用于抑制磷酸盐转运的化合物和方法与流程

用于抑制磷酸盐转运的化合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术是国际申请日为2014年8月8日的国际申请pct/us2014/050290进入中国、申请号为201480055714.0的题为“用于抑制磷酸盐转运的化合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
3.本技术依据35u.s.c.
§
119(e)要求2013年8月9日提交的美国申请号61/864,215和2014年2月6日提交的美国申请号61/936,715的优先权，其各自以全文引用的方式并入。
4.关于序列表的声明
5.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸印本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是arde_017_01wo_st25.txt。这个文本文件是193kb，2014年8月8日创建，并且经由efs-web以电子方式提交。
技术领域
6.本发明涉及具有在包括小肠的胃肠道中作为磷酸盐转运抑制剂的活性的非nhe3结合剂，其用作治疗或预防剂的方法，以及药物发现的相关方法。


背景技术：

7.患有肾功能不足、甲状旁腺功能减退或某些其它医学病状(诸如遗传性高磷酸盐血症、奥尔布赖特遗传性骨营养不良症(albright hereditary osteodystrophy)、淀粉样变性等等)的患者常常具有高磷酸盐血症，或升高的血清磷水平(其中这个水平例如大于约6mg/dl)。高磷酸盐血症，尤其如果长时间存在的话，导致钙和磷代谢的严重异常，常常表现为心血管系统、关节、肺、眼以及其它软组织中的继发性甲状旁腺功能亢进、骨病以及异位性钙化。较高血清磷水平与肾衰竭的进展、心血管钙化、以及末期肾病(esrd)患者的死亡率强烈相关。正常高值血清磷水平在患有慢性肾病(ckd)的个体当中和具有正常肾功能的那些当中已经与心血管事件和死亡率相关(参看例如joy等，j.manag.care pharm.，13：397-411，2007)。肾病的进展可以通过减少磷酸盐滞留而减缓。因此，对于高磷酸盐血的肾衰竭患者以及对于具有在正常范围内或仅略微升高的血清磷水平的慢性肾病患者，减少磷酸盐滞留的疗法是有益的。
8.对于经历高磷酸盐血症的患者，钙盐已经广泛用于结合肠磷酸盐并且防止其吸收。不同类型的钙盐，包括碳酸钙、乙酸钙、柠檬酸钙、海藻酸钙以及酮酸盐已经用于磷酸盐结合。然而，这些疗法常常引起高钙血症，一种由大量摄入的钙的吸收所致的病状。高钙血症引起严重的副作用，诸如心律失常、肾衰竭以及皮肤和血管钙化。血清钙水平的频繁监测在使用基于钙的磷酸盐结合剂的疗法期间是需要的。其它无钙和铝的磷酸盐结合剂，诸如司维拉姆(sevelamer)，一种交联聚胺聚合物，具有包括治疗上具活性所需的给药量和频率的缺点。那些药物在体内相对适中的磷酸盐结合能力迫使患者逐步增加剂量(直至每天7克或更大)。这样的量已经显示引起胃肠不适，诸如消化不良、腹痛并且在一些极端情况下引起肠穿孔。
9.防止具有升高的磷酸盐血清水平的患者中磷酸盐从肠中吸收的替代性方法是经由介导肠中的磷酸盐摄取的肠转运系统的抑制。应了解，上段肠中的磷酸盐吸收至少部分由载体介导的机制来介导，这个机制将磷酸盐的吸收与钠的吸收结合起来。肠磷酸盐转运的抑制将降低身体磷超负荷。在患有晚期肾病(例如，4期和5期)的患者中，身体磷超负荷本身表现为高于正常水平的血清磷浓度，即，高磷酸盐血症。高磷酸盐血症与死亡率和发病率直接相关。肠磷酸盐转运的抑制将降低血清磷浓度并且因此改善那些患者中的结果。在2期或3期慢性肾病患者中，身体磷超负荷不一定导致高磷酸盐血症，即，一些患者保持正常磷酸盐血，但甚至在那些早期患者中仍需要降低或防止身体磷超负荷以避免相关的骨和血管病症，并且最终改善死亡率。类似地，肠磷酸盐转运的抑制将在患有通过抑制磷酸盐从肠中摄取可治疗的疾病的患者中特别有利。此外，磷酸盐转运的抑制可以减缓肾衰竭的进展并且降低心血管事件的风险。
10.肠上皮的腔极包含所谓的非搅动水层(uwl)，其中转运由于粘液层的粘度基本上具有扩散性质。这个非搅动层定义为与顶面上的膜相邻的停滞层，其充当扩散屏障以使得快速渗透物质实际上可以通过扩散而限速。这种有限的扩散适用于h

并且因此uwl因质子的向外流出和粘液层所施加的扩散限制而有助于建立ph微气候。在细胞表面附近的酸性环境维持相对大的跨越上皮膜的电化学梯度-跨上皮ph梯度，或cepg。
11.关于这种cepg涉及于营养素经由质子共转运体和-oh-反向转运体，诸如pept1、叶酸盐/oh-反向转运体、以及β-丙氨酸/h 共转运体的转运中存在强有力的证据。参看例如ikuma，j med chem.50：1166-1176，1996。ph微气候的扰动，例如cepg的减小，可以改变营养素的吸收。这在质子介导的肽经由pept1的吸收的情况下已有显示。参看例如thwaites等，gastroenterology.122：1322-1333，2002；以及thwaites和anderson，exp.physiol.92：603-619，2007。然而，在磷酸盐离子跨越肠膜的吸收中尚未确立cepg的作用。
12.关于水吸收涉及于离子跨越小肠、特别是空肠的上皮的转运中也存在证据。juan等，j clin endocrinol metab.43：517-22，1976。但是，这样的机制在磷酸盐降低疗法的领域中甚少探索。


技术实现要素：

13.本发明一般涉及具有在胃肠道中、尤其小肠中作为磷酸盐转运抑制剂的活性的非nhe3结合化合物，包括其立体异构体、医药学上可接受的盐和前药，以及这类化合物抑制磷酸盐摄取并且从而治疗磷酸盐摄取的调节提供治疗效益的多种病状或疾病中的任一者的用途。
14.因此，本发明的实施方案包括抑制需要降低磷酸盐的患者的胃肠道中的磷酸盐摄取的方法，其包括向患者施用不结合nhe3的化合物，其中这种化合物在胃肠道中实质上具活性以在施用于有需要的患者后抑制其中磷酸盐离子(pi)的转运。
15.在特定实施方案中，化合物是鸟苷酸环化酶c受体(gc-c)激动剂化合物。
16.在某些实施方案中，化合物是ph调节剂。这些和相关实施方案包括抑制需要降低磷酸盐的患者的胃肠道中的磷酸盐摄取的方法，其包括向患者施用减小小肠中的跨上皮ph梯度(cepg)的化合物，其中cepg定义为以下两者之间的ph差异：(i)小肠的表面的上皮细胞的细胞质，任选地在上皮细胞的近顶端表面处，和(ii)小肠的顶端表面处的非搅动层，其中
这种化合物在胃肠道中实质上具活性以在施用于有需要的患者后抑制其中磷酸盐离子(pi)的转运，并且其中这种化合物不结合nhe3。
17.在一些实施方案中，化合物减少小肠，任选地空肠中的水吸收。这些和相关实施方案包括抑制需要降低磷酸盐的患者的胃肠道中的磷酸盐摄取的方法，其包括向患者施用减少小肠，任选地空肠中的水吸收的化合物，其中这种化合物不结合nhe3，并且其中这种化合物在胃肠道中实质上具活性以在施用于有需要的患者后抑制其中磷酸盐离子(pi)的转运。
18.在一些实施方案中，化合物减小小肠中的cepg并且也减少小肠中的水吸收。在一些实施方案中，化合物减小小肠中的cepg而不会显著减少小肠中的水吸收。在其它实施方案中，化合物减少小肠中的水吸收而不会显著减少小肠中的cepg(例如，不会显著刺激碳酸氢盐分泌和/或抑制酸分泌)。
19.在一些实施方案中，这种方法得到选自以下一者或多者的方法：
20.(a)治疗高磷酸盐血症，任选地餐后高磷酸盐血症的方法；
21.(b)治疗肾病，任选地慢性肾病(ckd)或末期肾病(esrd)的方法；
22.(c)降低血清肌酐水平的方法；
23.(d)治疗蛋白尿的方法；
24.(e)延迟肾替代疗法(rrt)，任选地透析的时间的方法；
25.(f)降低fgf23水平的方法；
26.(g)减小活性维生素d的高磷酸盐血效应的方法；
27.(h)减弱甲状旁腺功能亢进，任选地继发性甲状旁腺功能亢进的方法；
28.(i)减少血清甲状旁腺激素(pth)的方法；
29.(j)改善内皮功能障碍，任选地由餐后血清磷诱发的内皮功能障碍的方法；
30.(k)减少血管钙化，任选地内膜定位的血管钙化的方法；
31.(l)减少尿液磷的方法；
32.(m)使血清磷水平正常化的方法；
33.(n)降低老年患者中的磷酸盐负荷的方法；
34.(o)减少膳食磷酸盐摄取的方法；
35.(p)减少肾肥大的方法；以及
36.(q)减少心肥大的方法。
37.在某些实施方案中，化合物减小小肠的表面的上皮细胞，任选地在上皮细胞的近顶端表面处的细胞内ph。在某些实施方案中，化合物增加小肠的顶端表面处的非搅动层的ph。在一些实施方案中，化合物(a)刺激小肠中的碳酸氢盐分泌，或(b)抑制小肠中的酸分泌，或(c)在小肠中刺激碳酸氢盐分泌并且抑制酸分泌。
38.在某些实施方案中，化合物增加小肠的表面的上皮细胞的一个或多个细胞内第二信使。在一些实施方案中，一个或多个细胞内第二信使选自ca

、环腺苷单磷酸(camp)以及环鸟苷单磷酸(cgmp)。
39.在某些实施方案中，化合物在经肠施用于患者后是实质上全身非生物可用的。在特定实施方案中，化合物实质上不可渗透胃肠道的上皮。在一些实施方案中，化合物实质上可渗透胃肠道的上皮。
40.在某些实施方案中，施用于有需要的患者(a)使血清磷浓度或水平降至正常血清
glu tyr cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr(seq id no：4)，或其具有1、2、3、4或5个缺失、插入和/或取代的变体。
61.在某些实施方案中，gc-c激动剂肽包含氨基酸序列(iii)：xaa
1 xaa
2 xaa
3 cys
4 xaa
5 xaa
6 xaa
7 xaa
8 xaa
9 xaa
10 xaa
11 cys
12 xaa
13 xaa
14 xaa
15 xaa
16
(seq id no：5)，其中xaa1是：ser、asn、tyr、ala、gln、pro、lys、gly或thr，或丢失；xaa2是his、asp、glu、ala、ser、asn、gly，或丢失；xaa3是thr、asp、ser、glu、pro、val或leu；xaa5是asp、ile或glu；xaa6是ile、trp或leu；xaa7是cys、ser或tyr；xaa8是ala、val、thr、ile、met，或丢失；xaa9是phe、tyr、asn或trp；xaa
10
是ala、val、met、thr或ile；xaa
11
是ala或val；xaa
13
是thr或ala；xaa
14
是gly、ala或ser；xaa
15
是cys、tyr，或丢失；并且xaa
16
是his、leu或ser。
62.在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列：asn asp glu cys glu leu cys val asn val ala cys thr gly cys leu(seq id no：6)，或其具有1、2、3、4或5个缺失、插入和/或取代的变体。
63.在某些实施方案中，p2y激动剂选自图4或图5a-5c中的化合物。在某些实施方案中，腺苷a2b受体激动剂选自图6a-6c中的化合物。在一些实施方案中，可溶性鸟苷酸环化酶激动剂选自图9a-9l中的化合物。在某些实施方案中，腺苷酸环化酶受体激动剂选自图10中的化合物。在一些实施方案中，咪唑啉-1受体激动剂选自莫索尼定(moxonidine)和图11中的化合物。在某些实施方案中，胆碱能激动剂选自图12中的化合物。在特定实施方案中，前列腺素ep4受体激动剂选自pge2或其类似物/衍生物和图7或图13中的化合物。在某些实施方案中，多巴胺d1激动剂选自图14中的化合物。在一些实施方案中，褪黑素受体激动剂选自褪黑素和图15中的化合物。在一些实施方案中，5ht4激动剂选自血清素和其类似物、普卡必利(prucalopride)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、氯波必利(cleobopride)、莫沙必利(mosapride)、普卡必利、伦扎必利(renzapride)、替加色罗(tegaserod)、扎考必利(zacopride)、去甲西沙必利(norcisapride)、那诺必利(naronopride)以及维司曲格(velusetrag)。
64.在一些实施方案中，心房利钠肽受体激动剂包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：ser leu arg arg ser ser cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys asn ser phe arg tyr(seq id no：7)、cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys(seq id no：8)以及ser ser cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys asn ser phe arg(seq id no：9)，包括其具有1、2、3、4或5个缺失、插入和/或取代的变体。
65.在某些实施方案中，碳酸酐酶抑制剂选自图17中的化合物。在某些实施方案中，磷酸二酯酶抑制剂选自图18中的化合物。在一些实施方案中，dra激动剂选自图21a-b。
66.在一些实施方案中，化合物在经肠施用于患者后是实质上全身非生物可用的并且具有(i)至少约的tpsa。在某些实施方案中，化合物具有至少约的tpsa、至少约的tpsa、至少约的tpsa、至少约的tpsa、至少约的tpsa、或至少约的tpsa。在特定实施方案中，化合物具有至少约500da、至少约1000da、至少约2500da、或至少约5000da或更大的分子量。在一些实施方案中，化合物具有(i)大于约5的nh和/或oh和/或其它潜在氢键供体部分的总数；(ii)大于约10的o原子和/或n原子和/或
其它潜在氢键接受体的总数；和/或(iii)大于约105或小于约10的森口分配系数(moriguchi partition coefficient)。在一些实施方案中，化合物具有小于约100
×
10-6
cm/s、或小于约10
×
10-6
cm/s、或小于约1
×
10-6
cm/s、或小于约0.1
×
10-6
cm/s的渗透系数p
app
。
67.某些方法进一步包括施用一种或多种额外生物活性剂。在一些实施方案中，化合物和一种或多种额外生物活性剂作为单一医药组合物的一部分施用。在某些实施方案中，化合物和一种或多种额外生物活性剂作为个别医药组合物施用。在一些实施方案中，个别医药组合物依序施用。在一些实施方案中，个别医药组合物同时施用。
68.在某些实施方案中，额外生物活性剂选自维生素d2(麦角骨化醇)、维生素d3(胆骨化醇)、活性维生素d(骨化三醇)以及活性维生素d类似物(例如，度骨化醇(doxercalciferol)、帕立骨化醇(paricalcitol))。
69.在某些实施方案中，额外生物活性剂是磷酸盐结合剂。在一些实施方案中，磷酸盐结合剂选自由以下组成的群组：司维拉姆(例如，(碳酸司维拉姆(sevelamer carbonate))、(盐酸司维拉姆(sevelamer hydrochloride)))、碳酸镧(例如，)、碳酸钙(例如，)、碳酸钙(例如，)、乙酸钙(例如，)、乙酸钙/碳酸镁(例如，)、mci-196、柠檬酸铁(例如，zerenex
tm
)、碱式碳酸镁铁(例如，fermagate
tm
)、氢氧化铝(例如，)、aps1585、sbr-759以及pa-21。
70.在某些实施方案中，额外生物活性剂是napi2b抑制剂。在一些实施方案中，额外生物活性剂是烟酸或烟酰胺。
71.在某些实施方案中，受试者患有ckd并且额外活性生物剂选自以下一者或多者：ace抑制剂、血管紧张素ii受体阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、直接肾素抑制剂、利尿剂、血管舒张剂、促红细胞生成素疗法、铁替代疗法、晚期糖基化终产物的抑制剂、维生素d以及抑制素(statin)。
72.在某些实施方案中，化合物或组合物经口施用，任选地其中化合物或组合物经口每天施用一次。
73.还包括筛选磷酸盐摄取的抑制剂的方法，其包括(a)培养肠细胞，(b)使经过培养的肠细胞与测试化合物接触，以及(c)测量(i)肠细胞的顶端表面处的ph，(ii)肠细胞的细胞内ph，和/或(iii)肠细胞的磷酸盐摄取，以及(d)鉴别作为磷酸盐摄取的抑制剂的测试化合物，其中来自(c)(i)的ph相对于对照增加，来自(c)(ii)的细胞内ph相对于对照减小，和/或来自(c)(iii)的磷酸盐摄取相对于对照减小。
74.在一些实施方案中，步骤(a)包括将肠细胞培养成单层。在某些实施方案中，步骤(a)包括从肠隐窝分离细胞以及在足以形成类肠的条件下培养。在某些实施方案中，步骤(a)包括在足以形成类器官的条件下培养经过分离的胚胎干细胞、内胚层细胞或多能干细胞。在一些实施方案中，步骤(a)包括在尤斯室(ussing chamber)中培养肠段。
75.在某些实施方案中，步骤(c)(i)包括使细胞与ph敏感性荧光染料接触以及测量染料的荧光。在一些实施方案中，步骤(c)(ii)包括使细胞与
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p标记的磷酸盐离子接触以及测量经过标记的磷酸盐离子的摄取。
76.在一些实施方案中，(d)的增加和/或减小是统计上显著的。
77.在某些实施方案中，测试化合物是已知或疑似在小肠中刺激碳酸氢盐分泌和/或抑制酸分泌的小分子或肽。
78.在某些实施方案中，测试化合物选自以下一者或多者：如本文所描述和/或本领域中已知的p2y激动剂、腺苷a2b受体激动剂、鸟苷酸环化酶c受体激动剂、可溶性鸟苷酸环化酶激动剂、腺苷酸环化酶受体激动剂、咪唑啉-1受体激动剂、胆碱能激动剂、前列腺素ep4受体激动剂、多巴胺d1激动剂、褪黑素受体激动剂、5ht4激动剂、心房利钠肽受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂以及腺瘤下调基因(dra或slc26a3)激动剂。
79.本发明的这些和其它方面在参考以下具体实施方式后将显而易见。
附图说明
80.图1a-1b示出了利那洛肽(linaclotide)(gc-c受体激动剂)减少大鼠的胃肠道中磷酸盐摄取的摄取量。
81.图2a-2b示出了莫索尼定(咪唑啉亚型1(i1)受体激动剂)和水溶性佛司可林(forskolin)类似物考福辛(colforsin)(腺苷酸环化酶激动剂)减少大鼠的胃肠道中磷酸盐摄取的摄取量。
82.图3示出了p2y2受体激动剂up4u减少大鼠的胃肠道中磷酸盐摄取的摄取量。
83.图4示出了例示性小分子p2y受体激动剂。
84.图5a-5c示出了例示性小分子p2y受体激动剂。
85.图6a-6c示出了例示性小分子腺苷a2b受体激动剂，包括代表性类腺苷a2b激动剂(6b)和代表性二氰基吡啶a2b激动剂(6c)。
86.图7示出了例示性前列腺素ep4受体激动剂的清单。
87.图8a-8b示出了例示性近中性ph指示剂(8a)和酸性ph指示剂(8b)的光物理性质。
88.图9a-9l示出了例示性可溶性鸟苷酸环化酶(sgc)激动剂，包括血红素依赖性和血红素非依赖性激动剂(9a)。
89.图10示出了例示性腺苷酸环化酶受体激动剂。
90.图11示出了例示性咪唑啉受体激动剂。
91.图12示出了例示性胆碱能激动剂和拮抗剂阿托品(atropine)和(-)-东莨菪碱。
92.图13示出了例示性ep4受体激动剂。
93.图14示出了例示性多巴胺d1受体激动剂。
94.图15示出了例示性褪黑素(mt2)受体激动剂。
95.图16示出了np受体的例示性肽激动剂(seq id no.7、8以及9)的结构。
96.图17示出了例示性碳酸酐酶抑制剂。
97.图18示出了例示性磷酸二酯酶抑制剂。
98.图19图解了肠中所发现的ph梯度，包括跨越细胞膜的ph梯度，以及紧邻上皮膜和肠管腔的ph梯度。
99.图20示出了在一定范围的ph值下水性环境中(在室温下)的钙和磷酸盐离子的溶解度的相图。
100.图21a-21b描绘了亚型选择性pkc抑制剂的代表性实例。
101.图22a-22c示出了如由
33
p标记的pi的摄取所测量，hek-293细胞内部的酸化使得磷酸盐摄取显著减少。
具体实施方式
102.在以下描述中，阐述某些特定细节以提供本发明的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域的技术人员将了解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。
103.除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求书通篇，词语“包含”和其变化，诸如“包含了”和“包含着”应以开放的、包括的意义解释，即，“包括(但不限于)”。
104.在本说明书通篇提及“一个实施方案”或“一实施方案”意指结合这个实施方案所描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”在本说明书通篇的各种地方出现不一定全部指同一个实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。
105.本发明的实施方案一般涉及以下发现：非nhe3结合化合物，诸如鸟苷酸环化酶激动剂化合物，能够抑制胃肠道中，例如小肠中的磷酸盐摄取。
106.根据一种非限制性理论，磷酸盐离子(pi)的细胞摄取可以受细胞内ph和/或相邻细胞外环境的ph的变化所影响。举例来说，如随附实施例中所示，如由
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p标记的pi的摄取所测量，人胚肾(hek-293)细胞的细胞内部的酸化(同时维持细胞外ph在约7.4下)使得磷酸盐摄取显著减少。
107.在相关实验中，在磷酸盐转运体napi2b(slc34a2)在hek-293细胞中瞬时表达的情况下，观测到相同的现象。因为内源pi转运体pit-1和/或pit-2(slc20a2)负责非转化的hek-293细胞中的pi摄取(以满足细胞代谢需求)，所以推断出细胞内ph的减小对pi摄取的影响是不一定与特异性磷酸盐转运体相关联的一般现象。pit-1和pit-2转运一元形式的磷酸盐nah2po
3-，而napi2b转运二元形式nahpo
32-。细胞酸化影响使用两个转运体的磷酸盐摄取的观测与基于单独的h

电化学梯度的变化的机制不一致。
108.因为可以预期pi摄取的增加，所以这些观测有些许违反自觉。举例来说，可以预期细胞内ph的减小(例如，细胞外ph无任何对应的变化)形成用于摄取碱性阴离子，诸如二元形式的磷酸盐(napo
32-)的驱动力。
109.尽管如此，仍观测到磷酸盐摄取的减少，呈现出使用直接或间接ph调节剂，特别是具有在胃肠道(例如，小肠)中作为ph调节剂的活性的那些来减少需要降低磷酸盐的患者中的磷酸盐摄取的潜力。这种潜力由以下观测来支持：多种ph调节剂能够减少哺乳动物胃肠道中的磷酸盐摄取(参看随附实施例)。如本文所用的术语“ph调节”剂包括能够直接或间接增加碳酸氢盐(hco
3-)分泌和/或减少酸/质子(例如，h

)分泌至胃肠道的腔，例如小肠或十二指肠中的试剂或化合物。一些ph调节化合物可以例如通过调节(例如，增加)胃肠道的上皮细胞的某些细胞内第二信使，诸如ca

、camp、cgmp以及其它来起作用。一些例示性化合物因此直接或间接刺激碳酸氢盐分泌至小肠的腔中，抑制酸分泌至小肠的腔中，或刺激碳酸氢盐分泌并且抑制酸分泌至小肠的腔中。在一些方面，化合物减小小肠的表面的上皮细胞，任选地在上皮细胞的近顶端表面处的细胞质或细胞内ph，而不会调节相邻细胞外环境的ph。在某些实施方案中，化合物不结合至并且抑制钠-氢反向转运体3(nhe3)。
110.在一些方面，化合物减小小肠的顶端表面处的“非搅动层”的ph。“非搅动层”指的
是与顶面上的膜相邻的停滞层(例如，约600μm深)，其充当扩散屏障以使得快速渗透物质(例如，1h

