花油2个；稻米油 3个；橄榄油44个。
[0089]
植物油在正负离子模式下特异成分比较分析后，发现正离子模式特异成分个数较多，在正离子模式下对植物油进行种类鉴别，更具操作性和潜力。
[0090]
2.3植物油的独特成分
[0091]
正离子模式下，根据特异离子的信号强度，我们在每种植物油中筛选出的5种特异离子，可在不同品牌和产地的同种类的植物油中获得验证，是该种植物油的特异成分，可用于该种植物油的种类鉴别和掺假鉴别，见表11-19。但是负离子模式下，每种植物油最多只
能筛选2-3种特异物质，有的植物油甚至没有特异离子，可能由于负离子检测的特异物质比较少。因此，依据上述实验结果，我们推荐在正离子模式下对不同种类的植物油进行鉴别。图3a-b和图4-图12是经过验证，最终确定的植物油特异物质的提取色谱图和二级质谱图。
[0092]
每种植物油初步筛选的特异候选物质，在2-3种含有该植物油的调和油和其他品牌的同种类植物油中进行验证，能够被验证的，我们认为是该种植物油的特异鉴定物质，可用于该植物油的定性鉴别，且不受其他因素的干扰，例如产地、品牌和是否与其他植物油混合。不同种类在植物油验证的色谱图见表11-19以及图13a-d。
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]