)可以通过扩散而限速。在不希望受理论约束的情况下，这种方法将引起碳酸氢盐跨越胃肠道的上皮细胞流出，增加紧邻细胞外部(uwl)的ph，并且因此减小粘膜表面处的ph梯度。由于肠细胞的顶端表面处的质子和碳酸氢盐离子经由共转运体、反向转运体以及通道的连续交换，因此维持跨越细胞膜的ph梯度。作为非搅动层的结果，在紧邻上皮膜与肠管腔之间建立另一个ph梯度。两个ph梯度示意性地描绘于图19中。
111.因此，在一些方面，化合物减小胃肠道中的跨上皮ph梯度(cepg)。术语“cepg”包括以下两者之间的ph差异：(i)小肠的表面的上皮细胞的细胞质(即，细胞内ph)，任选地在上皮细胞的近顶端表面处，和(ii)小肠的顶端表面处的非搅动层。某些实施方案排除仅增加胃肠道的腔ph而不会调节碳酸氢盐和/或酸分泌或不会改变非搅动层或uwl中的ph的化合物(例如，抗酸剂)。
112.在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种理论约束的情况下，腔内游离钙离子可以有助于抑制由cepg的减小诱导的pi摄取。在室温下在水性环境中钙和磷酸盐离子的相图示出了钙(并且因此磷酸盐)的溶解度是ph依赖性的，即，磷酸盐溶解度随着ph增加而减小。参看图20。这种现象将表明，在同等条件下，在粘膜表面的微环境中药物诱导的ph增加将使游离pi可用性降至最低，由此减少其在胃肠道中的细胞摄取。
113.根据另一种非限制性理论，磷酸盐离子的摄取可以受小肠中，主要是空肠中水的吸收所影响。具体地说，小肠中增加的水吸收与增加的磷酸盐摄取相关，反之亦然。在这样的情况下，减少小肠中的水吸收的非nhe3结合化合物可以用于抑制磷酸盐摄取。因此，某些实施方案涉及抑制需要降低磷酸盐的患者的胃肠道中的磷酸盐摄取的方法，其包括向患者施用减少小肠中的水吸收的化合物，其中这种化合物不结合nhe3，并且其中这种化合物在胃肠道中实质上具活性以在施用于有需要的患者后抑制其中磷酸盐离子(pi)的转运。在某些实施方案中，化合物减少“净”水吸收，例如通过调节分泌与吸收之间的平衡，例如通过减少吸收、增加分泌或两者。在一些实施方案中，化合物减少空肠中的水吸收。
114.在一些方面，胃肠道中磷酸盐摄取的抑制可以通过施用某些化合物和/或包含其的医药组合物来达成，这些化合物可以被有利地设计以使得极少或实质上没有化合物被吸收至血流中(即，其被设计成非全身的或实质上非全身的)。在这一点上，化合物具有在经肠施用，包括经口施用后产生极少或实质上没有全身可用性的特征。换句话说，化合物并不在有意义的层面上被吸收至血流中并且因此在那里不具有活性，而是具有其实质上定位于gi道内的活性。
115.因此，在如本文进一步描述的某些说明性实施方案中，本发明的化合物一般需要涉及或有助于其在gi道中的活性和/或其实质性非全身生物可用性的结构和/或功能特征的组合。这类特征可以包括例如以下一者或多者：(i)特定tpsa和/或mw值(例如，分别至少约和/或至少约736道尔顿)；(ii)在施用后化合物和/或其代谢物的粪便回收率的特定水平(例如，在72小时处大于50％)；(iii)nh和/或oh和/或潜在氢键供体部分的特定数目(例如，大于约五)；(iv)可旋转键的特定数目(例如，大于约五)；(iv)特定渗透性特征(例如，小于约100
×
10-6
cm/s的p
app
)；和/或如本文所描述的许多其它特征和特性中的任一者。
116.在患有晚期肾病(例如，4期和5期)的患者中，身体磷超负荷本身表现为高于正常水平的血清磷浓度，即，高磷酸盐血症。高磷酸盐血症与死亡率和发病率直接相关。肠磷酸
盐转运的抑制将降低血清磷浓度并且因此改善那些患者中的结果。在2期和3期慢性肾病患者中，身体磷超负荷不一定导致高磷酸盐血症，即，患者保持正常磷酸盐血，但其触发那些患者中fgf-23的增加，fgf-23是死亡率和发病率的风险因子。因此，甚至在那些早期患者中仍需要降低身体磷超负荷以避免相关的骨和血管病症，并且最终改善死亡率。
117.肠磷酸盐转运的抑制将在患有通过抑制磷酸盐从肠中摄取可治疗的疾病的患者中特别有利。此外，磷酸盐转运的抑制可以减缓肾衰竭的进展并且降低心血管事件的风险，连同与需要降低磷酸盐相关的其它疾病或病状。
118.i.抑制磷酸盐转运的化合物
119.本发明的实施方案涉及能够抑制或减少胃肠道中的磷酸盐转运/摄取的化合物，例如，通过调节在胃肠腔的上皮膜内或与胃肠腔的上皮膜相邻的ph，通过减少小肠中的水吸收，或两者。ph调节化合物的实例包括刺激小肠中的碳酸氢盐分泌(即，十二指肠碳酸氢盐分泌或dbs)，抑制小肠中的酸/质子分泌，或两者的那些。
120.本文所提供的化合物可以包括合成或生物来源的小分子、和肽或多肽。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用；然而，在某些情况下，术语“肽”可以指较短多肽，例如，由约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸组成的多肽，包括之间的所有整数和范围(例如，5-10、8-12、10-15)。多肽和肽可以由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸组成。抗体也作为多肽包括在内。
121.在一些实施方案中，化合物选自以下一者或多者：p2y受体激动剂、腺苷a2b受体激动剂、鸟苷酸环化酶c受体激动剂、可溶性鸟苷酸环化酶激动剂、腺苷酸环化酶受体激动剂、咪唑啉-1受体激动剂、胆碱能激动剂、前列腺素ep4受体激动剂、多巴胺d1激动剂、褪黑素受体激动剂、5ht4激动剂、心房利钠肽受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂或腺瘤下调基因(dra或slc26a3)激动剂。在一些方面，如上文所提到，这类激动剂化合物在上胃肠道，包括十二指肠和近端空肠中诱导碳酸氢盐分泌和/或抑制酸分泌。在一些方面，作用机制直接或间接调节顶端质子和碳酸氢盐转运体以在粘膜表面处产生cepg的减小或相对碱性的微环境，从而减少磷酸盐摄取/吸收。
122.在特定方面，化合物直接或间接刺激十二指肠碳酸氢盐分泌(dbs)。dbs是粘膜的天然防御，其在肠管的十二指肠和近端空肠区段中起作用以中和酸性胃液。dbs可以通过许多生物路径来刺激，尤其包括调控氯化物/碳酸氢盐反向转运体，诸如slc26a3(dra)和slc26a3(pat-1)的活性的那些，经由cftr的氯化物和碳酸氢盐通道，以及钙活化的氯化物通道。在一些方面，这些路径通过一个或多个第二信使，诸如细胞内ca

、camp和/或cgmp的增加来刺激。
123.在一些方面，化合物直接或间接减少小肠中的水吸收。在特定方面，化合物减少空肠中的水吸收。在特定方面，化合物使小肠中的水吸收相对于对照化合物或无化合物减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
124.术语“激动剂”包括结合至诸如受体的靶分子并且由那个靶分子触发或刺激细胞反应的化合物。包括超激动剂、完全激动剂、部分激动剂以及选择性激动剂。超激动剂相比内源激动剂对靶分子产生更大的最大反应，完全激动剂相对于内源激动剂对靶分子产生可比的反应，并且部分激动剂相比内源激动剂对靶分子产生显著更小(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％)的最大反应。
125.进一步关于其作为激动剂的活性，在某些实施方案中，化合物也可以由其对标靶的“特异性结合”来表征。举例来说，在一些实施方案中，化合物(例如，直接作用化合物)可以按至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nm的结合亲和力(kd)特异性地结合至本文所描述的标靶。在特定实施方案中，标靶选自以下一者或多者：如本文所描述的p2y受体、腺苷a2b受体、鸟苷酸环化酶c受体、腺苷酸环化酶受体、咪唑啉-1受体、乙酰胆碱受体、前列腺素ep4受体、多巴胺d1受体、褪黑素受体、5ht4、心房利钠肽受体、碳酸酐酶、磷酸二酯酶以及腺瘤下调基因(dra或slc26a3)。
126.a.p2y激动剂
127.在某些实施方案中，化合物是p2y激动剂(或p2y受体激动剂)。p2y受体指的是嘌呤能g蛋白偶合受体的家族。人类p2y受体的实例包括p2y1、p2y2、p2y4、p2y5、p2y6、p2y8、p2y9、p2y
10
、p2y
11
、p2y
12
、p2y
13
以及p2y
14
。p2y受体的主要原生或内源配体是腺苷5
′‑
三磷酸(atp)、腺苷5
′‑
二磷酸(adp)、尿苷5
′‑
三磷酸(utp)、尿苷5
′‑
二磷酸(udp)以及udp-葡萄糖(或其它udp糖)。诸如ap4u的二核苷酸也是天然存在的p2y激动剂。
128.p2y受体已经显示介导十二指肠细胞中的ca

信号传导并且有助于十二指肠粘膜碳酸氢盐分泌。参看例如dong等，am j physiol gastrointest liver physiol 296：g424-g432，2009。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，p2y受体激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中(也称作十二指肠碳酸氢盐分泌；dbs)来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
129.在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，p2y受体激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
130.一些p2y受体例如由诸如atp和adp的腺嘌呤核苷酸选择性地活化，并且其它由尿嘧啶核苷酸或udp-葡萄糖活化。p2y1受体促成规定的p2y-嘌呤受体的功能性。其在包括平滑肌、内皮和神经元组织的多种组织中以及血小板中起作用。p2y1受体对腺嘌呤核苷酸具选择性。adp是最强效的生理激动剂。在一些实施方案中，化合物是p2y1受体激动剂，任选地相对于其它p2y受体是选择性p2y1受体激动剂。p2y1受体激动剂的一个实例是2-甲硫基-adp。
131.在特定实施方案中，化合物是p2y2和/或p2y4受体激动剂，任选地相对于其它p2y受体是选择性p2y2受体激动剂。这两个受体展现所有p2y受体亚型的其tm域的序列的最高同一性(66.8％)。p2y2受体可以例如由尿嘧啶核苷酸、udp-糖衍生物以及腺嘌呤核苷酸(诸如atp)活化。p2y2受体在许多组织中表达，包括肺、心、骨骼肌、脾、肾、肝以及上皮。这些受体在调控上皮细胞中的离子转运方面起重要作用。包括utp、atp、utpγs以及atpγs的三磷酸核苷酸充当p2y2受体的完全激动剂。除了上文所提及的激动剂以外，p2y2受体也响应二腺苷-四磷酸(ap4a)和up4u(地夸磷索(diquafosol)，ins365，用于治疗干眼病)。类似物p-(尿苷5
′
)-p4-(2
′‑
脱氧胞苷5
′
)四磷酸(ins37217)是p2y2受体的强效激动剂，其对p2y4受体具有一些激动剂作用。地纽福索(denufosol)((3s，5r)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基][[[(2r，3s，4r，5r)-5-(2，4-二氧代嘧啶-1-基)-3，4-二羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基]氧基-羟基磷酰基]磷酸氢盐；包括其四钠盐)也是例示性p2y2受体激动剂。还包括psb1114。
[0132]
对于核糖和尿嘧啶修饰，2
′‑
脱氧-2
′‑
氨基-utp与2-硫代-utp都保留utp对p2y2受体的激动剂效力。这两个修饰的组合得到2
′‑
氨基-2-硫代-utp，其协同作用以增强效力(8nm ec
50
)与选择性(300倍p2y2选择性对比于p2y4)。在位置5处的修饰，诸如5-溴-utp(ec
50
＝0.75μm)和5-碘-utp(ec
50
＝0.83μm)，表明引入小疏水基团可能对p2y2受体有益。
[0133]
本文所提供的p2y受体激动剂包括单核苷酸、二核苷酸以及核苷酸-糖，连同本领域中已知的其它激动剂。参看例如美国专利号6,624,150；ep 1196396；wo 2008/060632；cosyn等，bioorg med chem lett.19：3002-5，2009(描述ump的尿苷5
′‑
(磷酸基)膦酸酯和5
′‑
亚甲基膦酸酯)；ko等，bioorg med chem.16：6319-32，2008(描述例如α，β-亚甲基-udp，p2y6受体激动剂；up(4)-苯酯和up(4)-[1]葡萄糖，选择性p2y2受体激动剂；二卤亚甲基膦酸酯类似物，选择性p2y2受体激动剂；ins37217的2-硫代类似物(p(1)-(尿苷-5
′
)-p(4)-(2
′‑
脱氧胞苷-5
′
)四磷酸)，强效和选择性p2y2受体激动剂)；ivanov等，j med chem.50：1166-76，2007；brookings等，bioorg med chem lett.17：562-5，2007(描述一系列核苷三磷酸的合成和p2y2激动剂活性)；以及jacobson等，purinergic signal.5：75-89，2009；其各自以全文引用的方式并入。
[0134]
p2y受体激动剂的额外实例包括wo 1999/09998以及美国申请号2002/0052336和2003/0027785中所描述的那些，包括p1，p
4-二腺苷四磷酸(a2p4)；尿苷-5
′‑
二磷酸(udp)；尿苷-5
′‑
o-(2-硫代二磷酸)(udpβs)；5-溴尿苷-5
′‑
三磷酸(5-brutp)；5-(1-苯基乙炔基)-尿苷-5
′‑
三磷酸(5-(1-苯基乙炔基)utp)；5-甲基尿苷-5
′‑
二磷酸(5-甲基udp)；4-己基硫代尿苷-5
′‑
三磷酸(4-己基硫代utp)；4-硫代尿苷-5
′‑
三磷酸(4-硫代utp)；2-甲氧基尿苷-5
′‑
三磷酸(2-甲氧基utp)；4-(1-吗啉代)尿苷-5
′‑
四磷酸(4-(1-吗啉代)up4)；4-己氧基尿苷-5
′‑
二磷酸(4-己氧基udp)；4-(n，n-二甲基)胞苷-5
′‑
三磷酸(n，n-二甲基ctp)；4-(n-己基)胞苷-5
′‑
三磷酸(n-己基ctp)；p
1-(胞苷-5
′
)-p
4-(尿苷-5
′‑
)四磷酸(cp4u)；p
1-o-(甲基)-p
4-(尿苷-5
′‑
)四磷酸(mep4u)；以及4-(n-环戊基)胸苷-5
′‑
三磷酸(n-环戊基ctp)。
[0135]
还包括5
′‑
腺苷-三磷酸(atp)、5
′‑
尿苷-三磷酸(utp)、尿苷-5
′‑
o-(3-硫代三磷酸)(utpγs)、p
1-(尿苷-5
′
)-p
4-(尿苷-5
′‑
)四磷酸(u2p4)、5
′‑
[4-(硫代尿苷)]-三磷酸(4-硫代utp)以及p
1-(胞苷-5
′
)-p
4-(尿苷-5
′‑
)四磷酸(cp4u)。核苷二磷酸的某些硫代磷酸盐类似物(诸如udp-β-s)的鉴别和制备描述于美国专利号3,846,402以及goody和eckstein(j.am.chem.soc.93：6252-6257.1971)中。或者，utp和其其它类似物也从卖方可购得，诸如sigma(st.louis，mo.)和pharmacia(uppsala，sweden)。鉴别p2y受体激动剂的例示性方法描述于例如美国申请号2003/0175810中。
[0136]
在一些实施方案中，p2y受体激动剂是非内源小分子激动剂。p2y受体激动剂的额外实例示于图4和5a-5c中。
[0137]
b.腺苷a2b受体激动剂
[0138]
在某些实施方案中，化合物是腺苷a2b受体激动剂，任选地选择性激动剂。腺苷通过充当名为a1、a2a、a2b以及a3腺苷受体(ar)的四种受体亚型的局部调节剂来发挥其大多数生理功能。腺苷a2b受体(或adora2b)是在腺苷存在下刺激腺苷酸环化酶活性的g蛋白偶合腺苷受体整合膜蛋白。
[0139]
a2b受体在多种组织中表达，并且在盲肠和大肠中在结肠上皮细胞的粘膜与基底外侧方面已经表现出高浓度。参看baraldi等，purinergic signal.5：3-19，2009。在任一个
位点处的活化经由camp活化的cl-通道囊性纤维化跨膜传导调控子(cftr)的直接活化而引起cl-分泌。cftr调节氯化物与碳酸氢盐的分泌。举例来说，在大鼠中，a2b受体已经免疫定位至十二指肠绒毛的刷状缘膜，其中腔腺苷已经显示经由a2b受体和cftr刺激碳酸氢盐分泌。参看例如ham等，j pharmacol exp ther.335：607-13，2010。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，腺苷a2b受体激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中，例如通过减小cepg来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0140]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，腺苷a2b受体激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0141]
腺苷a2b受体激动剂的一般实例包括腺苷、类腺苷化合物以及非腺苷化合物。在一些实施方案中，基于核苷的腺苷a2b受体激动剂包括经过修饰的腺苷化合物，诸如在嘌呤杂环的n(6)位置、嘌呤杂环的c(2)位置和核糖部分的5
′
位置以及前述的任何组合处被取代的腺苷化合物。还包括非核糖配体，诸如被取代的二腈吡啶，其中2-[6-氨基-3，5-二氰基-4-[4-(环丙基甲氧基)苯基]吡啶-2-基硫烷基]乙酰胺是一个实例。参看例如baraldi等，purinergic signal.4：287-303，2008；和baraldi等，purinergic signal.5：3-19，2009；其各自以全文引用的方式并入。
[0142]
腺苷a2b受体激动剂的额外非限制性实例包括bay 60-6583、cv 1808、amp579、neca(n-乙基甲酰胺基腺苷)、(s)-phpneca、luf-5835、6-鸟嘌呤基neca、以及luf-584。还参看beukers等，j.med.chem.47：3707-3709，2004(描述例如非腺苷激动剂，诸如luf5834(2-氨基-4-(4-羟基苯基)-6-(1h-咪唑-2-基甲基硫烷基)吡啶-3，5-二腈)和luf5835(3-羟基苯基类似物))；beukers等，med res rev.26：667-98，2006(描述例如(s)phpneca和某些非核糖配体作为腺苷a2b受体激动剂)；以及liu等，basic res cardiol.105：129-37，2010。还包括美国申请号2002/0156076中所描述的a2b受体激动剂。这些参考文献以全文引用的方式并入。
[0143]
腺苷a2b受体激动剂的实例示于图6a-6c中，并且连同其合成方法一起在美国申请号2009/0221649以及pct公布号wo 2006/027142、wo 2007/101531和wo 2003/008384中进一步公开，这些文献各自以全文引用的方式并入。
[0144]
c.鸟苷酸环化酶c受体激动剂
[0145]
在某些实施方案中，化合物是鸟苷酰环化酶c(gc-c)激动剂，任选地选择性激动剂。gc-c是高度集中于肠上皮细胞的顶端膜处的鸟苷酸环化酶家族的同种型。gc-c也是造成急性分泌性腹泻的细菌分泌的热稳定肠毒素的靶受体。gc-c也被称为鸟苷酸环化酶2c、肠鸟苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶c受体以及热稳定肠毒素受体(hstar)。
[0146]
gc-c具有细胞外配体结合域、单一跨膜区、类似于蛋白激酶的区、以及c端鸟苷酸环化酶域。酪氨酸激酶活性介导细胞内的gc-c信号传导路径。鸟苷素和尿鸟苷素是gc-c的内源肽配体。gc-c的活化引起例如细胞内cgmp升高、囊性纤维化跨膜调控子(cftr)的pkgii依赖性磷酸化，以及触发增加的氯化物和碳酸氢盐腔内分泌(经由cftr，并且可能经由dra或pat-1)的其它下游信号。
[0147]
诸如利那洛肽、鸟苷素以及大肠杆菌热稳定肠毒素(sta)的gc-c激动剂已经显示刺激十二指肠碳酸氢盐分泌。参看例如rao等，am j physiol gastrointest liver physiol 286：g95-g101，2004；busby等，eur j pharmacol.649：328-35，2010；bryant等，
asn(seq id no：19)的霍乱弧菌(v.cholerae)非01 st肽(takao等，febs lett.193：250，1985)；以及具有成熟氨基酸序列ile asp cys cys glu ile cys cys asn pro ala cys phe gly cys leu asn(seq id no：20)的拟态弧菌(v.mimicus)st肽(arita等，fems microbiol.lett.79：105，1991)。下表a1示出了例示性成熟st肽的序列。
[0152][0153][0154]
不成熟(包括前和原区)形式的大肠杆菌st-ia(st-p)蛋白具有序列：mkklmlaifisvlsfpsfsqstesldsskekitletkkcdvvknnsekksenmnntfyccelccnpacagcy(seq id no：41)；参看入藏号p01559(gi：123711)。前序列从残基1延伸至19。原序列从残基20延伸至54。成熟蛋白从残基55延伸至72。不成熟(包括前和原区)形式的大肠杆菌st-1b(st-h)蛋白具有序列：mkksilfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpesmnssnyccelccnpactgcy(seq id no：42)；参看入藏号p07965(gi：3915589)。不成熟(包括前和原区)形式的小肠结肠炎耶尔森氏菌st蛋白具有序列：mkkivfvlylmlssfgafgqetvsgqfsdalstpitaevykqacdpplppaevssdwdccdvccnpacagc(seq id no：43)；参看入藏号s25659(gi：282047)。因此，gc-c激动剂肽可以包含以下或由以下组成：本文所描述的细菌st肽序列中的任一者或多者，包括其变体。
[0155]
细菌st肽通常具有六个cys残基。这六个cys残基形成成熟和活性形式的肽中的三个二硫键。如果从肽的氨基至羧基端将六个cys残基鉴别为a、b、c、d、e以及f，那么二硫键通常如下形成：a-d、b-e以及c-f。据信这些键的形成有助于gc-c受体结合。因此，在某些实施方案中，gc-c激动剂肽具有选自如上文所示的a-d、b-e以及c-f的任何组合的至少一个、两个或三个二硫键。在一些实施方案中，然而，本文所描述的gc-c肽激动剂的一个或多个半胱氨酸缺失或被不同氨基酸置换。在一些实施方案中，1、2、3、4、5或6个半胱氨酸缺失或被不同氨基酸置换。在特定方面，最n端半胱氨酸残基(例如，a、b或a和b)和/或最c端半胱氨酸残基(例如，e、f或e和f)缺失或被不同氨基酸置换。在某些实施方案中，不同氨基酸是丙氨酸或丝氨酸。
[0156]
某些gc-c激动剂肽包括潜在功能性胰凝乳蛋白酶裂解位点，例如，位于cys b/cys d之间或cys e/cys f之间的trp、tyr或phe。在胰凝乳蛋白酶裂解位点处的裂解可以降低肽结合至gc-c受体的能力。在人体中，非活性形式的胰凝乳蛋白酶，即胰凝乳蛋白酶原在胰中产生。当这种非活性酶到达小肠时，其通过两个二肽的切除而转化成活性胰凝乳蛋白酶。活性胰凝乳蛋白酶可以使肽在trp、tyr或phe的羧基端侧的肽键处裂解。肠道中活性胰凝乳蛋白酶的存在可以引起具有适当定位的功能性胰凝乳蛋白酶裂解位点的某些gc-c肽激动剂的裂解。在一些情况下，预期胰凝乳蛋白酶裂解将缓和当肽通过肠道时具有适当定位的胰凝乳蛋白酶裂解位点的gc-c肽激动剂的作用。
[0157]
某些gc-c激动剂肽包括潜在功能性胰蛋白酶裂解位点，例如，lys或arg。胰蛋白酶原，如胰凝乳蛋白酶，是在胰中产生并且存在于消化道中的丝氨酸蛋白酶。活性形式的胰蛋白酶将使具有lys或arg的肽裂解。肠道中活性胰蛋白酶的存在可以引起具有适当定位的功能性胰蛋白酶裂解位点的某些gc-c激动剂肽的裂解。在某些情况下，预期胰蛋白酶裂解将缓和当肽通过肠道时具有适当定位的胰蛋白酶裂解位点的gc-c肽激动剂的作用。
[0158]
在某些实施方案中，肽包含可以形成三个二硫键的至少六个半胱氨酸。在某些实施方案中，二硫键被其它共价交联置换并且在一些情况下半胱氨酸被其它残基取代以提供替代性共价交联(本文别处描述)。某些肽包括经过定位以允许肽在裂解后失活的功能性胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶裂解位点。具有功能性裂解位点的某些肽在消化道中经历裂解和逐渐失活，并且这在一些情况下是合乎需要的。在某些肽中，改变功能性胰凝乳蛋白酶位点，从而增加体内肽的稳定性。
[0159]
在某些实施方案中，肽在羧基端包括一个或两个或更多个相连的带负电氨基酸(例如，asp或glu)或一个或两个或更多个相连的带正电残基(例如，lys或arg)或一个或两个或更多个相连的带正电或带负电氨基酸。在这些和相关实施方案中，在羧基端的所有侧接氨基酸带正电或带负电。在一些实施方案中，羧基端带电氨基酸之前是leu。举例来说，可以将以下氨基酸序列添加至肽的羧基端：asp；asp lys；lys lys lys lys lys lys(seq id no：44)；asp lys lys lys lys lys lys(seq id no：45)；leu lys lys；以及leu asp。在特定实施方案中，将leu添加至羧基端。
[0160]
在一些方面，(细菌st类似物)gc-c激动剂肽包含以下所示的氨基酸序列(i)、由其组成或基本上由其组成：
[0161]
xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 xaa
12 xaa
13 xaa
14 cys
15 xaa
16 xaa
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：46)
[0162]
在一些实施方案中，xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5是asn ser ser asn tyr(seq id no：2)或丢失，或xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa4丢失。在某些实施方案中，xaa8、xaa9、xaa
12
、xaa
14
、xaa
16
、xaa
17
以及xaa
15
是任何氨基酸。在某些实施方案中，xaa8、xaa9、xaa
12
、xaa
14
、xaa
16
、xaa
17
以及xaa
19
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。
[0163]
在某些实施方案中，xaa5是asn、trp、tyr、asp或phe。在其它实施方案中，xaa5是thr或ile。在一些实施方案中，xaa5是tyr、asp或trp。在某些实施方案中，xaa5是asn、trp、tyr、asp、ile、thr或phe。在特定实施方案中，xaa5是asn。
[0164]
在某些实施方案中，xaa8是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa8是glu、asp、gln、gly或pro。在其它实施方案中，xaa8是glu。在一些实施方案中，xaa8是glu或asp。在一些实施方案中，xaa8是asn、glu或asp。在一些实施方案中，xaa8是glu、his、lys、gln、asn或asp。在一些实施方案中，xaa8是glu、his、gln、asn或asp。在一些实施方案中，xaa8是glu、asn、his、gln、lys、asp或ser。在特定实施方案中，xaa8是pro。
[0165]
在某些实施方案中，xaa9是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa9是任何天然或非天然芳香族氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa9是leu、ile、val、ala、lys、arg、trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、ile、val、lys、arg、trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、ile、val、trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、ile或val。在一些实施方案中，xaa9是trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、ile、lys、arg、trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、val、ile或met。在一些实施方案中，xaa9是leu或phe。在一些实施方案中，xaa9是leu、phe或tyr。在一些实施方案中，xaa9是tyr、phe或his。在一些实施方案中，xaa9是phe、his、trp或tyr。在某些实施方案中，xaa9不是leu。在特定实施方案中，xaa9是tyr。
[0166]
在某些实施方案中，xaa
12
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在某些实施方案中，xaa
12
是asn、tyr、asp或ala。在特定实施方案中，xaa
12
是asn。在某些实施方案中，xaa
12
是asn、met、arg、lys、his或gln。在某些实施方案中，xaa
12
是asn、lys、his或gln。在某些实施方案中，xaa
12
是asn、asp、glu或gln。在某些实施方案中，xaa
12
是asn、thr、ser、arg、lys、gln或his。在一些实施方案中，xaa
12
是asn、ser或his。
[0167]
在某些实施方案中，xaa
13
是ala、pro或gly。在某些实施方案中，xaa
13
是pro或gly。在特定实施方案中，xaa
13
是pro。在特定实施方案中，xaa
13
是gly。
[0168]
在某些实施方案中，xaa
14
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在某些实施方案中，xaa
14
是ala、leu、ser、gly、val、glu、gln、ile、leu、thr、lys、arg或asp。在某些实施方案中，xaa
14
是ala或gly。在一些实施方案中，xaa
14
是val或ala。在某些实施方案中，xaa
14
是ala或thr。在特定实施方案中，xaa
14
是ala。在某些实施方案中，xaa
14
是val、gln、asn、glu、asp、thr或ala。在某些实施方案中，xaa
14
是gly、cys或ser。
[0169]
在某些实施方案中，xaa
16
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa
16
是任何天然或非天然非芳香族氨基酸或氨基酸类似物。在某些实施方案中，xaa
16
是thr、ala、asn、lys、arg、trp、gly或val。在某些实施方案中，xaa
16
是thr、ala、asn、lys、arg或trp。在某些实施方案中，xaa
16
是thr、ala、lys、arg或trp。在一些实施方案中，xaa
16
是thr、ala或trp。在一些实施方案中，xaa
16
是thr。在一些实施方案中，xaa
16
是trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa
16
是thr或ala。在特定实施方案中，xaa
16
是val。在特定实施
方案中，xaa
16
是gly。在一些实施方案中，xaa
16
是thr、ser、met或val。在一些实施方案中，xaa
16
是val、ala或thr。在一些实施方案中，xaa
16
是ile、val、lys、asn、glu、asp或thr。
[0170]
在某些实施方案中，xaa
17
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa
17
是gly、pro或ala。在特定实施方案中，xaa
17
是gly。在特定实施方案中，xaa
17
是ala。在一些实施方案中，xaa
17
是gly或ala。在一些实施方案中，xaa
17
是gly、asn、ser或ala。在一些实施方案中，xaa
17
是asn、glu、asp、thr、ala、ser或gly。在一些实施方案中，xaa
17
是asp、ala、ser或gly。
[0171]
在某些实施方案中，xaa
19
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物。在一些实施方案中，xaa
19
是trp、tyr、phe、asn、ile、val、his、leu或arg。在一些实施方案中，xaa
19
是trp、tyr、asn或leu。在一些实施方案中，xaa
19
是trp、tyr或phe。在一些实施方案中，xaa
19
是tyr、phe或his。在一些实施方案中，xaa
19
是tyr或trp。在特定实施方案中，xaa
19
是tyr。在一些实施方案中，xaa
19
是leu、ile或val。在特定实施方案中，xaa
19
是his。在一些实施方案中，xaa
19
是trp、tyr、phe、asn、ile、val、his或leu。在一些实施方案中，xaa
19
是trp、tyr、phe或leu。在一些实施方案中，xaa
19
是tyr或leu。在一些实施方案中，xaa
19
是lys或arg。在一些实施方案中，xaa
19
是除pro、arg、lys、asp或glu之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，xaa
19
是除pro之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，xaa
19
丢失。
[0172]
在某些实施方案中，xaa
20
是asp或asn。在某些实施方案中，xaa
20
xaa
21
是aspphe或丢失。在一些实施方案中，xaa
20
是asn或glu并且xaa
21
丢失。在一些实施方案中，xaa
19
xaa
20
xaa
21
丢失。
[0173]
在一些方面，gc-c激动剂肽包含以下所示的氨基酸序列(ii)、由其组成或基本上由其组成：
[0174]
xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 asn
12 pro
13 ala
14 cys
15 xaa
16 gly
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：47)
[0175]
其中xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5是asn ser ser asn tyr(seq id no：2)或丢失，或xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa4丢失并且xaa5是asn；
[0176]
xaa8是glu或asp；
[0177]
xaa9是leu、ile、val、trp、tyr或phe；
[0178]
xaa
16
是thr、ala、trp；
[0179]
xaa
19
是trp、tyr、phe或leu，或丢失；并且xaa
20
xaa
21
是aspphe。
[0180]
在一些方面，gc-c激动剂肽包含氨基酸序列(ii)、由其组成或基本上由其组成：xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 asn
12 pro
13 ala
14 cys
15 xaa
16 gly
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：48)，其中xaa9是leu、ile或val并且xaa
16
是trp、tyr或phe；xaa9是trp、tyr或phe，并且xaa
16
是thr或ala；xaa
19
是trp、tyr、phe并且xaa
20
xaa
21
是aspphe；并且xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa4丢失并且xaa5是asn；肽包含少于50、40、30或25个氨基酸；或少于五个氨基酸在cys6之前。
[0181]
在一些方面，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：氨基酸序列xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys cys glu xaa
9 cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr xaa
20 xaa
21
(ii)(seq id no：49)，其中xaa9是任何氨基酸；其中xaa9是除leu之外的任何氨基酸；其中xaa9选自phe、trp以及tyr；其中xaa9选自任何其它天然或非天然芳香族氨基
酸；其中xaa9是tyr；其中xaa9是phe；其中xaa9是trp；其中xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5是asn ser ser asn tyr；其中xaa1、xaa2、xaa3、xaa4以及xaa5丢失；其中xaa1、xaa2、xaa3以及xaa4丢失；其中xaa1、xaa2以及xaa3丢失；其中xaa1和xaa2丢失；其中xaa1丢失；其中xaa
20
xaa
21
是aspphe或丢失，或xaa
20
是asn或glu并且xaa
21
丢失，或xaa
19
xaa
20
xaa
21
丢失；其中xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5和tyr xaa
20 xaa
21
丢失。在一些方面，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：氨基酸序列xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 xaa
12 xaa
13 xaa
14 cys
15 xaa
16 xaa
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(i)(seq id no：50)，其中：xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5丢失和/或序列xaa
19 xaa
20 xaa
21
丢失，其中肽任选地包含额外羧基端和/或氨基端氨基酸。在肽丢失一个或多个末端氨基酸，诸如xaa1或xaa
21
的情况下，肽可以任选地包含额外羧基端和/或氨基端氨基酸。
[0182]
在某些实施方案中，肽包括介于cys6与cys
11
之间、介于cys7与cys
15
之间以及介于cys
10
与cys
16
之间的二硫键。在一些实施方案中，肽是不具有二硫键的还原肽。在其它实施方案中，肽具有一个或两个选自以下的二硫键：介于cys6与cys
11
之间的二硫键、介于cys7与cys
15
之间的二硫键以及介于cys
10
与cys
16
之间的二硫键。
[0183]
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸、或天然或非天然存在的氨基酸类似物置换。存在标准的20个氨基酸以外的许多氨基酸。一些是天然存在的，其它是非天然存在的(参看例如hunt，非蛋白质氨基酸：在氨基酸化学和生物化学中(the non-protein amino acids：in chemistry and biochemistry of the amino acids)，barrett，chapman and hall，1985)。举例来说，芳香族氨基酸可以被3，4-二羟基-l-苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸、l-甲状腺素、苯基甘氨酸(phg)或正酪氨酸(nortyr)置换。phg和nortyr以及包括phe和tyr的其它氨基酸可以被例如卤素、-ch3、-oh、-ch2nh3、-c(o)h、-ch2ch3、-cn、-ch2ch2ch3、-sh或另一个基团取代。任何氨基酸可以被d型氨基酸取代。
[0184]
关于非天然存在的氨基酸或天然和非天然存在的氨基酸类似物，式i的肽和式ii的肽中的许多取代是可能的。举例来说，在一些方面，xaa8可以被γ-羟基-glu或γ-羧基-glu置换。在一些方面，xaa9可以被诸如l-α-甲基苯丙氨酸的α取代氨基酸或被诸如以下的类似物置换：3-氨基-tyr；tyr(ch3)；tyr(po3(ch3)2)；tyr(so3h)；β-环己基-ala；β-(1-环戊烯基)-ala；β-环戊基-ala；β-环丙基-ala；β-喹啉基-ala；β-(2-噻唑基)-ala；β-(三唑-1-基)-ala；β-(2-吡啶基)-ala；β-(3-吡啶基)-ala；氨基-phe；氟-phe；环己基-gly；tbu-gly；β-(3-苯并噻吩基)-ala；β-(2-噻吩基)-ala；5-甲基-trp；以及4-甲基-trp。
[0185]
在一些实施方案中，xaa
13
可以是具有以下结构的n(α)-c(α)环化氨基酸类似物：
[0186][0187]
xaa
13
也可以是高脯氨酸(l-哌啶酸)；羟基-pro；3，4-脱氢-pro；4-氟-pro；或α-甲基-pro。
[0188]
在xaa
13
是gly、ala、leu或val的方面，xaa
14
可以是：
[0189][0190]
在某些方面，xaa
14
可以是α-取代或n-甲基化氨基酸，诸如α-氨基异丁酸(aib)、l/d-α-乙基丙氨酸(l/d-异缬氨酸)、l/d-甲基缬氨酸或l/d-α-甲基亮氨酸，或非天然氨基酸，诸如β-氟-ala。
[0191]
在一些方面，xaa
17
可以是α-氨基异丁酸(aib)或l/d-α-乙基丙氨酸(l/d-异缬氨酸)。
[0192]
非天然氨基酸和氨基酸类似物的额外实例在本领域中是已知的并且在本文别处描述。
[0193]
在一些情况下，例如，在xaa9是trp、tyr或phe的情况下或在xaa
16
是trp的情况下，肽具有潜在功能性胰凝乳蛋白酶裂解位点，其位于裂解可以改变肽对gc-c受体的结合的位置处。当xaa9是lys或arg时或当xaa
16
是lys或arg时，肽具有潜在功能性胰蛋白酶裂解位点，其位于裂解可以改变肽对gc-c受体的结合的位置处。
[0194]
在某些情况下，例如，在xaa
19
是trp、tyr或phe的情况下，肽具有胰凝乳蛋白酶裂解位点，其位于裂解将释放在xaa
19
的羧基端的肽部分的位置处。当xaa
19
是leu、ile或val时，肽可以具有胰凝乳蛋白酶裂解位点，其位于裂解将释放在xaa
19
的氨基端的肽部分的位置处。如果xaa
19
是his，那么在相对高的ph下可以观察到相同的效应。在xaa
19
是lys或arg的情况下，肽具有胰蛋白酶裂解位点，其位于裂解将释放在xaa
19
的羧基端的肽部分的位置处。
[0195]
在一些情况下，例如，在xaa1或肽的氨基端氨基酸(例如，xaa2或xaa3)是trp、tyr或phe的情况下，肽具有胰凝乳蛋白酶裂解位点，其位于裂解将连同xaa1、xaa2或xaa3一起释放在xaa1(或xaa2或xaa3)的氨基端的肽部分的位置处。如果xaa1或本发明肽的氨基端氨基酸(例如，xaa2或xaa3)是lys或arg，那么肽具有胰蛋白酶裂解位点，其位于裂解将连同xaa1、xaa2或xaa3一起释放在xaa1的氨基端的肽部分的位置处。如果xaa1或本发明肽的氨基端氨基酸是leu、ile或val，那么肽可以具有胰凝乳蛋白酶裂解位点，其位于裂解将释放在xaa1的氨基端的肽部分的位置处。当xaa1是his时，在相对高的ph下观察到相同的效应。
[0196]
如果完全折叠的话，那么二硫键可以存在于以下之间：cys6与cys
11
；cys7与cys
15
；以及cys
10
与cys
18
。在一些方面，gc-c激动剂肽与st肽是同一的或与st肽具有序列相似性。然而，在一些方面，gc-c激动剂肽包含改善功能性的氨基酸变化和/或添加。这些变化可以例如增加或减小活性(例如，增加或减小肽减少磷酸盐摄取的能力)，改变肽正确折叠的能力，改变肽的稳定性，改变肽结合gc-c受体的能力，和/或减小毒性。在一些情况下，肽可以比野生型st肽更理想地发挥功能。举例来说，在某些情况下，减少不合需要的副作用，诸如腹泻和脱水。
[0197]
在肽包含以下或由以下组成的情况下：序列(i)xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 xaa
12 xaa
13 xaa
14 cys
15 xaa
16 xaa
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：50)或xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys cys glu xaa
9 cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr xaa
20 xaa
21
(ii)(seq id no：49)，其中：xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5丢失和/或序列xaa
19 xaa
20 xaa
21
丢失，肽可以任选地包含额外羧基端和/或氨基端氨基酸。
举例来说，肽可以包括促进肽的重组产生并且在将肽施用于患者之前裂解的氨基端序列。肽还可以包括其它氨基端或羧基端氨基酸。在一些情况下，额外氨基酸保护肽，使肽稳定，和/或改变肽的活性。在一定情况下，在将肽施用于患者之前去除一些或所有额外氨基酸。肽在其氨基端和/或羧基端可以包括1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。侧接氨基酸的数目不需要是相同的。举例来说，在肽的氨基端可以存在10个额外氨基酸并且在羧基端无一存在。
[0198]
在一些实施方案中，肽包含氨基酸序列(i)：xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 xaa
12 xaa
13 xaa
14 cys
15 xaa
16 xaa
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：50)，其中：xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5丢失；xaa8是glu；xaa9是leu、ile、lys、arg、trp、tyr或phe；xaa
12
是asn；xaa
13
是pro；xaa
14
是ala；xaa
16
是thr、ala、lys、arg、trp；xaa
17
是gly；xaa
19
是tyr或leu；并且xaa
20 xaa
21
是asp phe或丢失。在xaa
20 xaa
21
和/或xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa5丢失的情况下，肽可以任选地包含额外侧接氨基酸。
[0199]
包含氨基酸序列xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys cys glu xaa
9 cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr xaa
20 xaa
21
(ii)(seq id no：49)、由其组成或基本上由其组成的gc-c激动剂肽的实例示于下表a2中。
[0200]
[0201][0202]
gc-c激动剂肽的额外实例示于下表a3中。
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213][0214]
在特定实施方案中，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：氨基酸序列cys cys glu tyr cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr(seq id no：4)。
[0215]
还包括本文所描述的gc-c激动剂肽中的任一者的缺失变体。实例包括除cys(或取代cys的氨基酸，例如，能够与另一个氨基酸形成共价键的氨基酸)之外的一个、两个、三个或四个氨基酸(或非天然氨基酸或天然或非天然氨基酸类似物)缺失的缺失变体。特定实例包括两个(或更多个)氨基酸缺失并且肽包含以下序列：cys
a cys
b xaa xaa cys
c cys
d xaa xaa xaa cys
e xaa xaa cysf(seq id no：526)。在这些和相关实施方案中的一些实施方案中，两个或更多个缺失可以位于cysb与cysc之间和/或cysd与cyse之间和/或cyse与cysf之间。然而，在其它实施方案中，在cysb与cysc之间或cysd与cyse之间或cyse与cysf之间中的每一者至多存在一个缺失。因此，包括本文所描述的gc-c激动剂肽中的任一者，其包含序列cys
a cys
b xaa xaa cys
c cys
d xaa xaa xaa cys
e xaa xaa cysf(seq id no：526)，其中：a)介于cysb与cysc之间的一个氨基酸缺失；b)介于cysd与cyse之间的一个氨基酸缺失；c)介于cyse与cysf之间的一个氨基酸缺失；d)介于cysb与cysc之间的一个氨基酸缺失并且介于cysd与cyse之间的一个氨基酸缺失；e)介于cysd与cyse之间的一个氨基酸缺失并且介于cyse与cysf之间的一个氨基酸缺失；f)介于cysb与cysc之间的一个氨基酸缺失并且介于cyse与cysf之间的一个氨基酸缺失；或g)介于cysb与cysc之间的一个氨基酸缺失，介于cysd与cyse之间的一个氨基酸缺失并且介于cyse与cysf之间的一个氨基酸缺失。在某些实施方案中，缺失变体是结合至和/或激动gc-c受体的肽。
[0216]
还包括本文所描述的gc-c激动剂肽中的任一者的插入变体。实例包括一个、两个、三个或四个氨基酸(例如，gly或ala)插入肽中的任何氨基酸之前或之后的插入变体。在一些实施方案中，不多于一个氨基酸插入两个cys残基之间。特定实例包括插入两个或更多个氨基酸并且肽包含序列cys
a cys
b xaa xaa cys
c cys
d xaa xaa xaa cys
e xaa xaa cysf(seq id no：526)。在这些和相关实施方案中的一些实施方案中，两个或更多个插入可以位于cysb与cysc之间或cysd与cyse之间或cyse与cysf之间。然而，在其它实施方案中，不多于一个插入位于cysb与cysc之间或cysd与cyse之间或cyse与cysf之间。因此，包括本文所描述的gc-c激动剂肽中的任一者，其包含序列cys
a cys
b xaa xaa cys
c cys
d xaa xaa xaa cys
e xaa xaa cysf(seq id no：526)，其中：a)一个氨基酸插入cysb与cysc之间；b)一个氨基酸插入cysd与cyse之间；c)一个氨基酸插入cyse与cysf之间；d)一个氨基酸插入cysb与cysc之间并且一个氨基酸插入cysd与cyse之间；e)一个氨基酸插入cysd与cyse之间并且一个氨基酸插入cyse与cysf之间；f)一个氨基酸插入cysb与cysc之间并且一个氨基酸插入cyse与cysf之
间；或g)一个氨基酸插入cysb与cysc之间，一个氨基酸插入cysd与cyse之间并且一个氨基酸插入cyse与cysf之间。另外，一个或多个氨基酸可以插入cysa之前和/或一个或多个氨基酸可以插入cysf之后。在一些实施方案中，插入变体是结合至和/或激动gc-c受体的肽。
[0217]
cys cys glu tyr cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr(seq id no：4)的插入变体的实例包括至多四个氨基酸(即，0、1、2、3或4个)插入每个氨基酸之后的那些。因此，包括具有以下序列的肽：cys xaa
(0-4) cys xaa
(0-4) glu xaa
(0-4) tyr xaa
(0-4) cys xaa
(0-4) cys xaa
(0-4) asn xaa
(0-4) pro xaa
(0-4) ala xaa
(0-4) cys xaa
(0-4) thr xaa
(0-4) gly xaa
(0-4) cys xaa
(0-4) tyr xaa
(0-4)
(seq id no：527)。插入的氨基酸可以是任何氨基酸或氨基酸类似物(天然或非天然)并且可以是相同或不同的。在某些实施方案中，插入的氨基酸全部是gly或全部是ala或是gly与ala的组合。
[0218]
还包括gc-c激动剂肽，其包含序列xaa
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 xaa
5 cys
6 cys
7 xaa
8 xaa
9 cys
10 cys
11 xaa
12 xaa
13 xaa
14 cys
15 xaa
16 xaa
17 cys
18 xaa
19 xaa
20 xaa
21
(seq id no：46)或由这个序列组成，并且包括例如cys cys glu tyr cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr(seq id no：4)的变体，其中至多四个氨基酸缺失和/或插入至多四个氨基酸。在一些情况下，插入和/或缺失可以介于cys6与cys
18
之间或其可以在cys6的氨基端和/或cys
18
的羧基端。
[0219]
在某些实施方案中，gc-c激动剂肽基于核心序列：cys cys glu leu cys cys asn pro ala cys thr gly cys tyr(seq id no：528)。为了形成具有能够使肽失活的潜在功能性胰凝乳蛋白酶裂解位点的变体，leu(加下划线)或thr(加下划线)可以被trp、phe或tyr置换；或leu与thr都可以(独立地)被trp、phe或tyr置换。核心序列之前可以任选地是asn ser ser asn tyr或asn。基于核心序列的gc-c激动剂肽的特定实例包括下表a4中的那些。
[0220][0221][0222]
在某些实施方案中，gc-激动剂肽是鸟苷素、淋巴鸟苷素、尿鸟苷素或肾鸟苷素(renoguanylin)肽，任选地人类肽，或其变体或衍生物或类似物。人类鸟苷素的氨基酸序列是pro gly thr cys glu ile cys ala tyr ala ala cys thr gly cys(seq id no：562)。人类鸟苷素序列的例示性类似物示于下表a5中。
[0223]
[0224][0225]
因此，在一些实施方案中，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：人类鸟苷素序列，或其变体或衍生物或类似物。
[0226]
淋巴鸟苷素的氨基酸序列是：gln-glu-glu-cys-glu-leu-cys-ile-asn-met-ala-cys-thr-gly-tyr(seq id no：615)。人类淋巴鸟苷素序列的例示性类似物示于下表a6中。
[0227]
[0228][0229]
因此，在一些实施方案中，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：人类淋巴鸟苷素序列，或其变体或衍生物或类似物。
[0230]
人类尿鸟苷素的氨基酸序列是asn asp asp cys glu leu cys val asn val ala cys thr gly cys leu(seq id no：648)。在一些实施方案中，gc-c激动剂肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：人类尿鸟苷素序列或其类似物。在特定实施方案中，人类尿鸟苷素类似物具有氨基酸序列asn asp glu cys glu leu cys val asn val ala cys thr gly cys leu(seq id no：6；皮卡那肽)或gln asp asp cys glu thr cys ile asn met ala cys thr gly tyr(seq id no：649)。在特定实施方案中，肽(例如，皮卡那肽)的n端asn是焦谷氨酸。在一些实施方案中，肽(例如，皮卡那肽)的c端leu是d-氨基酸(d-leu)。
[0231]
在某些实施方案中，人类尿鸟苷素肽或类似物包含以下所示的氨基酸序列(iii)、由其组成或基本上由其组成：
[0232]
xaa
1 xaa
2 xaa
3 cys
4 xaa
5 xaa
6 xaa
7 xaa
8 xaa
9 xaa
10 xaa
11 cys
12 xaa
13 xaa
14 xaa
15 xaa
16
(seq id no：650)
[0233]
在一些实施方案中，式iii的gc-c激动剂肽定义如下：
[0234]
xaa1是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0235]
xaa2是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0236]
xaa3是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0237]
xaa5是glu；
[0238]
xaa6是tyr、trp、phe或leu；
[0239]
xaa7是cys；
[0240]
xaa8是除cys之外的任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物(任选地20个天然存在的氨基酸中的任一者)，或丢失；
[0241]
xaa9是除cys之外的任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物(任选地20个天然存在的氨基酸中的任一者)；
[0242]
xaa
10
是pro或gly；
[0243]
xaa
11
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物(任选地20个天然存在的氨基酸中的任一者)；
[0244]
xaa
13
是thr、val或gly；
[0245]
xaa
14
是gly或ala；
[0246]
xaa
15
是cys；并且
[0247]
xaa
16
是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物(任选地20个天然存在的氨基酸中的任一者)，或丢失。
[0248]
在某些实施方案中：xaa9是asn；xaa
11
是ala或thr；xaa8丢失；并且xaa
16
是tyr。
[0249]
在一些实施方案中，xaa4之前紧邻的是选自以下的氨基酸序列：ser his thr；pro ser thr；thr；pro asp pro；ile ala glu asp ser his thr(seq id no：651)；ile ala gln asp pro ser thr(seq id no：652)；ala asn thr；asn thr；asp pro asn thr(seq id no：653)；lys asn thr；pro asn thr；ile ala gln asp pro asn thr(seq id no：654)；lys pro asn thr(seq id no：655)；asp pro gly thr(seq id no：656)；glu asp pro gly thr(seq id no：657)；pro gly thr；pro ala thr；val ala ala arg ala asp leu(seq id no：658)；gly asp asp；asn asp glu；gln glu asp；asn asp asp；arg thr ile ala asn asp asp(seq id no：659)；thr ile ala asn asp asp(seq id no：660)；asp asp；arg thr met asp asn asp glu(seq id no：661)；arg thr ile ala gly asp asp(seq id no：662)；arg thr ile ala asn asp(seq id no：663)；asp；glu asp；arg ser ile ser gln glu asp(seq id no：664)；thr asp glu；arg thr ile ala thr asp glu(seq id no：665)；glu；ile ile thr pro pro asp pro(seq id no：666)；gln glu leu；lys asp asp；gln glu glu；arg tyr ile asn gln glu glu(seq id no：667)；ala ser ser tyr ala ser(seq id no：668)；以及thr ser ser tyr ala ser(seq id no：669)。
[0250]
在特定实施方案中，式iii的gc-c激动剂肽定义如下：
[0251]
xaa1是：a)ser、asn、tyr、ala、gln、pro、lys、gly或thr，或丢失；b)之前是lys或tyr；c)任何氨基酸；d)丢失；e)除cys之外的任何氨基酸；或f)lys或arg；
[0252]
xaa2是：a)his、asp、glu、ala、ser、asn、gly，或丢失；b)his、asp、glu、ala、ser、asn、gly、pro，或丢失；c)asp、glu、任何氨基酸，或丢失；d)asp或glu；e)除cys之外的任何氨基酸；e)glu；f)丢失；g)trp、tyr或phe；或h)lys或arg；
[0253]
xaa3是：a)thr、asp、ser、glu、pro、val或leu；asp或glu；b)除cys之外的任何氨基酸；c)glu；d)thr；e)thr、asp、ser、glu、pro、val或leu，或丢失；f)trp、tyr或phe；或g)lys或arg；
[0254]
cys4任选地是xaa4并且是cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；
[0255]
xaa5是：a)任何氨基酸；b)glu、asp、gln、gly或pro；c)glu；d)glu或asp；e)asp、ile或glu；f)任何氨基酸；或g)除cys之外的任何氨基酸；
[0256]
xaa6是：a)leu、ile、val、ala、lys、arg、trp、tyr或phe；b)leu、ile、val、lys、arg、trp、tyr或phe；leu、ile、lys、arg、trp、tyr或phe；c)leu、ile、val、trp、tyr或phe；d)trp、tyr、phe或leu；e)leu、ile或val；f)ile、trp或leu；g)trp、tyr或phe；h)ile或leu；i)tyr；j)任何氨基酸；k)除leu之外的任何氨基酸；1)任何天然或非天然芳香族氨基酸；或m)除cys之外的任何氨基酸；
[0257]
xaa7是：a)cys、ser或tyr；cys；b)cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；c)ser；或d)除cys之外的氨基酸；
[0258]
xaa8是：a)ala、val或ile；b)ala、val、thr、ile、met，或丢失；c)任何氨基酸；d)val；e)除cys之外的任何氨基酸；或f)丢失；
[0259]
xaa9是：a)任何氨基酸；b)除phe和tyr之外的任何氨基酸；c)除phe、tyr以及trp之外的任何氨基酸；d)除phe、tyr、trp、ile、leu以及val之外的任何氨基酸；e)除phe、tyr、trp、ile、leu、val以及his之外的任何氨基酸；i)除gln之外的任何氨基酸；g)除lys、arg、phe、tyr以及trp之外的任何氨基酸；h)除lys、arg、phe、tyr、trp、ile、leu以及val之外的任何氨基酸；i)除lys、arg、phe、tyr、trp、ile、leu、val以及his之外的任何氨基酸；j)任何非芳香族氨基酸；k)丢失；l)phe、tyr、asn或trp；m)asn、tyr、asp或ala；n)asn、gln或tyr；o)phe或tyr；p)asn；或q)除cys之外的任何氨基酸；
[0260]
xaa
10
是：a)ala、pro或gly；b)pro或gly；c)pro；d)ala、val、met、thr或ile；e)任何氨基酸；f)val；g)val或pro；h)ala或val；i)除cys之外的任何氨基酸；j)pro；或k)gly；
[0261]
xaa
11
是：a)任何氨基酸；b)ala、leu、ser、gly、val、glu、gln、ile、leu、lys、arg或asp；c)ala或gly；d)ala；e)ala或val；f)任何氨基酸；g)ala或aib(α-氨基异丁酸)；h)除cys之外的任何氨基酸；i)ala或thr；或j)thr；
[0262]
cys
12
任选地是xaa
12
并且是a)cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；或b)除cys之外的任何氨基酸；
[0263]
xaa
13
是：a)thr、ala、asn、lys、arg或trp；b)thr、ala、lys、arg或trp；c)任何氨基酸；d)任何非芳香族氨基酸；e)thr、ala或trp；f)trp、tyr或phe；g)thr或ala；h)任何氨基酸；i)thr；j)除cys之外的任何氨基酸；k)thr、val或gly；l)thr或val；m)thr或gly；n)val或thr；o)val；p)thr；或q)gly；
[0264]
xaa
14
是：a)gly、pro或ala；b)gly；c)任何氨基酸；d)gly、ala或ser；e)gly或ala；f)除cys之外的任何氨基酸；或g)ala；
[0265]
xaa
15
是：a)cys、tyr，或丢失；b)cys；c)cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp、glu；或d)除cys之外的任何氨基酸，或丢失；并且
[0266]
xaa
16
是：a)trp、tyr、phe、asn、lie、val、his或leu；b)trp、tyr、phe、asn或leu；c)tip、tyr、phe或leu；d)trp、tyr或phe；e)leu、ile或val；f)his、leu或ser；g)tyr或leu；lys或arg；h)his；i)任何氨基酸；j)leu，或丢失；k)trp、tyr、phe、lys、arg，或丢失；l)丢失；m)除cys之外的任何氨基酸；或n)tyr。
[0267]
在一些实施方案中，式iii的gc-c激动剂肽定义如下：
[0268]
xaa1是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0269]
xaa2是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0270]
xaa3是任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0271]
xaa4是cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；
[0272]
xaa5是glu；
[0273]
xaa6是tyr、trp、phe或leu；
[0274]
xaa7是cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；
[0275]
xaa8是除cys之外的任何天然或非天然氨基酸或氨基酸类似物，或丢失；
[0276]
xaa9是任何氨基酸；
[0277]
xaa
10
是pro或gly；
[0278]
xaa
11
是任何氨基酸；
[0279]
xaa
12
是cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；
[0280]
xaa
13
是thr、val或gly；
[0281]
xaa
14
是gly或ala；
[0282]
xaa
15
是cys、mpt(巯基脯氨酸)、pen(青霉胺)、dpr(二氨基丙酸)、asp或glu；并且
[0283]
xaa
16
是任何氨基酸，或丢失。
[0284]
在特定实施方案中，式iii的gc-c激动剂肽定义如下：
[0285]
xaa1是asn、任何氨基酸，或丢失；
[0286]
xaa2是asp、glu、任何氨基酸，或丢失；
[0287]
xaa3是asp或glu；
[0288]
xaa5是任何氨基酸或glu；
[0289]
xaa6是任何氨基酸或leu；
[0290]
xaa7是cys；
[0291]
xaa8是任何氨基酸或val；
[0292]
xaa9是asn、gln或tyr；
[0293]
xaa
10
是任何氨基酸或val；
[0294]
xaa
11
是任何氨基酸或ala；
[0295]
xaa
13
是任何氨基酸或thr；
[0296]
xaa
14
是任何氨基酸或gly；
[0297]
xaa
15
是cys；
[0298]
xaa
16
是任何氨基酸、leu，或丢失。
[0299]
在一些实施方案中，式iii的gc-c激动剂肽在xaa9之后不被胰凝乳蛋白酶裂解，并且定义如下：
[0300]
xaa1是ser、asn、tyr、ala、gln、pro、lys、gly或thr，或丢失；
[0301]
xaa2是his、asp、glu、ala、ser、asn或gly，或丢失；
[0302]
xaa3是thr、asp、ser、glu、pro、val或leu，或丢失；
[0303]
xaa5是asp、ile或glu；
[0304]
xaa6是ile、trp或leu；
[0305]
xaa7是cys、ser或tyr；
[0306]
xaa8是ala、val、thr、ile或met，或丢失；
[0307]
xaa9是：a)除phe和tyr之外的任何氨基酸；b)除phe、tyr以及trp之外的任何氨基酸；c)除phe、tyr、trp、ile、leu以及val之外的任何氨基酸；d)除phe、tyr、trp、ile、leu、val以及his之外的任何氨基酸；d)任何非芳香族氨基酸；或e)丢失；
[0308]
xaa
10
是ala、val、met、thr或ile；
[0309]
xaa
11
是ala或val；
[0310]
xaa
13
是ala或thr；
[0311]
xaa
14
是gly、ala或ser；
[0312]
xaa
15
是cys、tyr，或丢失；并且
[0313]
xaa
16
是：a)trp、tyr或phe以形成胰凝乳蛋白酶裂解位点；b)lys或arg以形成胰蛋白酶裂解位点；c)丢失；或d)his或leu或ser。
[0314]
在特定实施方案中，人类尿鸟苷素肽或类似物包含以下所示的氨基酸序列(iv)、由其组成或基本上由其组成：
[0315]
asn
1 xaa
2 xaa
3 xaa
4 glu
5 leu
6 xaa
7 val
8 asn
9 xaa
10 xaa
11 xaa
12 thr
13 xaa
14 xaa
15 leu
16
(seq id no：670)
[0316]
其中，xaa2是asp或glu；
[0317]
xaa3是asp或glu；
[0318]
xaa4是cys或mpt(巯基脯氨酸)或pen(青霉胺)或dpr(二氨基丙酸)或asp或glu；
[0319]
xaa7是cys或mpt(巯基脯氨酸)或pen(青霉胺)或dpr(二氨基丙酸)或asp或glu；
[0320]
xaa
10
是val或pro；
[0321]
xaa
11
是ala或aib(α-氨基异丁酸)；
[0322]
xaa
12
是cys或mpt(巯基脯氨酸)或pen(青霉胺)或dpr(二氨基丙酸)或asp或glu；
[0323]
xaa
14
是gly或ala；并且
[0324]
xaa
15
是cys或mpt(巯基脯氨酸)或pen(青霉胺)或dpr(二氨基丙酸)或asp或glu。
[0325]
在式iv的某些实施方案中，xaa
15
不同于cys或丢失，xaa7是ser或除cys之外的氨基酸。
[0326]
在某些实施方案中，xaa1、xaa2、xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9、xaa
10
、xaa
11
、xaa
13
、xaa
14
以及xaa
16
中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个是除cys之外的任何氨基酸。在一些实施方案中，xaa9是除gln之外的任何氨基酸。在xaa2和xaa3是glu的实施方案中，xaa9是除gln之外的任何氨基酸。在某些实施方案中，xaa1和xaa2丢失；xaa3是thr；xaa5是glu；xaa6是ile或leu；xaa8是ala、val或ile；xaa9是phe或tyr；xaa
10
是ala或val；xaa
11
是ala；xaa
13
是ala或thr；xaa
14
是gly；并且xaa
16
是trp、tyr、phe、lys或arg，或丢失。
[0327]
人类尿鸟苷素类似物的特定实例提供于下表a7中。
[0328]
[0329]
[0330][0331]
还包括本文所描述的gc-c激动剂肽的变体。实例包括相对于式i、ii、iii或iv中的任一者、或seq id no.1、5、46-50、650以及670、或表a1-a7中的任一者中的序列包含约、至少约或不多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代、插入和/或缺失的变体肽。取代可以是保守的或非保守的。保守氨基酸取代的一个实例是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括如下氨基酸：其具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守取代可以用天然存在的氨基酸取代非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物。插入和/或缺失可以在肽的n端、c端和/或内部区(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的插入或缺失在c端、n端，和/或在n端和/或c端的约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内)。在一些情况下，可能需要使用结合至并且激动肠gc-c受体，但比非变体形式的肽活性更小的变体肽。这种减小的活性可以由对受体的亲和力降低或在结合时活化受体的能力降低或肽的稳定性降低而引起。
[0332]
gc-c激动剂肽可以是环状肽或线性肽。另外，可以将相同肽的多个拷贝并入单个
环状或线性肽中。环状肽可以通过本领域中已知的方法制备。举例来说，大环化通常通过在肽的n端与c端之间、在侧链与n端或c端之间[例如，在ph约8.5下使用k3fe(cn)6](samson等，endocrinology，137：5182-5185，1996)、或在两个氨基酸侧链(诸如半胱氨酸)之间(degrado，adv protein chem，39：51-124，1988)形成酰胺键来实现。
[0333]
肽可以包括天然存在于脊椎动物(例如，哺乳动物)物种中或细菌物种中的肽的氨基酸序列。另外，肽可以是部分或完全非天然存在的肽。
[0334]
还包括对应于本文所描述的gc-c激动剂肽的肽类似物。肽类似物通常在医药工业中用作非肽药物，其具有类似于模板肽的那些性质的性质。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽”(luthman等，a textbook of drug design and development，14：386-406，第2版，harwood academic publishers，1996；joachim grante，angew.chem.int.ed.engl.，33：1699-1720，1994；fauchere，j.，adv.drug res.，15：29(1986)；veber和freidinger tins，第392页(1985)；以及evans等，j.med.chem.30：229，1987)。拟肽是模拟肽的生物活性，但在化学性质上不再是肽的分子。拟肽化合物在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利号6,245,886中。
[0335]
本发明还包括类肽。肽的类肽衍生物代表另一种形式的修饰肽，其保留生物活性的重要结构决定簇，而消除肽键，从而赋予对蛋白水解的抗性(参看例如simon等，pnas usa.89：9367-9371，1992)。类肽是n-取代甘氨酸的寡聚物。已经描述了许多n-烷基，其各自对应于天然氨基酸的侧链。本发明的类肽包括至少一个氨基酸、几个氨基酸或所有氨基酸残基被对应的n-取代甘氨酸置换的化合物。类肽文库描述于例如美国专利号5,811,387中。
[0336]
在一些方面，gc-c激动剂肽包含以下或由以下组成：约、至少约或小于约150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、8、7、6或5个氨基酸。在一些方面，肽包含不多于5个在(式i或ii的)cys6的n端的氨基酸。在一些方面，肽包含不多于20、15、10或5个在(式i或ii的)cys
18
的c端的氨基酸。
[0337]
在一些方面，肽经过纯化。将纯化的肽与其它蛋白质、脂质以及核酸分离，或与合成或以其它方式制备的化合物分离。纯化的肽可以构成纯化的制剂干重的至少约50、60、70、80、85、90、95、96、97或98％。
[0338]
如上文所提到，本文所描述的某些肽可以包括一个或多个或所有非天然氨基酸或氨基酸类似物。进一步关于本文别处所描述的那些(例如，同上)，实例包括：酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤基、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯(borate、boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；具有光可活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一个分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼获和/或光可异构化氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮基的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸(例如，含有氘、氚、
13
c、
15
n或
18
o的氨基酸)；化学可裂解或光可裂解氨基酸；具有伸长的侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如，糖取代的丝氨酸等等；碳连接的含糖氨基酸；氧化
还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α，α二取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸之外的环状氨基酸；o-甲基-l-酪氨酸；l-3-(2-萘基)丙氨酸；3-甲基-苯丙氨酸；对乙酰基-l-苯丙氨酸；0-4-烯丙基-l-酪氨酸；4-丙基-l-酪氨酸；三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸；l-dopa；氟化苯丙氨酸；异丙基-l-苯丙氨酸；对叠氮基-l-苯丙氨酸；对酰基-l-苯丙氨酸；对苯甲酰基-l-苯丙氨酸；l-磷酸丝氨酸；膦酰基丝氨酸；膦酰基酪氨酸；对碘-苯丙氨酸；4-氟苯基甘氨酸；对溴苯丙氨酸；对氨基-l-苯丙氨酸；异丙基-l-苯丙氨酸；l-3-(2-萘基)丙氨酸；含氨基、异丙基或o-烯丙基的苯丙氨酸类似物；dopa，o-甲基-l-酪氨酸；糖基化氨基酸；对(炔丙氧基)苯丙氨酸；二甲基-赖氨酸；羟基-脯氨酸；巯基丙酸；甲基-赖氨酸；3-硝基-酪氨酸；正亮氨酸；焦谷氨酸；z(苯甲氧羰基)；ε-乙酰基-赖氨酸；β-丙氨酸；氨基苯甲酰基衍生物；氨基丁酸(abu)；瓜氨酸；氨基己酸；氨基异丁酸；环己基丙氨酸；d-环己基丙氨酸；羟基脯氨酸；硝基-精氨酸；硝基-苯丙氨酸；硝基-酪氨酸；正缬氨酸；八氢吲哚羧酸酯；鸟氨酸；青霉胺；四氢异喹啉；乙酰胺基甲基保护的氨基酸；以及聚乙二醇化氨基酸。非天然氨基酸和氨基酸类似物的其它实例可以在美国申请号2003/0108885和2003/0082575以及其中所引用的参考文献中找到。
[0339]
在一些实施方案中，氨基酸可以被天然存在的非必需氨基酸，例如牛磺酸置换。
[0340]
在一些实施方案中，1、2、3、4、5或6个半胱氨酸缺失或被不同氨基酸置换。在特定方面，最n端和/或c端半胱氨酸残基缺失或被不同氨基酸置换。在某些实施方案中，不同氨基酸是丙氨酸或丝氨酸。
[0341]
肽可以是l-氨基酸、d-氨基酸或其组合的聚合物。举例来说，在某些实施方案中，肽是d逆反肽。术语“逆反异构体”指的是序列的方向逆转并且每个氨基酸残基的手性反转的线性肽的异构体。参看例如jameson等，nature.368：744-746，1994；brady等，nature.368：692-693，1994。组合d-对映体与反向合成的净结果是每个酰胺键中的羰基和氨基的位置交换，而在每个α碳处的侧链基团的位置保留。除非另有特别规定，否则本发明的任何给定的l-氨基酸序列可以通过合成对应的原生l-氨基酸序列的反向序列而制成d逆反肽。
[0342]
制造含有非天然氨基酸的肽的方法可以例如在美国申请号2003/0108885和2003/0082575；deiters等，j am chem.soc.125：11782-3，2003；chin等，science.301：964-7，2003以及其中所引用的参考文献中找到。
[0343]
在一些方面，gc-c激动剂肽可以具有一个或多个被替代键置换的常规肽键。这类置换可以增加肽的稳定性。举例来说，用替代键置换(式i或ii的)cys
18
与xaa
19
之间的肽键可以减少被羧基肽酶裂解并且可以增加在消化道中的半衰期。可以置换肽键的键包括(但不限于)：逆反键(c(o)-nh替代nh-c(o))；还原酰胺键(nh-ch2)；硫代亚甲基键(s-ch2或ch
2-s)；氧代亚甲基键(o-ch2或ch
2-o)；亚乙基键(ch
2-ch2)；硫代酰胺键(c(s)-nh)；反式烯烃键(ch＝ch)；氟取代的反式烯烃键(cf＝ch)；酮基亚甲基键(c(o)-chr或chr-c(o)，其中r是h或ch3)；以及氟-酮基亚甲基键(c(o)-cfr或cfr-c(o)，其中r是h或f或ch3)。
[0344]
在一些gc-c激动剂肽中，通常形成二硫键的一对或多对cys残基中的一个或两个成员被以下置换：高半胱氨酸、青霉胺、3-巯基脯氨酸(参看例如kolodziej等，int j pept protein res.48：274，1996)；β，β二甲基半胱氨酸(参看例如hunt等，int j pept protein res.42：249，1993)；或二氨基丙酸(参看例如smith等，j med chem.21：117，1978)，以在正
常二硫键的位置处形成替代性内部交联。
[0345]
在一些实施方案中，一个或多个二硫键可以被替代性共价交联置换，例如，酰胺键联(-ch2ch(o)nhch
2-或-ch2nhch(o)ch
2-)、酯键联、硫酯键联、内酰胺桥、氨甲酰基键联、脲键联、硫脲键联、膦酸酯键联、烷基键联(-ch2ch2ch2ch
2-)、烯基键联(-ch2ch＝chch
2-)、醚键联(-ch2ch2och
2-或-ch2och2ch
2-)、硫醚键联(-ch2ch2sch
2-或-ch2sch2ch
2-)、胺键联(-ch2ch2nhch
2-或-ch2nhch2ch
2-)或硫代酰胺键联(-ch2ch(s)hnhch
2-或-ch2nhch(s)ch
2-)。举例来说，ledu等(pnas.100：11263-78，2003)描述了制备内酰胺和酰胺交联的方法。schafmeister等(j.am.chem.soc.122：5891，2000)描述了稳定的烃交联。烃交联可以经由复分解(或在饱和烃交联的情况下复分解继之以氢化)使用格拉布催化剂(grubbs catalyst)中的一者或另一者(可获自materia，inc.和sigma-aldrich并且描述于例如美国专利号5,831,108和6,111,121中)来产生。在一些情况下，这类替代性交联的产生需要用诸如lys或glu或非天然存在的氨基酸的其它残基置换cys残基。另外，内酰胺、酰胺以及烃交联可以用于稳定肽，即使其连接在除了cys占据的那些位置之外的位置处的氨基酸。这类交联可以例如在由两个氨基酸隔开的两个氨基酸之间或在由六个氨基酸隔开的两个氨基酸之间发生(参看例如schafmeister等，j.am.chem.soc.122：5891，2000)。
[0346]
可以使用标准修饰对gc-c激动剂肽进行修饰。修饰可以在氨基(n-)、羧基(c-)端、内部或前述任一者的组合处发生。在一些方面，可以存在多于一种类型的肽修饰。修饰包括(但不限于)：乙酰化、酰胺化、生物素化、肉桂酰化、法尼基化、甲酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、磷酸化(ser、tyr或thr)、硬脂酰化、琥珀酰化、硫酰化和环化(经由二硫桥或酰胺环化)，以及由cy3或cy5修饰。本发明的肽还可以由以下修饰：2，4-二硝基苯基(dnp)、dnp-赖氨酸、由7-氨基-4-甲基-香豆素(amc)修饰、荧光素、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、对硝基-苯胺、若丹明b(rhodamine b)、edans(5-((2-氨乙基)氨基)萘-1-磺酸)、4-(4-二甲氨基苯基)偶氮苯甲酸(dabcyl)、二甲氨基偶氮苯甲酰(dabsyl)、丹磺酰(dansyl)、德克萨斯红(texas red)、fmoc以及tamra(四甲基若丹明(tetramethylrhodamine))。本发明的肽还可以偶联至例如聚乙二醇(peg)；烷基(例如，c1-c20直链或支链烷基)；脂肪酸基团；peg、烷基以及脂肪酸基团的组合(参看美国专利号6,309,633；soltero等，innovations in pharmaceutical technology.106-110，2001)；bsa和klh(钥孔虫戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin))。举例来说，在某些实施方案中，n端氨基酸、c端氨基酸或两者偶联至peg分子。
[0347]
在某些实施方案中，本文所描述的gc-c激动剂肽可以与平衡离子一起存在。例示性平衡离子包括以下盐：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、依地酸钙(calcium edetate)、右旋樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐(edetate，edta)、乙二磺酸盐(edisylate)、双羟萘酸盐(embonate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐、碘化物、溴化物、氯化物、羟萘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、依托酸盐(estolate)、马来酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、泛酸盐、磷酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(theoclate)、乙酰胺基苯甲酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、氨基水杨酸盐、脱水亚甲基柠檬酸盐(anhydromethylenecitrate)、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、樟脑酸盐、癸酸盐、己酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、环己氨基磺酸盐(cyclamate)、二氯乙
酸盐、甲酸盐、龙胆酸盐、葡糖醛酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、马尿酸盐、氟化物、丙二酸盐、萘二磺酸盐、烟酸盐、油酸盐、乳清酸盐、草酸盐、酮戊二酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、果胶酸盐聚合物、苯乙基巴比妥酸盐、苦味酸盐、丙酸盐、吡酮酸盐(pidolate)、癸二酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐以及丹宁酸盐。
[0348]
可以根据多种技术产生gc-c激动剂肽。举例来说，可以在包括(但不限于)大肠杆菌的细菌中或在用于肽或蛋白质产生的其它系统(例如，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、使用果蝇(drosophila)sf9细胞的杆状病毒表达系统、酵母或丝状真菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统)中产生肽，或其可以化学合成。如果将要在细菌，例如大肠杆菌中产生肽或变体肽，那么编码肽的核酸分子可以任选地编码允许成熟肽从细胞中分泌的前导序列。因此，编码肽的序列可以包括例如天然存在的细菌st肽的前序列和原序列。可以从培养基纯化分泌的成熟肽。
[0349]
在一些情况下，将编码本发明肽的序列插入能够递送并维持细菌细胞中的核酸分子的载体中。可以将dna分子插入自主复制载体中(适合的载体包括例如pgem3z和pcdna3，以及其衍生物)。载体核酸可以是细菌或噬菌体dna，诸如噬菌体λ或m13和其衍生物。含有本文所描述的核酸的载体的构建可以继之以诸如细菌的宿主细胞的转化。适合的细菌宿主包括(但不限于)大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、假单胞菌(pseudomonas)、沙门氏菌(salmonella)。除了编码核酸分子以外，基因构建体还可以包括允许表达的元件，诸如启动子和调控序列。表达载体可以含有控制转录起始的转录控制序列，诸如启动子、增强子、操纵子以及抑制子序列。多种转录控制序列为本领域的技术人员所熟知。表达载体还可以包括翻译调控序列(例如，非翻译5
′
序列、非翻译3
′
序列或内部核糖体进入位点)。载体可以能够自主复制或其可以整合至宿主dna中以确保肽产生期间的稳定性。在一些实施方案中，美国专利号5,395,490中所描述的载体、表达系统以及方法可以用于产生本文所描述的gc-c激动剂肽。
[0350]
包括本发明肽的蛋白质编码序列还可以融合至编码多肽亲和标签的核酸以促进纯化，这种标签如谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖e结合蛋白、蛋白质a、flag标签、六聚组氨酸、myc标签或流感ha标签。亲和标签或报道体融合将所关注的肽的阅读框架连接至编码亲和标签的基因的阅读框架以便产生翻译融合。融合基因的表达得以翻译包括所关注的肽与亲和标签的单个多肽。在利用亲和标签的一些情况下，编码蛋白酶识别位点的dna序列将在亲和标签与所关注的肽的阅读框架之间融合。
[0351]
适合于在除细菌之外的蛋白质表达系统中产生本发明的不成熟和成熟形式的肽和变体并且为本领域的技术人员所熟知的基因构建体和方法也可以用于在生物系统中产生肽。
[0352]
可以通过固相化学合成来合成肽和其变体。举例来说，可以在cyc(4-ch2bxl)-och
2-4-(氧甲基)-苯基乙酰胺基甲基树脂上使用双偶合程序合成肽。必须适当地使用保护基以形成正确的二硫键模式。举例来说，可以使用以下保护基：叔丁氧羰基(α-氨基)；乙酰胺基甲基(cys残基b和e的硫醇基)；4-甲基苯甲基(cys残基c和f的硫醇基)；苯甲基(谷氨酸的y-羧基和苏氨酸的羟基，如果存在的话)；以及溴苯甲基(酪氨酸的酚基，如果存在的话)。使用叔丁氧羰基氨基酸的对称酸酐或羟基苯并三唑酯(对于天冬酰胺或谷氨酰胺残基)实现偶合，并且使肽脱保护并且在0℃下在氟化氢、二甲基硫、苯甲醚以及对甲苯硫酚中使用
8/1/1/0.5的比率(v/v/v/w)从固体支撑物裂解持续60分钟。通过减压去除氟化氢和二甲基硫以及通过用乙醚和乙酸乙酯依序萃取去除苯甲醚和对甲苯硫酚之后，用0.5m磷酸钠缓冲液(ph 8.0)与n，n-二甲基甲酰胺的混合物使用1/1的比率(v/v)萃取粗肽。使用二甲亚砜形成cys残基b和e的二硫键(tam等，j.am.chem.soc.113：6657-62，1991)。可以通过反相色谱纯化所得肽。通过首先将肽溶解于含50％乙酸的水中来形成cys残基c与f之间的二硫键。添加含饱和碘溶液的冰醋酸(1ml碘溶液/100ml溶液)。在室温下在封闭的玻璃容器中孵育2天后，用去离子水五倍稀释溶液并且用乙醚萃取四次以去除未反应的碘。通过旋转蒸发去除残余量的乙醚之后，冻干粗产物的溶液并且通过连续的反相色谱纯化。
[0353]
肽也可以通过许多其它方法合成，包括使用传统fmoc保护的固相合成(即，与dcc-hobt偶合并且用含哌啶的dmf脱保护)。cys硫醇基可以用三苯甲基保护。用tfa处理可以用于肽的最终脱保护和肽从固相树脂的释放。在许多情况下，空气氧化足以达成适当的二硫键形成。
[0354]
举例来说，可以在诸如肠gc-c受体结合试验的试验中测试肽和其它试剂结合和/或激动肠gc-c受体的能力。在一个实例中，在24孔培养板中使用补充有5％胎牛血清的汉姆氏f12培养基(ham
′
s f12 medium)与达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco
′
s modified eagle
′
s medium，dmem)的1∶1混合物使t84人结肠癌细胞系的细胞(美国菌种保藏中心(american type culture collection)(bethesda，md.))生长至汇合。试验中所用的细胞任选地介于54至60代之间。简单地说，用1ml结合缓冲液(含有0.05％牛血清白蛋白和25mm hepes(ph 7.2)的dmem)洗涤24孔板中的t84细胞单层两次，然后在37℃下在成熟的放射性标记的大肠杆菌st肽和各种浓度的测试物质存在下孵育30分钟。然后用1ml dmem洗涤细胞四次并且用0.5毫升/孔的1n naoh溶解。使用标准方法测定溶解物质的放射性水平。
[0355]
gc-c激动剂肽的额外实例描述于例如美国专利号7,041,786、7,304,036、7,371,727、7,494,979、7,704,947、7,799,897、7,745,409、7,772,188、7,879,802、7,910,546、8,034,782、8,080,526、8,101,579、8,114,831、8,110,553、8,357,775以及8,367,800；美国申请号2013/0096071、2013/0190238、2012/0040892、2012/0040025、2012/0213846、2012/0289460、2011/0118184、2010/0152118、2010/0048489、2010/0120694、2010/0261877、2009/0253634、2009/0192083、2009/0305993；以及pct公布号wo 2006/086653和wo 2002/098912中，其各自以全文引用的方式并入。
[0356]
d.可溶性鸟苷酸环化酶激动剂
[0357]
在某些实施方案中，化合物是可溶性鸟苷酸环化酶(sgc)激动剂。鸟嘌呤核苷酰(鸟苷酰；鸟苷酸)环化酶(gc)是广泛分布的信号转导酶，其响应各种细胞刺激使gtp转化成第二信使环状gmp(cgmp)。存在膜相关与可溶性鸟苷酸环化酶，两者都可以增加cgmp的细胞内浓度。
[0358]
在肠的肠上皮细胞中，增加的cgmp产生抑制肠na /h 交换活性，使得肠粘膜碱化。参看例如fawcus等，comp biochem.physiol a physiol.118：291-295，1997。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，可溶性鸟苷酸环化酶活化剂抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取，增加cgmp产生并且从而增加肠粘膜的碱化。
[0359]
sgc激动剂的一般实例包括血红素依赖性和血红素非依赖性活化剂。参看例如evgenov等，nat.rev.drug discov.5：755-768，2006。根据一种非限制性理论，这些和其它
sgc活化剂可以用于选择性地活化肠中的sgc，增加cgmp的浓度，并且从而抑制如本文所描述的磷酸盐摄取。
[0360]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，sgc激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0361]
sgc激动剂的非限制性实例包括bay 41-2271、bay 58-2667以及图9a-9l中所示的化合物。例示性sgc激动剂的额外结构连同其合成方法一起在美国专利号7,087,644和pct公布号wo 2013/101830中公开，这些文献各自以全文引用的方式并入。
[0362]
e.腺苷酸环化酶激动剂
[0363]
在某些实施方案中，化合物是腺苷酸环化酶激动剂，任选地选择性激动剂。腺苷酸环化酶(或腺苷酰环化酶)指的是一类酶，其催化atp转化成3
′
，5
′‑
环状amp(camp)和焦磷酸盐。二价阳离子(例如，mg)通常涉及于这种酶促活性中。由腺苷酸环化酶产生的camp经由特异性camp结合蛋白，包括转录因子或其它酶(例如，camp依赖性激酶)充当调控信号。
[0364]
腺苷酰环化酶是最广泛利用的信号转导路径之一的效应分子。其产物，camp，调节从细菌至高等真核生物的生物体中的细胞生长和分化。在动物中，存在跨膜腺苷酰环化酶(tmac)和可溶性腺苷酸环化酶(sac)。参看例如tresguerres等，kidney int.79：1277-1288，2011。不同于tmac，sac不是跨膜蛋白并且发现分布于整个细胞质中和特定细胞器中，在这些细胞器中据信sac是介导camp的细胞内功能的第二信使的来源。参看例如buck和levin，sensors.(basel)11：2112-2128，2011。因此，tmac由将细胞外信号转导成细胞内camp变化的g蛋白直接调节。相比之下，sac同种型由包括碳酸氢盐、钙以及atp的细胞内信号调控。
[0365]
囊性纤维化跨膜调控子(cftr)是在多个组织的上皮处发挥功能的氯化物和碳酸氢盐离子通道。这个通道已经显示复杂小肠中的hco
3-分泌，在小肠中所述碳酸氢盐决定粘膜表面上的ph。参看例如kunzelmann和mall，physiol rev.82：245-289，2002。cftr由camp调控：camp依赖性蛋白激酶a(pka)对cftr调控域的磷酸化增加其活性。这个离子通道的选择性活化因此可以使得腔膜碱化并且从而降低或减小cepg。根据一种非限制性理论，肠道中tmac的选择性刺激因此应增加细胞内camp，刺激pka，增加cftr活性并且从而经由cepg效应抑制pi的摄取。在特定方面，化合物选择性地活化tmac，例如，相对于sac。
[0366]
诸如佛司可林的腺苷酸环化酶激动剂已经显示增加camp介导的十二指肠碳酸氢盐分泌(而不会增加胃碳酸氢盐分泌)，任选地经由cftr的信号传导。参看例如takeuchi等，am.j.physiol.272(3 pt 1)：g646-53，1997。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，腺苷酸环化酶激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0367]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，腺苷酸环化酶激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0368]
在特定实施方案中，化合物是腺苷酸环化酶iii(ac-iii)的激动剂，任选地ac-iii同种型adcy1、adcy2、adcy3、adcy4、adcy5、adcy6、adcy7、adcy8、adcy9和/或adcy10中的一者或多者的激动剂。
[0369]
腺苷酸环化酶激动剂的特定实例包括半日花烷型二萜，诸如佛司可林和其类似物/衍生物，包括水溶性佛司可林类似物，诸如考福辛(nkh477)。佛司可林是从植物中分离
1559，1997。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在一些方面，咪唑啉-1受体激动剂通过增加dbs来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0375]
根据另一种非限制性理论，诸如莫索尼定的咪唑啉-1受体激动剂也已经显示减少胃肠道中的酸分泌。参看例如glavin和smyth，br j pharmacol.114：751-4，1995。因此，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，咪唑啉-1受体激动剂通过抑制或减少胃肠道(例如，小肠)中的酸分泌来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。在特定方面，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，咪唑啉-1受体激动剂通过增加dbs并且减少小肠中的酸分泌来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0376]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，咪唑啉-2受体激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0377]
咪唑啉-1受体激动剂的非限制性实例包括胍丁胺(agmatine)、阿可乐定(apraclonidine)、可乐定、依法克生(efaroxan)、莫索尼定、利美尼定(rilmenidine)、s-23515、s-23757、lnp-509、lnp-911、lnp-509、s-23515、pms-812、pms-847、bu-98008以及tvp1022(雷沙吉兰(rasagiline)的s-对映体)。还参看head和mayorov，cardiovasc hematol agents med chem.4：17-32，2006，其以全文引用的方式并入。
[0378]
例示性咪唑啉受体激动剂的结构示于图11中，并且连同其合成方法一起在美国专利号4,323,570、5,686,477、3,988,464、6,300,366、5,492,912、5,492,912以及pct公布号wo200141764中进一步公开，这些文献各自以全文引用的方式并入。
[0379]
咪唑啉受体激动剂的额外实例包括美国专利号7,309,706、美国专利号5,686,477(ep 710，658)、美国专利号5,925,665(ep 846，688)、wo 2001/41764以及wo 2000/02878中所描述的那些。美国专利号5,686,477中所描述的5-(芳氧基甲基)-恶唑啉衍生物的特征为对咪唑啉-1受体的选择性亲和力。美国专利号5,925,665中所描述的咪唑啉衍生物结合至咪唑啉受体，而不会显著地结合至肾上腺素能受体。wo 2001/41764描述了对咪唑啉受体具有亲和力的异喹啉和喹啉衍生物。wo 2000/02878描述了作为咪唑啉受体的潜在配体的例示性β-咔啉衍生物。这些参考文献以全文引用的方式并入。
[0380]
g.胆碱能激动剂
[0381]
在某些实施方案中，化合物是胆碱能激动剂，任选地选择性胆碱能激动剂。胆碱能激动剂的实例包括间接胆碱能激动剂，其刺激乙酰胆碱的产生或释放(例如，乙酰胆碱酯酶抑制剂)；和直接胆碱能激动剂，其结合至并刺激一个或多个乙酰胆碱受体。神经递质乙酰胆碱(2-乙酰氧基-n，n，n-三甲基乙铵)是乙酸与胆碱的酯。乙酰胆碱受体的一般实例包括烟碱乙酰胆碱受体和毒蕈碱乙酰胆碱受体。烟碱乙酰胆碱受体是由五个蛋白质亚单位组成的配体门控离子通道。
[0382]
毒蕈碱乙酰胆碱受体(即，m1、m2、m3、m4以及m5)是经由第二信使级联活化其它离子通道的g蛋白偶合受体。这些受体在包括胃和肠中的唾液腺以及平滑肌和粘膜细胞的消化道中表达。在某些实施方案中，化合物是毒蕈碱受体亚型的泛激动剂。全部五种毒蕈碱受体亚型的内源激动剂是乙酰胆碱，其通过激素与神经元机制发挥生理控制。参看例如eglen，ann.n.y.acad.sci.881：35-53，2012。几种天然存在的化合物也调节毒蕈碱受体(参看图12)，包括激动剂，诸如毒蕈碱(来自蘑菇毒蝇伞(aminita muscaria)的毒素并且受体家族由此得出其名称)和毛果芸香碱(pilocarpine)；以及拮抗剂，诸如阿托品或(-)-东莨
菪碱(来自茄科植物家族)。当体内施用时，毒蕈碱激动剂引起唾液分泌，而毒蕈碱拮抗剂导致口干。
[0383]
在一些实施方案中，化合物是m3毒蕈碱受体的相对选择性激动剂。m3的分泌反应在生理上受乙酰胆碱(ach)刺激。具体地说，ach结合至g蛋白连接的m3毒蕈碱ach受体，其使得磷脂酶c产生肌醇1，4，5-三磷酸盐(inp3)。inp3结合至并开放内质网上的inp3受体，根据一种非限制性理论，其释放ca
2
。增加的[ca
2
]i活化顶端膜cl-通道和基底外侧k 通道。cl-外流至腺泡腔中牵引na 跨越细胞，并且渗透梯度产生流体分泌物。参看例如tobin等，j.physiol pharmacol.60：3-21，2009。这种流体富含碳酸氢盐。
[0384]
已经反复证实碳酸氢盐分泌的毒蕈碱受体控制：血管内或皮下施用的毒蕈碱激动剂增加碳酸氢盐释放至肠腔中，这是受毒蕈碱拮抗剂阻断的反应。举例来说，根据一种非限制性理论，诸如乌拉胆碱(bethanechol)(毒蕈碱受体选择性激动剂)、碳酰胆碱(carbachol)(毒蕈碱和烟碱乙酰胆碱受体激动剂)以及mcn-a-343(m1受体选择性激动剂)的胆碱能激动剂已经显示增加十二指肠碳酸氢盐分泌。参看例如等，am j physiol.267(1 pt 1)：g10-7，1994。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，胆碱能激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0385]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，胆碱能激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0386]
在一些方面，毒蕈碱受体激动剂关于内源配体乙酰胆碱具有构象受限的结构，诸如图12中的顺式-三甲基-(2-甲基-[1，3]二氧杂环戊烷-4-基甲基)碘化铵结构。参看例如piergentili等，bioorganic & medicinal chemistry 15：886-896，2007。这个结构含有替代乙酰胆碱的不稳定酯的缩酮，其为保留ach的两个氢键接受体，但稳定得多的生物电子等排体。类似地，碳酰胆碱和乌拉胆碱(也示于图12中)是激动剂的实例，因为这些结构用不可水解的氨基甲酸酯官能团置换ach的不稳定酯基。
[0387]
间接作用的胆碱能激动剂的非限制性实例包括乙酰胆碱酯酶抑制剂，诸如氨基甲酸酯(例如，毒扁豆碱(physostigmine)、新斯的明(neostigmine)、吡啶斯的明(pyridostigmine))、哌啶(例如，多奈哌齐(donepizil))、腾喜龙(edrophonium)、石杉碱a(huperzine a)、拉多替吉(ladostigil)、恩其明(ungeremine)、山莴苣苦素(lactucopicrin)、他克林(tacrine)、加兰他敏(galantamine)、反式-δ-9-四氢大麻酚，以及磷酸盐(例如，异氟磷(isoflurophate)、二乙氧磷酰硫胆碱(echothiophate)、对硫磷(parathion)、马拉硫磷(malathion))。优选地，本文所提供的方法将采用可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0388]
直接作用的胆碱能激动剂的非限制性实例包括乙酰胆碱、烟碱、琥珀酰胆碱、醋甲胆碱(methacholine)(乙酰基-β-甲基胆碱)、mcn-a-343、碳酰胆碱(氨甲酰胆碱)、乌拉胆碱(氨甲酰基-β-甲基胆碱)、毒蕈碱、毛果芸香碱、氧化震颤素(oxotremorine)、山梗菜碱(lobeline)以及二甲基苯基哌嗪盐。
[0389]
h.前列腺素ep4受体激动剂
[0390]
在某些实施方案中，化合物是e型前列腺素类受体4(ep4)激动剂(或前列腺素ep4受体激动剂)，任选地选择性激动剂。ep4受体最初被描述为促使腺苷酸环化酶受刺激和细胞内camp水平升高的g
αs
蛋白偶合受体。当首次克隆成刺激camp形成的前列腺素e2(pge2)受
体时，ep4受体被指定为“ep2”。然而，在已经发现对布他前列素(butaprost)敏感的另一个刺激camp的pge2受体之后，介导血管舒张的布他前列素非敏感性受体再命名为“ep4”。其为针对pge2所鉴别的四个受体之一。
[0391]
根据一种非限制性理论，前列腺素ep4受体激动剂已经显示刺激十二指肠碳酸氢盐分泌，例如，通过由camp介导的机制。参看例如aoi等，am j physiol gastrointest liver physiol.287：g96-103，2004；lundgren，acta physiol scand.185：87，2005；takeuchi等，gastroenterology.113：1553-1559，1997。因此，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，前列腺素ep4受体激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0392]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，ep4激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0393]
前列腺素ep4受体激动剂的非限制性实例包括pge2、pge2类似物、ae1-329、agn205203、aps-999na、cay10598(19a)、cp-044519-02、cj-023，423、ep4rag、er-819762、l-902688、鲁比前列酮(lubiprostone)、ono-4819cd、ono ae1-329、ono ae1-734、pge
1-oh、tcs2510、γ-内酰胺pge类似物3、11-脱氧-pge1、γ-内酰胺pge类似物2a、γ-内酰胺pge类似物4。参看例如konya等，pharmacol ther.138：485-502，2013。
[0394]
pge2类似物的非限制性实例包括16，16-二甲基pge2、16-16二甲基pge2对(对乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16，16-二甲基pge2、9-脱氧-9-亚甲基-16、16-二甲基pge2、9-脱氧-9-亚甲基pge2、9-酮基氟前列醇(9-keto fluprostenol)、5-反式pge2、17-苯基-ω-三去甲pge2、pge2丝氨醇酰胺、pge2甲酯、16-苯基四去甲pge2、15(s)-15-甲基pge2、15(r)-15-甲基pge2、8-异-15-酮基pge2、8-异pge2异丙酯、20-羟基pge2、11-脱氧pgei、诺氯前列素(nocloprost)、硫前列酮(sulprostone)、布他前列素、15-酮基pge2以及19(r)羟基pge2。参看例如美国申请号2012/0202288。
[0395]
前列腺素ep4受体激动剂的额外实例包括美国申请号2001/0056060、2002/0040149、2005/0164949以及2011/0098481中所描述的那些。还包括以下文献中所描述的前列腺素ep4受体激动剂(连同相关合成方法一起)：美国专利号4,219,479、4,049,582、4,423,067、4,474,802、4,692,464、4,708,963、5,010,065、5,013,758、6,747,037以及7,776,896；欧洲专利号ep0084856；加拿大专利号1248525；美国申请号2004/0102499、2005/049227、2005/228185、2006/106088、2006/111430、2007/0010495、2007/0123568、2007/0123569、2005/0020686、2008/0234337、2010/0010222、2010/0216689、2004/0198701、2004/0204590、2005/0227969、2005/0239872、2006/0154899、2006/0167081、2006/0258726、2006/0270721、2009/0105234、2009/0105321、2009/0247596、2009/0258918、2009/0270395、2004/0087624、2004/0102508、2006/0252799、2009/0030061、2009/0170931、2010/0022650、2009/0312388、2009/0318523、2010/0069457、2010/0076048、2007/0066618、2004/0259921、2005/0065133以及2007/0191319；以及pct公布号wo 2004/4071428、wo 2006/052630、wo 2006/047476、wo 2006/058080、wo 2004/065365、wo 2003/047513、wo 2004/085421、wo 2004/085430、wo 2005/116010、wo 2005/116010、wo 2007/014454、wo 2006/080323以及wo 2006/137472，其各自以全文引用的方式并入。
[0396]
ep4受体激动剂的特定实例示于图13中。
journal of medicinalchemistry，第2011卷，文章id 424535，第8页，2011.doi：10.1155/2011/424535；salmi等，cns drug rev.10：230-42，2004；bourne，cns drug rev.7：399-414，2001。此外，可以使用本领域中已知的标准筛选方法来鉴别d1受体激动剂。作为一个非限制性实例，用于多巴胺d1受体激动剂的高通量药物筛选的基于细胞的功能试验描述于jiang等，acta pharmacol sin.26：1181-6，2005中。这些参考文献以全文引用的方式并入。
[0405]
如上文所提到，某些方面包括多巴胺d1受体选择性激动剂。多巴胺d1选择性激动剂包括对d2、d3、d4和/或d5受体亚型的ic
50
比对d1受体亚型的ic
50
大至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍的化合物。
[0406]
j.褪黑素受体激动剂
[0407]
在某些实施方案中，化合物是褪黑素受体激动剂，任选地选择性激动剂。褪黑素受体指的是结合至松果体激素褪黑素的高亲和力g蛋白偶合受体的家族。参看reppert，biol rhythms.12：528-31，1997。
[0408]
褪黑素受体的实例包括mt1和mt2受体。在一些方面，褪黑素受体激动剂结合至mt1与mt2受体两者。在一些实施方案中，褪黑素受体激动剂选择性地结合至mt1或mt2受体，例如，结合至mt2但不显著地结合至mt1，或结合至mt1但不显著地结合至mt2。
[0409]
根据一种非限制性理论，诸如褪黑素的褪黑素受体激动剂已经显示刺激十二指肠碳酸氢盐分泌，例如，经由对肠上皮细胞mt2受体的作用。参看例如等，j clin invest.108：625-33，2001；和flemstrom，j.pineal res.34：288-293，2003。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，褪黑素受体激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0410]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，褪黑素受体激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0411]
褪黑素受体激动剂的实例包括结合至并活化褪黑素受体的褪黑素(n-乙酰基-5-甲氧基色胺)和褪黑素类似物。褪黑素的一般结构包含在位置5处具有甲氧基(5-甲氧基)并且在位置3处具有酰基氨乙基侧链的吲哚环；两个侧链有助于结合至并活化褪黑素受体。已经在所有位置处由取代效应评估吲哚环。参看例如rivara等，curr top med chem.8：954-68，2008；以及sugen等，pigment cell research.17：454-460，2004。
[0412]
褪黑素受体激动剂的特定实例包括2-碘褪黑素、6-氯褪黑素、6，7-二氯-2-甲基褪黑素以及8-羟基褪黑素，其全部含有作为部分的5-甲氧基吲哚环，加上可卡丁(circadin)、阿戈美拉汀(agomelatine)、瑞美替昂(ramelteon)、他司美琼(tasimelteon)、β-甲基-6-氯褪黑素(tik-301或ly156735)、tak-375、vec-162、gr196429、s20242、s23478、s24268、s25150、gw290569、bms-214778、8-甲氧基-2-氯乙酰胺基萘满、8-甲氧基-2-丙酰胺基-萘满、n-乙酰基色胺、6-氯褪黑素、2-碘褪黑素、8-m-pdot以及2-苯基褪黑素。参看例如美国申请号2005/0164987，其以全文引用的方式并入。还包括图15中所示的例示性褪黑素受体(mt2)激动剂。
[0413]
筛选褪黑素受体激动剂的方法描述于例如美国申请号2003/0044909中，其以全文引用的方式并入。
[0414]
k.5ht4受体激动剂
[0415]
在某些实施方案中，化合物是5ht4受体激动剂，任选地选择性激动剂。5-羟基色胺
受体4(5ht4)是响应血清素(5-羟基色胺或5-ht)或其它激动剂刺激camp产生的g蛋白偶合血清素受体。
[0416]
基于一种非限制性理论，血清素已经显示增加保护性十二指肠碳酸氢盐分泌，例如，经由肠神经节、camp和ca2 依赖性信号传导路径、以及5ht4依赖性路径。参看例如等，scand j gastroenterol.41：1279-89，2006；tuo等，am j physiol gastrointest liver physiol 286：g444-g451，2004。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，5ht4受体激动剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0417]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，5ht4激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0418]
5ht4激动剂的非限制性实例包括血清素和其类似物、bimu-8、西沙必利(cisapride)、氯波必利、cl033466、ml10302、莫沙必利、普卡必利、伦扎必利、rs67506、rs67333、sl650155、替加色罗、扎考必利、那诺必利(ati-7505)、维司曲格(td-5108)。
[0419]
在一些实施方案中，5ht4受体激动剂或部分激动剂是被取代的苯甲酰胺，诸如西沙必利，包括个别或组合的西沙必利对映体(( )西沙必利和(-)西沙必利)、莫沙必利或伦扎必利。在一些实施方案中，5ht4受体激动剂是苯并呋喃衍生物，诸如普卡必利；吲哚，诸如替加色罗；或苯并咪唑酮。5ht4受体激动剂或部分激动剂的其它非限制性实例包括扎考必利(cas rn 90182-92-6)、sc-53116(cas rn 141196-99-8)和其外消旋体sc-49518(cas rn 146388-57-0)、bimu1(cas rn 127595-43-1)、ts-951(cas rn 174486-39-6)、ml10302(cas rn 148868-55-7)、甲氧氯普胺、5-甲氧基色胺、rs67506、2-[1-(4-胡椒基)哌嗪基]苯并噻唑、rs66331、bimu8、sb 205149(伦扎必利的正丁基季铵化类似物)，以及buchheit等，j med.chem.38：2331-8，1995中所描述的吲哚羰亚胺酰胺。还包括去甲西沙必利(cas rn 102671-04-5)，其为西沙必利的代谢物；柠檬酸莫沙必利(mosapride citrate)；替加色罗的马来酸盐形式(cas rn 189188-57-6)；盐酸扎考必利(zacopride hydrochloride)(cas rn 99617-34-2)；美托必利(mezacopride)(cas rn 89613-77-4)；sk-951(( -)-4-氨基-n-(2-(1-氮杂双环(3.3.0)辛-5-基)乙基)-5-氯-2，3-二氢-2-甲基苯并[b]呋喃-7-甲酰胺半富马酸盐)；ati-7505，西沙必利类似物；sdz-216-454，以浓度依赖性方式刺激camp形成的选择性5ht4受体激动剂(参看例如markstein等，naunyn-schmiedebergs arch pharmacol.359：454-9，1999)；sc-54750，或氨甲基氮杂金刚烷；y-36912，或4-氨基-n-[1-[3-(苯甲基磺酰基)丙基]哌啶-4-基甲基]-5-氯-2-甲氧基苯甲酰胺(参看sonda等，bioorg med.chem.12：2737-47，2004)；tks159，或4-氨基-5-氯-2-甲氧基-n-[(2s，4s)-1-乙基-2-羟基甲基-4-吡咯烷基]苯甲酰胺；rs67333，或1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-(1-正丁基-4-哌啶基)-1-丙酮；kdr-5169，或4-氨基-5-氯-n-[1-(3-氟-4-甲氧基苯甲基)哌啶-4-基]-2-(2-羟基乙氧基)苯甲酰胺盐酸盐二水合物(参看tazawa等，eur j pharmacol.434：169-76，2002)；sl65.0155，或5-(8-氨基-7-氯-2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-5-基)-3-[1-(2-苯乙基)-4-哌啶基]-1，3，4-恶二唑-2(3h)-酮单盐酸盐；以及y-34959，或4-氨基-5-氯-2-甲氧基-n-[1-[5-(1-甲基吲哚-3-基羰基氨基)戊基]哌啶-4-基甲基]苯甲酰胺。
[0420]
5ht4受体激动剂和部分激动剂的额外实例有甲氧氯普胺(cas rn 364-62-5)、5-甲氧基色胺(cas rn 608-07-1)、rs67506(cas rn 168986-61-6)、2-[1-(4-胡椒基)哌嗪
基]苯并噻唑(cas rn 155106-73-3)、rs66331(参看buccafusco等，pharmacology.295：438-446，2000)；bimu8(内-n-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2，3-脱氢-2-氧代-3-(丙-2-基)-1h-苯并咪唑-1-甲酰胺)，或sb 205149(伦扎必利的正丁基季铵化类似物)。还包括与甲氧氯普胺相关的化合物，诸如二盐酸甲氧氯普胺(metoclopramide dihydrochloride)(cas rn 2576-84-3)、二盐酸甲氧氯普胺(cas rn 5581-45-3)以及盐酸甲氧氯普胺(metoclopramide hydrochloride)(cas rn 7232-21-5或54143-57-6)。参看例如美国申请号2009/0325949；de maeyer等，neurogastroenterology and motility.20：99-112，2008；manabe等，expert opin investig drugs.19：765-75，2010；tack等，alimentary pharmacology & ther.35：745-767，2012。这些参考文献以全文引用的方式并入。
[0421]
l.心房利钠肽受体激动剂
[0422]
在一些实施方案中，化合物是心房利钠肽(np)受体激动剂。np受体是具有细胞内鸟苷酰环化酶(gc)活性的单跨膜催化受体。存在np受体的三种同种型：npr1、npr2以及npr3。这些受体具有保守的催化和调控域以及相异的配体结合域。
[0423]
利钠肽受体在脑、血管结构、肾以及胃肠道中发现，并且以不同的亲和力结合α-心房利钠肽、脑利钠肽以及c型利钠肽。np受体的主要生理作用是体液体积的动态平衡。根据一种非限制性理论，外源利钠肽刺激胃肠道中的gc活性。参看例如rambotti等，histochem.j.29：117-126，1997。
[0424]
在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些方面，np受体激动剂通过在小肠中刺激碳酸氢盐分泌和/或抑制酸分泌来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0425]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，np受体激动剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0426]
np受体的例示性肽激动剂的结构示于图16中，并且描述于例如von geldern等，j.med.chem.35：808-816，1992中，其以全文引用的方式并入。
[0427]
在某些实施方案中，np受体激动剂包含心房利钠肽氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：ser leu arg arg ser ser cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys asn ser phe arg tyr(seq id no：7)，包括其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个缺失、插入和/或取代的活性变体。缺失突变体的特定实例包括具有以下序列的那些：cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys (seq id no：8)；以及ser ser cys phe gly gly arg ile asp arg ile gly ala gln ser gly leu gly cys asn ser phe arg(seq id no：9)。如本文别处所描述，这类肽可以由天然存在和非天然存在的氨基酸的任何组合组成。
[0428]
m.碳酸酐酶抑制剂
[0429]
在一些实施方案中，化合物是碳酸酐酶抑制剂。碳酸氢盐摄取入上皮细胞中通过co2扩散而发生，并且随后由细胞碳酸酐酶(ca)转化成hco
3-和h

。然后通过阴离子交换跨越顶端膜分泌碳酸氢盐。ca是使co2水合以产生hco
3-和h

并且存在于包括十二指肠上皮细胞的大多数组织中的酶。参看例如kaunitz和akiba，2006。这种内源产生的hco
3-是转运的碳酸氢盐的重要来源。
[0430]
存在碳酸酐酶的至少15种同种型。碳酸酐酶iv(caiv)是膜结合同种型，而caii是
细胞溶质的、普遍存在的并且高度活性的(周转率约106s-1
)。参看例如shandro和casey，2007。碳酸酐酶ii似乎在功能上与诸如cftr、slc26a6以及dra的碳酸氢盐转运蛋白直接和间接偶合。参看例如seidler和2012。一般来说，除dra以外的所有碳酸氢盐转运蛋白的cooh端尾部具有共同碳酸酐酶ii结合基序。参看例如dudeja和ramaswamy，2006。
[0431]
碳酸酐酶涉及于几个生理过程中，包括ph动态平衡。典型碳酸酐酶抑制剂，诸如乙酰唑胺(acetazolamide)和苯唑拉胺(benzolamide)，已经显示抑制多种ca同种型，包括caii和caiv。参看例如scozzafava等，j.med.chem.45：1466-1476，2002。根据一种非限制性理论，碳酸酐酶的抑制将预期降低近顶端细胞内phi。在不希望受任何一种机制约束的情况下，十二指肠的肠上皮细胞中ca的选择性抑制从而可以减小cepg，使得磷酸盐转运减少。
[0432]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，碳酸酐酶抑制剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0433]
图17示出了例示性碳酸酐酶抑制剂的结构，尤其包括多佐胺(dorzolamide)和布林佐胺(brinzolamide)。在某些方面，碳酸酐酶抑制剂可以与能够升高胃肠道的顶端粘膜细胞中的camp、cgmp、钙或其它第二信使的化合物种类组合使用。
[0434]
n.磷酸二酯酶抑制剂
[0435]
在一些实施方案中，化合物是磷酸二酯酶抑制剂。磷酸二酯酶(pde)是相关磷酸水解酶的家族，其选择性地催化腺苷和/或鸟嘌呤3
′
，5
′
环单磷酸(camp和/或cgmp)中的3
′
环磷酸键的水解。磷酸二酯酶通过控制这些第二信使的降解速率来调控其细胞水平、定位以及作用持续时间。
[0436]
存在pde的11种亚型，名为pde1-11；pde4、7以及8选择性地降解camp，pde5、6以及9选择性地降解cgmp，并且pde1、2、3、10以及11降解两种环核苷酸。pde普遍表达，其中每种亚型具有特定的组织分布。图18示出了具有不同亚型特异性的例示性磷酸二酯酶抑制剂的结构，包括茶碱、西洛他唑(cilostazol)、长春西汀(vinpocetine)、氨力农(amrinone)、ehna、曲喹辛(trequinsin)、屈他维林(drotaverine)、罗氟司特(roflumilast)以及西地那非(sildenafil)。
[0437]
根据一种非限制性理论，磷酸二酯酶抑制剂能够单独地以及与增加细胞溶质camp和cgmp的试剂组合通过维持肠上皮细胞中这些第二信使的水平来调节十二指肠碳酸氢盐分泌(dbs)。pde1和pde3抑制剂特异性地牵涉于调节dbs中。参看例如hayashi，biochem.pharmacol.74：1507-1513，2007。在不希望受任何一种机制约束的情况下，在某些实施方案中，磷酸二酯酶抑制剂通过刺激碳酸氢盐分泌至小肠中或dbs来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0438]
在一些实施方案中，并且在不希望受任何一种机制约束的情况下，磷酸二酯酶抑制剂通过减少小肠中的水吸收来抑制或减少胃肠道中的磷酸盐摄取。
[0439]
在某些实施方案中，pde抑制剂减缓环状amp(camp)和/或环状gmp(cgmp)的降解，然后可以使得camp和/或cgmp的细胞内浓度相对增加。一般实例包括pde1抑制剂、pde3抑制剂、pde4抑制剂、pde5抑制剂、pde3/4抑制剂以及pde3/4/5抑制剂。仅作为非限制性实例，pde抑制剂可以包括以下专利申请和专利中所公开的那些：de1470341、de2108438、de2123328、de2305339、de2305575、de2315801、de2402908、de2413935、de2451417、de2459090、de2646469、de2727481、de2825048、de2837161、de2845220、de2847621、
de2934747、de3021792、de3038166、de3044568、de3142982、de1116676、de2162096、ep000718、ep0008408、ep0010759、ep0059948、ep0075436、ep0096517、ep0112987、ep0116948、ep0150937、ep0158380、ep0161632、ep0161918、ep0167121、ep0199127、ep0220044、ep0247725、ep0258191、ep0272910、ep0272914、ep0294647、ep0300726、ep0335386、ep0357788、ep0389282、ep0406958、ep0426180、ep0428302、ep0435811、ep0470805、ep0482208、ep0490823、ep0506194、ep0511865、ep0527117、ep0626939、ep0664289、ep0671389、ep0685474、ep0685475、ep0685479、ep0293063、ep0463756、ep0482208、ep0579496、ep0667345、ep0163965、ep0393500、ep0510562、ep0553174、jp92234389、jp94329652、jp95010875；美国专利号4,963,561、5,141,931以及6,331,543；国际专利申请公布号wo9117991、wo9200968、wo9212961、wo9307146、wo9315044、wo9315045、wo9318024、wo9319068、wo9319720、wo9319747、wo9319749、wo9319751、wo9325517、wo9402465、wo9406423、wo9412461、wo9420455、wo9422852、wo9425437、wo9427947、wo9500516、wo9501980、wo9503794、wo9504045、wo9504046、wo9505386、wo9508534、wo9509623、wo9509624、wo9509627、wo9509836、wo9514667、wo9514680、wo9514681、wo9517392、wo9517399、wo9519362、wo9522520、wo9524381、wo9527692、wo9528926、wo9535281、wo9535282、wo9600218、wo9601825、wo9602541、wo9611917、wo9307124、wo9501338以及wo9603399；以及美国申请号2005/0004222(包括式i-xiii和段落37-39、85-0545以及557-577中所公开的那些)，其各自以全文引用的方式并入。
[0440]
pde5抑制剂的实例包括rx-ra-69、sch-51866、kt-734、维司力农(vesnarinone)、敏喘宁(zaprinast)、skf-96231、er-21355、bf/gp-385、nm-702以及西地那非pde4抑制剂的实例包括ro-20-1724、mem 1414(r1533/r1500；pharmacia roche)、登布茶碱(denbufylline)、咯利普兰(rolipram)、氧格雷酯(oxagrelate)、硝喹宗(nitraquazone)、y-590、dh-6471、skf-94120、莫他匹酮(motapizone)、利沙齐农(lixazinone)、吲哚利旦(indolidan)、奥普力农(olprinone)、阿替唑兰(atizoram)、ks-506-g、地普非林(dipamfylline)、bmy-43351、阿替唑兰、阿罗茶碱(arofylline)、非明司特(filaminast)、pdb-093、ucb-29646、cdp-840、skf-107806、吡拉米司特(piclamilast)、rs-17597、rs-25344-000、sb-207499、硫苯司特(tibenelast)、sb-210667、sb-211572、sb-211600、sb-212066、sb-212179、gw-3600、cdp-840、莫哌达醇(mopidamol)、阿那格雷(anagrelide)、异丁司特(ibudilast)、氨力农、匹莫苯丹(pimobendan)、西洛他唑、喹齐酮(quazinone)以及n-(3，5-二氯吡啶-4-基)-3-环丙基甲氧基4-二氟甲氧基苯甲酰胺。pde3抑制剂的实例包括硫马唑(sulmazole)、安匹宗(ampizone)、西洛酰胺(cilostamide)、卡巴喹伦(carbazeran)、匹罗昔酮(piroximone)、伊马唑旦(imazodan)、ci-930、氰胍佐旦(siguazodan)、阿地本旦(adibendan)、沙特力农(saterinone)、skf-95654、sdz-mks-492、349-u-85、依莫旦(emoradan)、emd-53998、emd-57033、nsp-306、nsp-307、瑞维齐农(revizinone)、nm-702、win-62582和win-63291、依诺昔酮(enoximone)以及米力农(milrinone)。pde3/4抑制剂的实例包括苯芬群(benafentrine)、曲喹辛、org-30029、扎达维林(zardaverine)、l-686398、sdz-isq-844、org-20241、emd-54622以及托拉芬群(tolafentrine)。pde抑制剂的其它实例包括西洛司特(cilomilast)、己酮可可碱(pentoxifylline)、罗氟司特、他达那非(tadalafil，)、茶碱、伐地那非
(vardenafil，)以及敏喘宁(pde5特并性)。
[0441]
在某些方面，磷酸二酯酶抑制剂可以与能够升高胃肠道的顶端粘膜细胞中的camp、cgmp、钙或其它第二信使的化合物种类组合使用。
[0442]
o.dra的激动剂(slc26a3)
[0443]
在某些实施方案中，化合物是氯化物/碳酸氢盐反向转运体slc26a3，也称作腺瘤下调基因(dra)的激动剂。肠管中dra的一种非限制性功能是吸收腔氯化物并分泌碳酸氢盐离子。dra的药理学刺激预期降低phi，例如，通过增加uwl的ph，并且提供如本文所描述的磷酸盐降低作用。
[0444]
dra激动剂的实例包括溶血磷脂酸(lpa)和结构上相关的化合物。这类化合物据信经由通过pi3k/akt路径对lpa受体(例如，lpa2)信号传导的刺激而对dra活性起作用，这据信不仅活化dra基因转录，而且增加dra表面积聚(singla等am.j.physiol gastrointest.liver physiol.298：g182-g189，2010；singla等am.j.physiol.gastrointest.liver physiol.302：g618-g627，2012)。在dra刺激中具有潜在作用的lpa相关化合物的实例描述于以下文献中：jiang等，bioorg.med.chem.lett.23：1865-1869，2013；kiss等，molecular pharmacology 82：1162-1173，2012；kozian等，bioorg.med.chem.lett.22：5239-5243，2012；parrill，expert.opin.ther.pat.21：281-286，2011；gupte等，bioorg.med.chem.lett.20：7525-7528，2010；liliom等，biochim.biophys.acta 1761：1506-1514，2006；以及durgam等，journal of medicinal chemistry 48：4919-4930，2005。
[0445]
根据一种非限制性理论，蛋白激酶c抑制剂也可以增加dra活性并且类似地形成跨上皮ph梯度。举例来说，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)，一种体外pkc激动剂，显示直接抑制顶端膜cl-/hco
3-活性(gill等，physiology of the gastrointestinal tract，第67章，2012)。在不希望受任何一种机制约束的情况下，适当pkc同种型的抑制经由本公开中所描述的机制可以相反地增加cl-/hco
3-活性并且从而抑制磷酸盐摄取。
[0446]
图21a-b(mochly-rosen等，nature reviews drug discovery 11，937-957，2012)描绘了具有增加cl-/hco
3-活性的潜力的亚型选择性pkc抑制剂的代表性实例，连同其它潜在作用机制。其它潜在dra激动剂包括全反式视黄酸(atra)和相关化合物，更一般地是活化视黄酸受体(rar)α、β以及γ，优选rar-β的化合物。rar-β激动剂据信诱导处于转录水平的dra(全反式视黄酸经由hnf-1增加slc26a3(dra)表达(priyamvada等，ddw 2013，orlando))。另一种例示性化合物是s20787，其显示刺激在卵母细胞中表达的人类dra的活性(chemova等，j.physiol.，549，1，3-19，2003)。神经肽y1和y2受体的激动剂刺激caco2单层中的dra活性。发现npy对dra的刺激不依赖于膜运输并且与dra定位于脂质筏相关(saksena等am.j.physiol gastrointest liver physiol.299：g1334-g1343，2010)。代表性npy1和npy2激动剂的实例包括npy、[leu31，pro34]-npy、npy 13-36、肽yy(3-36)以及gr 231118。
[0447]
ii.实质上全身非生物可用的化合物
[0448]
a.可定位于gi道的化合物的物理和性能性质
[0449]
本文所描述的某些化合物被设计成在人类或动物受试者的胃肠腔中实质上具活性或定位于其中。术语“胃肠腔”在本文中与术语“腔”可互换使用，指的是由受试者的gi上
皮细胞的顶端膜定界的在胃肠道(gi道，也可以称作肠管)内的空间或空腔。在一些实施方案中，化合物并不通过gi道的上皮细胞层(也称为gi上皮)吸收。“胃肠粘膜”指的是隔开胃肠腔与身体其余部分的细胞层并且包括胃和肠粘膜，诸如小肠的粘膜。如本文所用的“胃肠上皮细胞”或“肠管上皮细胞”指的是面向胃肠道腔的胃肠粘膜表面上的任何上皮细胞，包括例如胃上皮细胞、肠上皮细胞、结肠上皮细胞等等。
[0450]
如本文所用的“实质上全身非生物可用的”和/或“实质上不可渗透的”(以及其变化)一般指的是统计上显著量并且在一些实施方案中基本上所有的化合物保留于胃肠腔中的情况。举例来说，根据本公开的一个或多个实施方案，优选地至少约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或甚至约99.5％的化合物保留于胃肠腔中。在这类情况下，定位于胃肠腔指的是减少化合物跨越上皮细胞的胃肠层的净移动，例如，经由跨细胞与细胞旁转运，以及通过主动和/或被动转运。在这类实施方案中的化合物受跨细胞转运中胃肠上皮细胞层，例如通过小肠上皮细胞的顶端膜的净渗透阻碍。在这些实施方案中的化合物也受通过内衬腔的胃肠上皮细胞之间的细胞旁转运中的“紧密连接”的净渗透阻碍。
[0451]
在这一点上，应注意，在一个特定实施方案中，化合物基本上根本不被gi道或胃肠腔吸收。如本文所用的术语“实质上不可渗透的”或“实质上全身非生物可用的”包括使用本领域中一般已知的方式检测不到化合物的可检测量的吸收或渗透或全身暴露的实施方案。
[0452]
在这一点上，应进一步注意，然而，在替代性实施方案中，“实质上不可渗透的”或“实质上全身非生物可用的”提供或允许gi道并且更特别地肠管上皮中发生一些有限的吸收(例如，一些可检测量的吸收，诸如至少约0.1％、0.5％、1％或更大并且小于约30％、20％、10％、5％等等，吸收的范围例如介于约1％与30％之间，或5％与20％之间等等)；换句话说，“实质上不可渗透的”或“实质上全身非生物可用的”可以指化合物对gi道中细胞的上皮层展现小于约20％的所施用的化合物的一些可检测的渗透性(例如，小于约15％、约10％或甚至约5％、4％、3％或2％，并且例如大于约0.5％或1％)，但然后被肝清除(即，肝提取)和/或肾清除(即，肾排泄)。
[0453]
在这一点上，应进一步注意，在某些实施方案中，归因于本发明化合物的实质性不可渗透性和/或实质性全身非生物可用性，大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％的本发明化合物在施用于有需要的受试者之后经过例如24、36、48、60、72、84或96小时的时段从粪便中可回收。在这方面，应了解，所回收的化合物可以包括母体化合物和其代谢物的总和，这些代谢物例如借助于水解、偶联、还原、氧化、n-烷基化、葡糖醛酸化、乙酰化、甲基化、硫酸化、磷酸化或添加原子至母体化合物中或从母体化合物去除原子的任何其它修饰而从母体化合物得到，其中代谢物经由任何酶的作用或暴露于包括ph、温度、压力的任何生理环境或与存在于消化环境中的食物相互作用而产生。
[0454]
化合物和代谢物的粪便回收率的测量可以使用标准方法进行。举例来说，可以按适合的剂量(例如，10mg/kg)经口施用化合物，并且然后在给药后的预定时间(例如，24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、96小时)收集粪便。可以用有机溶剂萃取母体化合物和代谢物并且使用质谱法定量分析。母体化合物和代谢物的质量平衡分析(包括：母体＝m，代谢物1[m 16]，以及代谢物2[m 32])可以用于确定粪便中的回收百分比。
[0455]
(i)渗透性
[0456]
在这一点上，应注意，在各种实施方案中，化合物实质上全身非生物可用的能力是基于化合物的电荷、大小和/或其它物理化学参数(例如，极性表面积、其中氢键供体和/或接受体的数目、可自由旋转键的数目，等等)。更具体地说，应注意，化合物的吸收特性可以通过应用药物动力学的原理来选择，例如，通过应用里宾斯基规则(lipinski
′
s rule)，也称为“五规则”。尽管不是规则，而是一组准则，里宾斯基显示，具有大于某个临界值的(i)分子量、(ii)氢键供体的数目、(iii)氢键接受体的数目和/或(iv)水/辛醇分配系数(森口对数p(moriguchi log p))的小分子药物一般并不显示显著的全身浓度(即，一般并不以任何显著的程度吸收)。(参看例如lipinski等，advanced drug delivery reviews，46：3-26，2001，以引用的方式并入本文中。)因此，实质上全身非生物可用的化合物可以被设计成具有超过里宾斯基临界值中的一者或多者的分子结构。(还参看lipinski等，在药物发现和开发设置中估计溶解度和渗透性的实验和计算方法(experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings)，adv.drug delivery reviews，46：3-26，2001；以及lipinski，不良溶解度和不良渗透性的类药物性质和原因(drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability)，j.pharm.& toxicol.methods，44：235-249，2000，其以全文引用的方式并入。)
[0457]
在一些实施方案中，举例来说，可以构建本公开的实质上不可渗透或实质上全身非生物可用的化合物以展示以下特性中的一者或多者：(i)大于约500da、约600da、约700da、约800da、约900da、约1000da、约1200da、约1300da、约1400da、约1500da、约1600da、约1800da、约2000da、约2500da、约3000da、约4000da、约5000da、约7500da、约10,000da或更大的mw(在非盐形式的化合物中)；(ii)大于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20或更大的nh和/或oh和/或其它潜在氢键供体的总数；(iii)大于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20或更大的o原子和/或n原子和/或其它潜在氢键接受体的总数；(iv)大于约105(即，大于约5、约6、约7、约8、约9、约10等的对数p)，或者小于约10(即，小于1或甚至0的对数p)的森口分配系数；和/或(v)大于约5、约10或约15或更大的可旋转键的总数。在特定实施方案中，化合物具有不为14或小于约14的对数p，例如，在约6至7、6至8、6至9、6至10、6至11、6至12、6至13、7至8、7至9、7至10、7至11、7至12、7至13、8至9、8至10、8至11、8至12、8至13、9至10、9至11、9至12、9至13、10至11、10至12、10至13、11至12、11至13或12至13的范围内的对数p。
[0458]
除了上文所提到的参数以外，可以表征为属于极性原子的表面的分子极性表面积(即，“psa”)是也已经显示与通过膜的被动转运充分相关并且因此允许预测药物的转运性质的描述词。其已经成功地应用于预测肠吸收和caco2细胞单层穿透。对于例示性caco2细胞单层穿透测试细节，参看例如以引用的方式并入的美国专利号6,737,423中所提供的caco2模型的描述，特别是描述caco2模型的文本，其可以应用于例如本发明化合物的评估或测试。psa以(平方埃)表示并且从三维分子表示法计算。快速计算方法也是可用的(参看例如ertl等，journal of medicinal chem.43：3714-3717，2000，其全部内容以引用的方式并入本文中用于所有相关和一致的目的)，其使用台式电脑和可商购的化学图形工具包，诸如chemdraw。已经创建术语“拓扑psa”(tpsa)用于这种快速计算方法。tpsa与常用药物的人类吸收数据充分相关(参看表1，来自ertl等，j.med.chem..43：3714-3717，2000)：
2细胞渗透性试验和/或使用人工膜作为胃肠上皮细胞的模型。用例如卵磷脂和/或十二烷浸渍以模拟胃肠粘膜的净渗透特性的合成膜可以用作胃肠粘膜的模型。这种膜可以用于隔开含有本公开的化合物的区室与将监测渗透速率的区室。而且，可以进行平行人工膜渗透性试验(pampa)。这类体外测量可以合理地指示体内实际渗透性(参看wohnsland等，j.med.chem.44：923-930，2001；schmidt等，millipore corp.application note，2002，n an1725en00以及n an1728en00，其以引用的方式并入本文中)。
[0463]
因此，在一些实施方案中，当使用本领域中已知的方式(诸如wohnsland等，2001，同上中所描述的渗透性实验)测量时，本公开的方法中所利用的化合物可以具有小于约100
×
10-6
cm/s、或小于约10
×
10-6
cm/s、或小于约1
×
10-6
cm/s、或小于约0.1
×
10-6
cm/s的渗透系数p
app
。
[0464]
如先前所提到，根据本公开，可以修饰化合物以阻碍其通过肠管上皮细胞层的净吸收，促使其实质上全身非生物可用。在一些特定实施方案中，本公开的化合物包含连接、偶合或以其它方式附接至非可吸收部分的化合物，这种部分可以是寡聚物部分、聚合物部分、疏水部分、亲水部分和/或带电部分，促使整体化合物实质上不可渗透或实质上全身非生物可用。在一些优选实施方案中，化合物偶合至多聚物或聚合物部分(portion/moiety)，以使得所得分子是实质上不可渗透的或实质上全身非生物可用的。多聚物或聚合物部分可以具有大于约500道尔顿(da)、约1000da、约2500da、约5000da、约10,000da或更大的分子量，并且特别地可以具有在约1000道尔顿(da)至约500,000da的范围内，优选地在约5000至约200,000da的范围内的分子量，并且更优选地可以具有足够高以基本上排除化合物通过肠管上皮细胞层的任何净吸收的分子量。在这些或其它特定实施方案中，修饰化合物以实质上阻碍其通过肠管上皮细胞层的净吸收。
[0465]
(ii)c
max
和ic
50
或ec
50
[0466]
在一些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物当单独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，展现血清中检测到的最大浓度，定义为c
max
，其与化合物的磷酸盐离子(pi)转运或摄取抑制浓度ic
50
大致相同或小于ic
50
。在一些实施方案中，举例来说，c
max
比抑制pi转运或摄取的ic
50
小约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，c
max
为抑制pi转运或摄取的ic
50
的约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9
×
(0.9倍)。
[0467]
在某些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物中的一者或多者当施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，可以具有约或小于约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，或范围介于约0.01至1.0、0.01至0.9、0.01至0.8、0.01至0.7、0.01至0.6、0.01至0.5、0.01至0.4、0.01至0.3、0.01至0.2或0.01至0.1之间，或范围介于约0.1至1.0、0.1至0.9、0.1至0.8、0.1至0.7、0.1至0.6、0.1至0.5、0.1至0.4、0.1至0.3或0.1至0.2之间的c
max
：ic
50
(对于抑制pi转运或摄取)的比率，其中c
max
和ic
50
用相同单位表示。
[0468]
在一些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物当单独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，展现血清中检测到的最大浓度，定义为c
max
，其与增加磷酸盐粪便输出量的化合物的ec
50
大致相同
或小于ec
50
，其中粪便输出量增加约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，举例来说，c
max
比增加磷酸盐粪便输出量的ec
50
小约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，c
max
为增加磷酸盐粪便输出量的ec
50
的约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9
×
(0.9倍)。
[0469]
在一些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物中的一者或多者当单独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者，或在动物模型或基于细胞的试验中测量时，可以具有约或小于约10μm、9μm、8μm、7μm、7.5μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2.5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.1μm、0.05μm或0.01μm或更小的增加磷酸盐粪便输出量的ec
50
，ic
50
例如在约0.01μm至约10μm、或约0.01μm至约7.5μm、或约0.01μm至约5μm、或约0.01μm至约2.5μm、或约0.01μm至约1.0、或约0.1μm至约10μm、或约0.1μm至约7.5μm、或约0.1μm至约5μm、或约0.1μm至约2.5μm、或约0.1μm至约1.0μm、或约0.5μm至约10μm、或约0.5μm至约7.5μm、或约0.5μm至约5μm、或约0.5μm至约2.5μm、或约0.5μm至约1.0μm的范围内。
[0470]
在特定实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物当单独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，展现血清中检测到的最大浓度，定义为c
max
，其与减少磷酸盐尿液输出量的化合物的ec
50
大致相同或小于ec
50
，其中尿液输出量减少约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，举例来说，c
max
比减少磷酸盐尿液输出量的ec
50
小约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，c
max
为减少磷酸盐尿液输出量的ec
50
的约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9
×
(0.9倍)。
[0471]
在一些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物中的一者或多者当单独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者，或在动物模型或基于细胞的试验中测量时，可以具有约或小于约10μm、9μm、8μm、7μm、7.5μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2.5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.1μm、0.05μm或0.01μm或更小的减少磷酸盐尿液输出量的ec
50
，ic
50
例如在约0.01μm至约10μm、或约0.01μm至约7.5μm、或约0.01μm至约5μm、或约0.01μm至约2.5μm、或约0.01μm至约1.0、或约0.1μm至约10μm、或约0.1μm至约7.5μm、或约0.1μm至约5μm、或约0.1μm至约2.5μm、或约0.1μm至约1.0μm、或约0.5μm至约10μm、或约0.5μm至约7.5μm、或约0.5μm至约5μm、或约0.5μm至约2.5μm、或约0.5μm至约1.0μm的范围内。
[0472]
在某些实施方案中，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物中的一者或多者当施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，可以具有约或小于约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，或范围介于约0.01至1.0、0.01至0.9、0.01至0.8、0.01至0.7、0.01至0.6、0.01至0.5、0.01至0.4、0.01至0.3、0.01至0.2或0.01至0.1之间，或范围介于约0.1至1.0、0.1至0.9、0.1至0.8、0.1至0.7、0.1至0.6、0.1至0.5、0.1至0.4、0.1至0.3或0.1至0.2之间的c
max
：ec
50
(例如，对于增加磷酸盐粪便输出量，对于减少磷酸盐尿液输出量)的比率，其中c
max
和ec
50
用相同单位表示。
[0473]
另外或替代地，本文详述的实质上全身非生物可用的化合物中的一者或多者当单
独地或与一种或多种额外医药活性化合物或试剂组合施用(例如，经肠)于有需要的受试者时，可以具有约或小于约10ng/ml、约7.5ng/ml、约5ng/ml、约2.5ng/ml、约1ng/ml、或约0.5ng/ml的c
max
，c
max
例如在约1ng/ml至约10ng/ml、或约2.5ng/ml至约7.5ng/ml的范围内。
[0474]
iii.医药组合物和治疗方法
[0475]
出于施用的目的，本发明的化合物可以作为原料化学品施用于患者或受试者或可以配制成医药组合物。本发明的医药组合物一般包含本发明的化合物和医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。化合物以如本文所描述的有效治疗所关注的特定疾病或病状的量并且优选地以受试者可接受的毒性存在于组合物中。化合物的活性可以由本领域的技术人员测定，例如，如本文和以下实施例中所描述。适当浓度和剂量可以由本领域的技术人员容易地确定。
[0476]
本发明的化合物或组合物可以用于治疗将得益于胃肠道中的磷酸盐摄取抑制的受试者的基本上任何疾病或其它病状的方法中。
[0477]
举例来说，作为说明但不受限制，肾损伤减少肾1-α羟化酶的产生和活性，导致较少的1，25-二羟基维生素d。降低的维生素d水平限制胃肠钙吸收，导致血清钙水平下降。较少的1，25-二羟基维生素d与较低的血清钙水平的组合协同刺激甲状旁腺组织产生并分泌pth。肾单位的损失还损害pi排泄，但血清p水平由pth和fgf-23的作用并且由较高的血清p水平主动防御，这显著提高尿液po4排泄。然而，pth和fgf-23的小管作用面对连续的肾单位损失无法维持血清p水平。一旦肾功能不全进展至约40-50％的肾功能损失，功能性肾组织的量的减少就不允许维持动态平衡所需的总量摄入的磷酸盐的排泄。因此，发展成高磷酸盐血症。另外，血清p水平的升高阻碍肾1-α羟化酶活性，进一步抑制活化的维生素d水平，并且进一步刺激pth，导致继发性甲状旁腺功能亢进(shpth)。
[0478]
然而，磷失衡不一定等同于高磷酸盐血症。而是，绝大多数尚未透析的ckd患者是正常磷酸盐血的，但其磷平衡明确有过量磷处于呈异位性钙化，例如内膜定位的血管钙化形式的血管结构中。在临床上，患有ckd的患者具有升高的fgf-23水平，其与恶化的肾功能和降低的骨化三醇水平显著相关，并且已经假设fgf-23的合成由与肾衰竭连续的体内过量p的存在诱导。
[0479]
此外，对心血管疾病未识别的影响是餐后磷酸盐血症，即，继发于膳食摄入的血清p偏移。进一步地，研究已经调查了磷负荷对体外和体内内皮功能的实际影响。使牛主动脉内皮细胞暴露于磷负荷增加反应性氧物质的产生并且减少一氧化氮，一种已知的血管舒张剂。在上文所描述的健康志愿者的实际p负荷研究中，发现流量介导的舒张与餐后血清p反向相关(参看例如shuto等，j.am.soc.nephrol.20：1504-12，2009)。
[0480]
因此，在某些实施方案中，本发明的化合物或组合物可以用于选自以下一者或多者的方法中：治疗高磷酸盐血症，任选地餐后高磷酸盐血症的方法；治疗肾病(例如，慢性肾病(ckd)、末期肾病(esrd))的方法；降低血清肌酐水平的方法；治疗蛋白尿的方法；延迟肾替代疗法(rrt)，诸如透析的时间的方法；降低fgf23水平的方法；减小活性维生素d的高磷酸盐血效应的方法；减弱甲状旁腺功能亢进，诸如继发性甲状旁腺功能亢进的方法；减少血清甲状旁腺激素(pth或ipth)的方法；改善内皮功能障碍，任选地由餐后血清磷诱发的内皮功能障碍的方法；减少血管钙化或减弱内膜定位的血管钙化的方法；减少尿液磷的方法；使血清磷水平正常化的方法；降低老年患者中的磷酸盐负荷的方法；减少膳食磷酸盐摄取的
方法；减少餐后钙吸收的方法；减少肾肥大的方法；以及减少心肥大的方法。在某些实施方案中，需要降低磷酸盐的受试者患有前述病状中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括在治疗之前选择或鉴别这样的受试者，任选地基于本文所描述的临床或诊断参数中的一者或多者。
[0481]
高磷酸盐血症指的是血液中存在水平升高的磷酸盐的病状。人类成人中的平均血清磷质量通常在约2.5至4.5mg/dl(约0.81至1.45mmol/l)的范围内。由于生长激素效应，因此水平通常在婴儿中约高50％并且在儿童中约高30％。因此，某些方法包括治疗患有高磷酸盐血症的成年人类患者，其中这个患者具有约或至少约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5mg/dl的血清磷质量。在一些方面，治疗使高磷酸盐血受试者中的血清磷浓度或水平降至正常血清磷水平的约150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％或100％(正常化)(例如，对于成人，2.5至4.5mg/dl或0.81至1.45mmol/l)。在一些方面，治疗方案的结果是和/或包括监测磷酸盐水平以使得其保持在约2.5至4.5mg/dl(约0.81至1.45mmol/l)的范围内。在一些方面，治疗使外部磷平衡朝着净排泄偏移，例如，通过使磷的净排泄相对于未处理的状态增加约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更大，同时降低或不会降低血清磷浓度或水平。
[0482]
还包括治疗儿童或青少年人类患者的方法，其中这个患者具有约或至少约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0mg/dl的血清磷质量。如本文所提到，在这些和相关实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以使受试者中的血清磷质量降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大。
[0483]
某些实施方案涉及治疗慢性肾病(ckd)，一种由肾功能的进行性损失表征的病状的方法。ckd的常见原因包括糖尿病、高血压以及肾小球肾炎。因此，某些方法包括治疗患有ckd的受试者，其中这个受试者任选地还患有前述病状中的一者或多者。
[0484]
在一些方面，如果受试者持续约3个月具有小于60ml/min/1.73m2的肾小球滤过率(gfr)，那么这个受试者被归类为患有ckd，无论其是否还呈现有肾损伤。因此，某些方法包括治疗具有约或小于约60、55、50、45、40、30、35、20、25、20、15或10ml/min/1.73m2左右的gfr(例如，在治疗之前的初始gfr)的受试者。在某些实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以使gfr增加约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大。
[0485]
ckd最常根据病期来表征：1期、2期、3期、4期以及5期。1期ckd包括具有肾损伤和约或大于约90ml/min/1.73m2的正常或相对高的gfr的受试者。2期ckd包括具有肾损伤和约60至89ml/min/1.73m2的gfr的受试者。3期ckd包括具有肾损伤和约30至59ml/min/1.73m2的gfr的受试者。4期ckd包括具有肾损伤和约15至29ml/min/1.73m2的gfr的受试者。5期ckd包括具有已确立的肾衰竭和小于约15ml/min/1.73m2的gfr的受试者。5期ckd也被称作末期肾病(esrd)。因此，在某些方法中，受试者具有1期、2期、3期、4期或5期ckd和其相关临床特性中的一者或多者(例如，规定的gfr、肾损伤)。在一些实施方案中，如本文所描述和本领域中已知，受试者具有esrd和其相关临床特性中的任一者或多者。
[0486]
ckd可以根据受影响的肾部分来表征。举例来说，在某些方面，ckd包括血管相关的
ckd，包括大血管疾病，诸如双侧肾动脉狭窄，和小血管疾病，诸如缺血性肾病、溶血性尿毒症综合症以及血管炎。在某些方面，ckd包括肾小球相关的ckd，包括原发性肾小球疾病，诸如局灶性节段性肾小球硬化和iga肾炎，以及继发性肾小球疾病，诸如糖尿病性肾病和狼疮性肾炎。还包括小管间质相关的ckd，包括多囊性肾病、药物和毒素诱发的慢性小管间质性肾炎、以及返流性肾病。因此，治疗ckd的某些受试者可以具有一种或多种前述ckd相关特性。
[0487]
某些方面涉及治疗具有肾损伤或肾损伤的一种或多种症状/临床征象的受试者的方法。肾损伤(例如，ckd相关的肾损伤)和其相关症状的实例包括损伤的病理性异常和标志物，包括在血液测试(例如，肌酐的高血液或血清水平、肌酐清除率)、尿液测试(例如，蛋白尿)和/或成像研究中鉴别的异常。
[0488]
肌酐是肌肉中的磷酸肌酸的分解产物，并且提供肾健康的易测量和适用的指示剂。血液或血清肌酐的正常人类参考范围对于女性在约0.5至1.0mg/dl(约45至90μmol/l)的范围内并且对于男性在约0.7至1.2mg/dl(约60至110μmol/l)的范围内。因此，根据本文所描述的方法治疗的某些受试者(例如，初始地，在治疗之前)可以具有约或大于约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mg/dl的血液或血清肌酸水平。在这些和相关实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以使受试者中的总体血液或血清肌酐水平降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0489]
肌酐清除率(c
cr
或crcl)指的是每单位时间清除肌酐的血浆的体积；其通过经过一段时间(例如，24小时)相对于尿液比较血液中肌酐的水平来测量。肌酸清除率通常以毫升/分钟(ml/min)或以体质量的函数(ml/min/kg)测量。取决于所进行的测试，正常值对于男性在约97至137ml/min的范围内并且对于女性在约88至128ml/min的范围内。减小的肌酐清除率提供肾损伤的适用征象。因此，根据本文所描述的方法治疗的某些男性受试者(例如，初始地，在治疗之前)可以具有约或小于约97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50或更小的c
cr
。根据本文所描述的方法治疗的某些女性受试者(例如，初始地，在治疗之前)可以具有约或小于约88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、47、46、45、44、43、42、41、40或更小的c
cr
。在一些实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以维持受试者中的c
cr
或使c
cr
增加约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0490]
蛋白尿指的是尿液中过量蛋白质的病状。其与包括肾损伤的多种疾病病状相关。蛋白尿通常表征为大于约45mg/mmol的尿蛋白/肌酐比，或在特定测试中大于约30mg/mmol的白蛋白/肌酸比。根据本文所提供的方法治疗的某些受试者(例如，在治疗之前)具有单独或与ckd或其它肾损伤组合的蛋白尿，包括具有约或大于约45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120mg/mmol的尿蛋白/肌酐比和/或约或大于约30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120mg/mmol的尿白蛋白/肌酐比的受试者。在这些和相关实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以治疗蛋白尿，例如，通过使尿蛋白/肌酐比和/或尿白蛋白/肌酐比降低约或至少约5％、10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0491]
ckd与多种临床症状相关。实例包括高血压(high blood pressure/hypertension)、尿素积聚、高钾血症、贫血症、高磷酸盐血症、低钙血症、代谢性酸中毒以及动脉粥样硬化。因此，在某些方法中，患有ckd的受试者还可以具有前述临床症状中的一者或多者或处于具有前述临床症状中的一者或多者的风险下。在特定方面，如本文所描述，患有ckd的受试者患有高磷酸盐血症或处于患有高磷酸盐血症的风险下。
[0492]
肾替代疗法(rrt)涉及肾衰竭的各种维持生命的治疗，包括在较后期的ckd和esrd中起始的那些。rrt的实例包括透析、血液透析、血液滤过以及肾移植。在某些实施方案中，根据本文所提供的方法治疗的受试者将要经历、正在经历或已经经历一种或多种类型的rrt。在一些实施方案中，受试者尚未经历rrt，并且本文所描述的化合物的施用使起始rrt的时间(例如，相对于未处理的状态)延迟约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年或更长时间。
[0493]
成纤维细胞生长因子23(fgf23)调控磷和维生素d代谢。其还促进磷酸盐尿并且减少骨化三醇的产生。增加的fgf23水平与死亡率、左心室肥大(或左心室质量指数)、心肌工作能力、内皮功能障碍以及ckd进展相关。确实，fgf23水平在早期ckd中逐渐增加，这大概是作为维持正常血清磷水平或正常磷平衡的生理性适应。fgf23水平可能还直接促成心、血管以及肾中的组织损伤。因此，某些实施方案涉及治疗在血液或血清中具有增加的fgf23水平的受试者(参看例如kirkpantur等，nephrol dial transplant.26：1346-54，2011)，包括患有ckd的受试者和经历透析/血液透析的受试者。在一些方面，本文所描述的化合物或组合物的施用使血液或血清中fgf23水平的对数降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0494]
维生素d尤其刺激小肠中磷酸盐离子的吸收。因此，维生素d的过度水平或活性可以导致增加的磷酸盐水平和高磷酸盐血症。因此，某些实施方案涉及减小例如具有水平或活性升高的维生素d的受试者中的活性维生素d的高磷酸盐血效应的方法。在一些方面，受试者具有因维生素d的过度摄入所致的维生素d中毒。
[0495]
甲状旁腺功能亢进是甲状旁腺产生过多甲状旁腺激素(pth)的病症。继发性甲状旁腺功能亢进由响应低钙血症和相关的甲状旁腺肥大的pth过度分泌来表征。ckd是继发性甲状旁腺功能亢进的最常见原因，这一般是由于肾不能将足够的维生素d转化成其活性形式并且排泄足够的磷酸盐。不溶性磷酸钙在体内形成并且由此从循环中去除钙，导致低钙血症。甲状旁腺然后进一步增加pth的分泌以试图增加血清钙水平。根据本文所提供的方法治疗的某些受试者由此可以(例如，初始地，在治疗之前)呈现有甲状旁腺功能亢进和/或增加的pth水平，任选地与ckd、高磷酸盐血症、低钙血症、或本文所描述的其它病状或症状组合。在一些方面，本文所描述的化合物或组合物的施用可以减轻有需要的受试者的甲状旁腺功能亢进，包括继发性甲状旁腺功能亢进。在一些方面，本文所描述的化合物或组合物的施用可以使pth水平降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大，例如，通过降低血清磷水平和相关的不溶性磷酸钙形成，增加可用的钙，并且从而减少低钙血症诱导的pth产生。
[0496]
在某些实施方案中，本文所描述的化合物的施用可以为患有ckd的受试者提供多
种治疗作用。在一些情况下，化合物的施用使fgf23水平和血清甲状旁腺激素(pth)水平相对于未处理的状态降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大，降低血压，并且使蛋白尿相对于未处理的状态减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0497]
在特定实施方案中，本文所描述的化合物的施用可以为患有esrd(或5期ckd)的受试者提供多种治疗作用。在特定情况下，化合物的施用使血清磷浓度或水平相对于未处理的状态降低约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大。
[0498]
高磷酸盐血症可以导致健康受试者与患有肾病的那些受试者的内皮功能障碍，这与血管钙化无关(参看例如di marco等，kidney international.83：213-222，2013)。膳食磷酸盐限制或磷酸盐结合剂对血清磷水平的管理可以防止这类受试者发展成心血管疾病。研究也已经显示，膳食磷酸盐限制可以通过增加内皮一氧化氮合成酶和akt的活化性磷酸化来改善主动脉内皮功能障碍(例如，在伴有高磷酸盐血症的ckd中)(参看例如van等，j clin biochem nutr.51：27-32，2012)。根据本文所提供的方法治疗的某些受试者可以具有内皮功能障碍或处于具有内皮功能障碍的风险下，任选地与高磷酸盐血症、肾病或本文所描述的任何其它病状组合。通过单独地或与膳食磷酸盐限制组合减少餐后或膳食磷酸盐摄取，本文所描述的化合物或组合物的施用可以降低发展成内皮功能障碍的风险，或可以改善已有的内皮功能障碍，包括由餐后血清磷诱发的内皮功能障碍。
[0499]
高磷酸盐血症是血管钙化的主要诱导因素(参看giachelli，kidney int.75：890-897，2009)。主要呈磷灰石形式的磷酸钙沉积是血管钙化的标志并且可以在血管、心肌以及心瓣膜中发生。与磷酸钙在骨骼外组织中的被动沉积一起，无机磷酸盐也可以直接经由血管结构中的中膜的“骨化”来诱导动脉钙化。此外，血管平滑肌细胞经由需要钠依赖性磷酸盐共转运体的机制通过经历骨软骨源性表型变化并且使其细胞外基质矿化来响应升高的磷酸盐水平。
[0500]
内膜钙化通常在动脉粥样硬化病灶中发现。中膜钙化通常在年龄相关的动脉硬化和糖尿病中观测到，并且是在esrd中观测到的钙化的主要形式。确实，动脉壁和软组织的广泛钙化是患有ckd的患者，包括患有esrd的那些患者的常见特征。在瓣膜中，钙化是主动脉瓣狭窄的定义特征，并且在小叶与环中发生，主要在发炎和机械应力的部位处。这些机械变化与增加的动脉脉搏波速度和脉搏压相关，并且导致受损的动脉扩张性、增加的后负荷有利左心室肥大以及损害的冠状动脉灌注(参看guerin等，circulation.103：987-992，2001)。因此，内膜与中膜钙化都可以对与心血管疾病相关的发病率和死亡率作贡献，并且可能是在ckd和esrd患者中观测到的心血管死亡风险显著增加的主要贡献因素。因此，血清磷的控制可以减少钙/磷酸盐产物的形成并且从而减少血管钙化。因此，根据本文所提供的方法治疗的某些受试者可以具有血管钙化或处于发展成血管钙化的风险下，包括内膜和/或中膜钙化，任选地与高磷酸盐血症、ckd以及esrd中的任一者组合。在一些实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用在有需要的受试者降低发展成血管钙化的风险或减少血管钙化的形成或水平。在特定实施方案中，本文所描述的化合物或组合物的施用可以使血管钙化减少约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％或更大，例如，相对于未处理的状态。
[0501]
老年患者可能尤其易受增加的磷酸盐影响。举例来说，膳食和基因操纵研究提供磷酸盐中毒加速老化过程的体内证据并且提出磷酸盐在哺乳动物老化中的新颖作用(参看例如ohnishi和razzaque，faseb j.24：3562-71，2010)。这些研究显示，过量磷酸盐与过早老化的许多征象相关，包括驼背、不协调运动、性腺机能减退、不育、骨骼肌耗损、气肿和骨质减少，以及皮肤、肠、胸腺和脾的泛发性萎缩。因此，某些实施方案涉及降低老年患者中的磷酸盐负荷，例如，以减少过早老化的任何一个或多个征象，其包括向老年患者施用本文所描述的化合物。在一些情况下，老年患者为约或至少约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100岁或更大年龄。
[0502]
肥大指的是器官或组织因其组成细胞膨大所致的体积增大。高磷酸盐血症与包括左心室肥大的心肌肥大(参看neves等，kidney iht.66：2237-44，2004；以及achinger和ayus，am soc nephrol.17(12增刊3)：s255-61，2006)和包括肾小球肥大的代偿性肾肥大相关，后者通常在ckd中观测到。根据本文所提供的方法治疗的某些受试者可以具有(例如，初始地，在治疗之前)心肌肥大、肾肥大或两者，单独或与ckd或肾损伤组合。在一些实施方案中，本文所描述的化合物的施用可以使心肌肥大和/或肾肥大相对于未处理的状态减少约或至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大。
[0503]
呈纯的形式或于适当医药组合物中的本发明化合物或其医药学上可接受的盐的施用可以经由起到类似效用的试剂所接受的施用模式中的任一者来进行。本发明的医药组合物可以通过将本发明的化合物与适当医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射液、吸入剂、凝胶、微球以及气雾剂。施用这类医药组合物的典型途径包括(但不限于)经口、局部、经皮、吸入、肠道外、舌下、经颊、经直肠、经阴道以及鼻内。如本文所用的术语肠道外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。配制本发明的医药组合物以允许在将组合物施用于患者后其中所含的活性成分是生物可用的。将施用于受试者或患者的组合物采用一个或多个剂量单位的形式，其中举例来说，片剂可以是单个剂量单位，并且呈气雾剂形式的本发明化合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这类剂型的实际方法为本领域的技术人员所知或将显而易见；例如，参看remington：the science and practice of pharmacy，第20版(philadelphia college of pharmacy and science，2000)。有待施用的组合物在任何情况下将含有治疗有效量的本发明化合物或其医药学上可接受的盐，用于根据本发明的教义治疗所关注的疾病或病状。
[0504]
本发明的医药组合物可以呈固体或液体的形式。在一个方面，载剂是微粒，以使得组合物例如呈片剂或粉末形式。载剂可以是液体，其中组合物是例如口服糖浆、可注射液体或气雾剂，其适用于例如吸入施用。
[0505]
当预期用于经口施用时，医药组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液以及凝胶形式包括于在本文中视为固体或液体的形式内。
[0506]
作为供经口施用的固体组合物，医药组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶、糯米纸或类似形式。这样的固体组合物将通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。另外，以下一者或多者可以存在：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，诸如海藻酸、海藻
酸钠、泊莫胶(primogel)、玉米淀粉等等；润滑剂，诸如硬脂酸镁或斯特克(sterotex)；助流剂，诸如胶态二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精；以及着色剂。
[0507]
当医药组合物呈胶囊，例如明胶胶囊的形式时，除上述类型的物质以外，其可以含有液体载剂，诸如聚乙二醇或油。
[0508]
医药组合物可以呈液体的形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于经口施用或用于通过注射递送。当预期用于经口施用时，除本发明化合物以外，优选的组合物含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及增味剂中的一者或多者。在预期用于通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂以及等张剂中的一者或多者。
[0509]
本发明的液体医药组合物，无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式，都可以包括以下佐剂中的一者或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选地生理盐水)、林格氏溶液(ringer
′
s solution)、等张氯化钠、非挥发性油(诸如可以充当溶剂或悬浮介质的甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张力调节剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠道外制剂可以封闭于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射医药组合物优选地是无菌的。
[0510]
预期用于肠道外或经口施用的本发明的液体医药组合物应含有一定量的本发明化合物以使得将获得适合的剂量。
[0511]
本发明的医药组合物可以预期用于局部施用，在这种情况下载剂可以适宜地包含溶液、乳液、软膏或凝胶基剂。举例来说，基剂可以包含以下一者或多者：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(诸如水和醇)，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于供局部施用的医药组合物中。如果预期用于经皮施用，那么组合物可以包括经皮贴片或离子导入装置。
[0512]
本发明的医药组合物可以预期用于以例如栓剂的形式经直肠施用，其将在直肠中熔化并且释放药物。供经直肠施用的组合物可以含有油脂性基剂作为适合的非刺激性赋形剂。这类基剂包括(但不限于)羊毛脂、可可脂以及聚乙二醇。
[0513]
本发明的医药组合物可以包括改变固体或液体剂量单位的实体形式的各种物质。举例来说，组合物可以包括在活性成分周围形成包覆壳的物质。形成包覆壳的物质通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶以及其它肠溶包覆剂。或者，活性成分可以装入明胶胶囊中。
[0514]
呈固体或液体形式的本发明的医药组合物可以包括结合至本发明的化合物并且从而有助于递送化合物的试剂。可以发挥这种能力的适合试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。
[0515]
本发明的医药组合物可以由可以作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示多种系统，范围从胶态性质的那些至由加压包装组成的系统。递送可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的适合泵系统。本发明化合物的气雾剂可以在单相、两相或三相系统中递送以递送活性成分。气雾剂的递送包括必需的容器、活化剂、阀门、子容器等
等，其一起可以形成试剂盒。本领域的技术人员在没有过度实验的情况下可以确定优选的气雾剂。
[0516]
本发明的医药组合物可以通过医药领域中熟知的方法制备。举例来说，预期通过注射施用的医药组合物可以通过将本发明的化合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备。可以添加表面活性剂以有助于形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂是与本发明的化合物发生非共价相互作用以有助于化合物溶解或均匀悬浮于水性递送系统中的化合物。
[0517]
本发明的化合物或其医药学上可接受的盐以治疗有效量施用，这将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时长；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别以及饮食；施用模式和时间；排泄速率；药物组合；特定病症或病状的严重性；以及经历疗法的受试者。
[0518]
在某些实施方案中，实质上不可渗透或实质上全身非生物可用的化合物的典型剂量可以介于每天约0.2mg与每天约2g之间，或介于每天约1mg与约1g之间，或介于约5mg与约500mg之间，或介于每天约10mg与约250mg之间，将其施用于需要治疗的受试者。
[0519]
本文所描述的化合物和组合物的施用频率可以从一天一次(qd)变至一天两次(bid)或一天三次(tid)等等，精确的施用频率随着例如患者的病状、剂量等等而变化。
[0520]
本发明的化合物或其医药学上可接受的衍生物也可以在施用一种或多种其它治疗剂或生物活性剂、膳食补充剂或其任何组合同时、之前或之后施用。这种组合疗法包括施用含有本发明的化合物和一种或多种额外活性剂的单一医药剂量配方，以及施用在其自身的独立医药剂量配方中的本发明的化合物和每种活性剂。举例来说，可以将本发明的化合物和其它活性剂一起在诸如片剂或胶囊的单一口服剂量组合物中施用于患者，或在独立的口服剂量配方中施用每种试剂。在使用独立的剂量配方的情况下，本发明的化合物和一种或多种额外活性剂可以在基本上相同的时间(即，同时)，或在独立错开的时间(即，依序)施用；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
[0521]
举例来说，在某些实施方案中，本发明的医药组合物(或方法)中包括的额外生物活性剂选自例如维生素d2(麦角骨化醇)、维生素d3(胆骨化醇)、活性维生素d(骨化三醇)以及活性维生素d类似物(例如，度骨化醇、帕立骨化醇)。
[0522]
在其它特定实施方案中，本发明的医药组合物(或方法)中包括的额外生物活性剂是磷酸盐结合剂，诸如司维拉姆(例如，(碳酸司维拉姆)、(盐酸司维拉姆))、碳酸镧(例如，)、碳酸钙(例如，)、乙酸钙(例如，)、乙酸钙/碳酸镁(例如，)、mci-196、柠檬酸铁(例如，zerenex
tm
)、碱式碳酸镁铁(例如，fermagate
tm
)、氢氧化铝(例如，)、aps1585、sbr-759、pa-21，等等。
[0523]
在一些实施方案中，额外生物活性剂是肠钠依赖性磷酸盐转运体的抑制剂(napi2b抑制剂)。napi2b抑制剂的实例可以例如在国际申请号pct/us2011/043267、pct/us2011/043261、pct/us2011/043232、pct/us2011/043266和pct/us2011/043263以及美国专利号8,134,015中找到，其各自以全文引用的方式并入。
[0524]
在某些实施方案中，额外生物活性剂是烟酸或烟酰胺。
[0525]
在一些实施方案中，受试者患有ckd或正在治疗ckd，并且额外生物活性剂是用于治疗或管理ckd的化合物。这类化合物的实例包括高血压药物，诸如ace抑制剂、血管紧张素
ii受体阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、直接肾素抑制剂、利尿剂以及血管舒张剂；用以治疗ckd的症状和并发症的药物，诸如用于贫血症的促红细胞生成素疗法和/或铁替代疗法、用于电解质失衡的电解质、利尿剂、ace抑制剂和血管紧张素ii受体阻断剂、晚期糖基化终产物的抑制剂(例如，氨基胍、吡哆胺)以及维生素d；脂质降低剂，诸如hmg-coa(3-羟基-3-甲基-戊二酰基-coa)还原酶抑制剂或抑制素(例如，阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin))。
[0526]
应了解，在本发明描述中，所描绘式的取代基和/或变量的组合只有在这类贡献得到稳定或适度稳定的化合物时才是可允许的。
[0527]
本领域的技术人员还应了解，在本文所描述的过程中，中间化合物的官能团可能需要被适合的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基以及羧酸。羟基的适合保护基包括三烷基硅烷基或二芳基烷基硅烷基(例如，叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基或三甲基硅烷基)、四氢吡喃基、苯甲基等等。氨基、脒基以及胍基的适合保护基包括叔丁氧羰基、苯甲氧羰基等等。巯基的适合保护基包括-c(o)-r
″
(其中r
″
是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苯甲基、三苯甲基等等。羧酸的适合保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。保护基可以根据本领域的技术人员所知并且如本文所描述的标准技术添加或去除。保护基的使用详细描述于green，t.w.和p.g.m.wutz，protective groups in organic synthesis(1999)，第3版，wiley中。如本领域的技术人员应了解，保护基也可以是聚合物树脂，诸如王树脂(wang resin)、林克树脂(rink resin)或2-氯三苯甲基氯树脂。
[0528]
本领域的技术人员还应了解，尽管本发明化合物的这类受保护的衍生物按原样可能不具有药理学活性，但可以将其施用于哺乳动物并且此后在体内代谢以形成药理学上具活性的本发明化合物。因此，这类衍生物可以被描述为“前药”。本发明化合物的所有前药都包括于本发明的范围内。
[0529]
此外，以游离碱或酸形式存在的所有本发明化合物可以通过本领域的技术人员所知的方法用适当无机或有机碱或酸处理而转化成其医药学上可接受的盐。本发明化合物的盐可以通过标准技术转化成其游离碱或酸形式。
[0530]
iv.药物发现
[0531]
还包括涉及发现可以抑制胃肠道中的磷酸盐摄取的化合物的方法。特定实施方案包括药物筛选的体外方法，其采用细胞培养物，诸如肠细胞培养物，或细胞系，包括哺乳动物细胞系。
[0532]
因此，某些实施方案涉及筛选磷酸盐摄取的抑制剂的方法，其包括培养细胞，使经过培养的细胞与测试化合物接触，以及测量以下一者或多者：细胞的顶端表面处的ph、细胞的细胞内ph、细胞的碳酸氢盐分泌、细胞的酸分泌、水吸收和/或细胞的磷酸盐摄取。
[0533]
还包括鉴别作为磷酸盐摄取的抑制剂的测试化合物的步骤，其中以下一者或多者发生：细胞的顶端表面处的ph相对于对照增加，细胞的细胞内ph相对于对照减小，细胞的碳酸氢盐分泌相对于对照增加，细胞的酸分泌相对于对照减少，水吸收相对于对照减少，和/或细胞的磷酸盐摄取相对于对照减少。在一些方面，增加或减少是统计上显著的。术语“增加”和“减少”以及“统计上显著的”在本文别处描述。对照可以包括无化合物(例如，仅媒剂)或已知不具有上述活性中的任一者的化合物。对照还可以包括预定的参考值。
[0534]
在某些实施方案中，细胞是肠细胞。肠细胞培养物的非限制性实例包括肠细胞单层、类肠、以及肠细胞类器官。肠细胞单层可以根据本领域中的常规技术制备。肠细胞单层的非限制性实例包括细胞系，诸如caco-2、hct-8和t84细胞系(参看例如watson等，am j physiol cell physiol.281：c388-9，2001；shah等，biotechnol prog.22：186-9，2006)，以及新生仔猪空肠ipec-j2细胞单层(参看例如chapman等，pediatr res.72：576-82，2012)。
[0535]
术语“类肠”包括从来自肠组织的区段的肠隐窝获得的肠细胞培养物，其任选地维持肠组织的结构完整性(例如，肠上皮的三维结构)和细胞类型，并且复制初生肠组织的基因型和表型型态。类肠细胞培养物可以根据本领域中已知的技术制备(参看例如美国申请号2010/0047853；wo 2010/090513；美国申请号2012/0196312；以及wo 2012/168930)。
[0536]
术语“类器官”或“肠类器官”包括主要从前体细胞，诸如分离的胚胎干细胞、内胚层细胞或其它多能干细胞制得的肠细胞培养物。类器官可以例如通过前体细胞逐步分化成复杂的三维肠组织来制备(参看例如wo 2011/140441)，包括可以包含由包括类平滑肌层的间质包围的极化柱状上皮的肠组织。在一些方面，上皮图案化成具有肠的大多数(如果并非全部的话)主要功能细胞类型的类隐窝增生带和类绒毛结构。在一些方面，首先选择前体细胞或针对诸如lgr5和/或lgr6的标志物的表达进行富集。
[0537]
还包括包含全厚肠制剂的培养物(参看例如binder等，am j physiol.225：1232-1239，1973)以及通过药理学处理和浆肌结构“剥离”以使内在神经肌肉系统的影响降至最低的那些(参看例如clarke，am.j.physiol.gastrointestin.liver physiol.296：g1151-66，2009)。浆肌结构剥离去除浆膜(脏层腹膜)和肠壁的纵行/环行肌层，仅留下底层的粘膜下要素、肌肉残留物以及上皮。当采用尤斯室时，这些培养物可能特别适用。
[0538]
某些实施方案可以采用尤斯室。尤斯室提供生理系统以测量离子、营养素以及药物跨越诸如肠组织的各种上皮组织的转运(参看例如clarke等，同上)。举例来说，一些方法可以采用ph稳态技术以测量经上皮碳酸氢盐分泌和/或同位素通量法以测量底物的净分泌或吸收。在特定实施方案中，尤斯室适于与小鼠或大鼠肠一起使用，包括全厚肠制剂和通过浆肌结构剥离制备的那些(参看例如clarke等，同上)。
[0539]
某些筛选方法可以采用各种非肠细胞系，包括哺乳动物细胞系。例示性哺乳动物细胞系包括人胚肾细胞系(例如，hek 293细胞)；由sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；小鼠塞尔托利细胞(tm4)；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)；人子宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tr1细胞；mrc 5细胞；fs4细胞；以及人肝癌系(hep g2)。其它适用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞，以及骨髓瘤细胞系，诸如nso和sp2/0。
[0540]
用于测量ph、碳酸氢盐分泌、酸分泌、水吸收以及磷酸盐摄取的变化的技术在本领域中是已知的。举例来说，细胞内ph的变化可以通过使细胞或组织与ph敏感性荧光染料或探针接触并且测量染料或探针的荧光来测量。ph敏感性染料的实例包括2
″
，7
″‑
双(2-羧乙基)-5-(和-6-)羧基荧光素4(bcecf)、2
″
，7
″‑
双(2-羧丙基)-5-(和-6-)-羧基荧光素(bcpcf 11)、5-(和6)-羧基萘并荧光素，以及其它(参看例如图8a和8b；han和burgess，chem rev.110：2709-28，2010)。用于测量通过单离子通道、个别细胞以及完整上皮层的碳酸氢盐
转运(体外)的技术描述于例如hug等，methods mol biol.741：489-509，2011；feldman等，am.j.physiol.254：c383-90，1988中。如上文所提到，ph、碳酸氢盐分泌和/或酸分泌的变化也可以在尤斯室中测量，例如，使用ph稳态或同位素通量法。磷酸盐摄取可以例如通过使细胞或组织与
33
p标记的磷酸盐离子接触并且测量经过标记的磷酸盐离子的摄取来测量(参看实施例；matsuo等，eur.j.pharmacol.517：111-19，2005)。用于测量ph、碳酸氢盐分泌、酸分泌以及磷酸盐摄取的其它技术将为本领域的技术人员显而易见。
[0541]
在某些方面，测试化合物是已知或疑似在包括小肠的胃肠道中刺激碳酸氢盐分泌(例如，dbs)、抑制酸分泌和/或减少水吸收的小分子或肽。这类化合物的实例包括(但不限于)p2y激动剂、腺苷a2b受体激动剂、鸟苷酸环化酶c受体激动剂(例如，肽激动剂)、可溶性鸟苷酸环化酶激动剂、腺苷酸环化酶受体激动剂、咪唑啉-1受体激动剂、胆碱能激动剂、前列腺素ep4受体激动剂、多巴胺d1激动剂、褪黑素受体激动剂、5ht4激动剂、心房利钠肽受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂以及磷酸二酯酶抑制剂。这类化合物的非限制性实例在本文别处描述。在一些实施方案中，化合物是这类化物中的一者或多者的衍生物或类似物。如本文所描述，这类衍生物或类似物可以包括修饰，例如，以增加化合物的系统非生物可用性。
[0542]
还包括上述方法中的任一者或本领域中已知的其它筛选方法，其适于高通量筛选(hts)。如本文所描述，hts通常使用自动化来运作针对候选试剂的文库的试验筛选，例如，测量结合和/或活性的增加或减小的试验。
[0543]
本文所提供的筛选方法中的任一者可以利用小分子文库或由组合化学产生的文库。作为一个实例，这类文库可以用于筛选与靶分子缔合或相互作用或引发所需的生理反应(例如，减小肠细胞的细胞内ph，抑制磷酸盐摄取)的小分子。化学和/或生物混合物，诸如真菌、细菌或海藻提取物的文库在本领域中是已知的。分子文库的合成方法的实例可以在以下文献中找到：(carell等，1994a；carell等，1994b；cho等，1993；dewitt等，1993；gallop等，1994；zuckermann等，1994)。
[0544]
试剂的文库可以在溶液中(houghten等，1992)或在小珠上(lam等，1991)、在芯片(fodor等，1993)、细菌、孢子(ladner等，美国专利号5,223,409，1993)、质粒上(cull等，1992)或在噬菌体上(cwirla等，1990；devlin等，1990；felici等，1991；ladner等，美国专利号5,223,409，1993；scott和smith，1990)呈现。适用于本发明的目的的文库包括(但不限于)(1)化学文库，(2)天然产物文库，以及(3)由随机肽、寡核苷酸和/或有机分子组成的组合文库。
[0545]
化学文库由经由天然产物筛选鉴别为“标的”或“主导”的已知试剂的结构类似物组成。天然产物文库来源于微生物、动物、植物或海洋生物体的集合，其用于形成混合物以供通过以下方式筛选：(1)来自土壤、植物或海洋微生物的培养液的发酵和提取，或(2)植物或海洋生物体的提取。天然产物文库包括聚酮、非核糖体肽以及其变体(非天然存在的)。参看例如cane等，science 282：63-68，1998。组合文库可以由作为混合物的大量肽或有机化合物组成。其通过传统自动合成方法、pcr、克隆或专有合成方法相对容易地制备。
[0546]
更具体地说，组合化学文库是通过组合诸如试剂的许多化学“构筑基块”，通过化学合成或生物合成产生的多种化学剂的集合。举例来说，诸如多肽文库的线性组合化学文库是通过针对给定的化合物长度(即，多肽剂中的氨基酸数目)以每种可能的方式组合一组化学构筑基块(氨基酸)而形成。数百万化学剂可以经由化学构筑基块的这种组合混合来合
成。
[0547]
对于组合化学和由其创建的文库的评述，参看例如huc和nguyen，(2001)comb.chem.high throughput screen.4：53-74；lepre，(2001)drug discov.today 6：133-140；peng，(2000)biomed.chromatogr.14：430-441；bohm，h.j.和stahl，m.(2000)curr.opin.chem.biol.4：283-286；barnes和balasubramanian，(2000)curr.opin.chem.biol.4：346-350；lepre等，(2000)mass spectrom rev.19：139-161；hall，(2000)nat.biotechnol.18：262-262；lazo和wipf，(2000)j.pharmacol.exp.ther.293：705-709；houghten，(2000)ann.rev.pharmacol.toxicol.40：273-282；kobayashi(2000)curr.opin.chem.biol.(2000)4：338-345；kopylov spiridonova，(2000)mol.biol.(mosk)34：1097-1113；weber，(2000)curr.opin.chem.biol.4：295-302；dolle，(2000)j.comb.chem.2：383-433；floyd等，(1999)prog.med.chem.36：91-168；kundu等，(1999)prog.drug res.53：89-156；cabilly，(1999)mol.biotechnol.12：143-148；lowe，(1999)nat.prod.rep.16：641-651；dolle和nelson，(1999)j.comb.chem.1：235-282；czarnick和keene，(1998)curr.biol.8：r705-r707；dolle，(1998)mol.divers.4：233-256；myers，(1997)curr.opin.biotechnol.8：701-707；以及pluckthun和cortese，(1997)biol.chem.378：443。
[0548]
用于制备组合文库的装置是可商购的(参看例如357mps，390mps，advanced chem tech，louisville ky.，symphony，rainin，woburn，mass.，433a applied biosystems，foster city，calif.，9050plus，millipore，bedford，mass.)。另外，众多组合文库本身是可商购的(参看例如comgenex，princeton，n.j.，asinex，moscow，ru，tripos，inc.，st.louis，mo.，chemstar，ltd.，moscow，ru，3d pharmaceuticals，exton，pa.，martek biosciences，columbia，md.，等等)。
[0549]
定义和术语
[0550]“氨基”指的是-nh2基团。
[0551]“氨基羰基”指的是-c(＝o)nh2基团。
[0552]“羧基”指的是-co2h基团。“羧酸盐(酯)”指的是其盐或酯。
[0553]“氰基”指的是-cn基团。
[0554]“羟基(hydroxy/hydroxyl)”指的是-oh基团。
[0555]“亚氨基”指的是＝nh基团。
[0556]“硝基”指的是-no2基团。
[0557]“氧代”或“羰基”指的是＝o基团。
[0558]“硫代”指的是＝s基团。
[0559]“胍基”(或“胍”)指的是-nhc(＝nh)nh2基团。
[0560]“脒基”(或“脒”)指的是-c(＝nh)nh2基团。
[0561]“磷酸酯”指的是-op(＝o)(oh)2基团。
[0562]“膦酸酯”指的是-p(＝o)(oh)2基团。
[0563]“亚膦酸酯”指的是-ph(＝o)oh基团，其中每个ra独立地是如本文所定义的烷基。
[0564]“硫酸酯”指的是-os(＝o)2oh基团。
[0565]“磺酸酯”或“羟基磺酰基”指的是-s(＝o)2oh基团。
[0566]“亚磺酸酯”指的是-s(＝o)oh基团。
[0567]“磺酰基”指的是包含-so
2-基团的部分。举例来说，“烷基磺酰基”或“烷基砜”指的是-so
2-ra基团，其中ra是如本文所定义的烷基。
[0568]“烷基”指的是仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其为饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或三键)，具有一个至十二个碳原子(c
1-12
烷基)，优选地一个至八个碳原子(c
1-c8烷基)或一个至六个碳原子(c
1-c6烷基)，并且由单键附接至分子的其余部分，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1，4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等等。除非本说明书中另有特别规定，否则烷基可以任选地被取代。
[0569]“亚烷基”或“亚烷基链”指的是仅由碳和氢组成的将分子的其余部分连接至自由基的直链或支链二价烃链，其为饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或三键)，并且具有一个至十二个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、亚正丁炔基等等。烷基链经由单键或双键附接至分子的其余部分并且经由单键或双键附接至自由基。亚烷基链与分子的其余部分和自由基的附接点可以经由链内的一个碳或任何两个碳。除非本说明书中另有特别规定，否则亚烷基链可以任选地被取代。
[0570]“烷氧基”指的是式-ora的基团，其中ra是如上文所定义的含有一个至十二个碳原子的烷基。除非本说明书中另有特别规定，否则烷氧基可以任选地被取代。
[0571]“烷基氨基”指的是式-nhra或-nrara的基团，其中每个ra独立地是如上文所定义的含有一个至十二个碳原子的烷基。除非本说明书中另有特别规定，否则烷基氨基可以任选地被取代。
[0572]“硫烷基”指的是式-sra的基团，其中ra是如上文所定义的含有一个至十二个碳原子的烷基。除非本说明书中另有特别规定，否则硫烷基任选地被取代。
[0573]“芳基”指的是包含氢、6至18个碳原子以及至少一个芳香族环的烃环系统基团。出于本发明的目的，芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连环系统。芳基包括(但不限于)来源于苯并苊、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘以及苯并菲的芳基。除非本说明书中另有特别规定，否则术语“芳基”或前缀“芳
‑”
(诸如在“芳烷基”中)意欲包括任选地被取代的芳基。
[0574]“芳烷基”指的是式-r
b-rc的基团，其中rb是如上文所定义的亚烷基链并且rc是如上文所定义的一个或多个芳基，例如，苯甲基、二苯基甲基等等。除非本说明书中另有特别规定，否则芳烷基可以任选地被取代。
[0575]“环烷基”或“碳环”指的是仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳香族单环或多环烃基，其可以包括稠合或桥连环系统，具有三个至十五个碳原子，优选地具有三个至十个碳原子，并且是饱和或不饱和的并且由单键附接至分子的其余部分。单环基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基以及环辛基。多环基团包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7，7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等等。除非本说明书中另有特别规定，否则环烷基可以任选地被取代。
[0576]“环烷基烷基”指的是式-rbrd的基团，其中rd是如上文所定义的亚烷基链并且rg是如上文所定义的环烷基。除非本说明书中另有特别规定，否则环烷基烷基可以任选地被取代。
[0577]“稠合”指的是稠合至本发明化合物中的现有环结构的本文所描述的任何环结构。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时，成为稠合杂环基环或稠合杂芳基环的一部分的现有环结构上的任何碳原子可以被氮原子置换。
[0578]“卤基”或“卤素”指的是溴、氯、氟或碘。
[0579]“卤烷基”指的是被一个或多个如上文所定义的卤基取代的如上文所定义的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2，2，2-三氟乙基、1，2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1，2-二溴乙基等等。除非本说明书中另有特别规定，否则卤烷基可以任选地被取代。
[0580]“杂环基”或“杂环”指的是稳定的3元至18元非芳香族环基团，其由两个至十二个碳原子和一个至六个选自由氮、氧以及硫组成的群组的杂原子组成。除非本说明书中另有特别规定，否则杂环基可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连环系统；并且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化；并且杂环基可以是部分或完全饱和的。这类杂环基的实例包括(但不限于)二氧杂环戊烷基、噻吩基[1，3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异恶唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、恶唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基以及1，1-二氧代-硫代吗啉基。除非本说明书中另有特别规定，否则杂环基可以任选地被取代。
[0581]“n-杂环基”指的是如上文所定义的杂环基，其含有至少一个氮并且杂环基与分子的其余部分的附接点是经由杂环基中的氮原子。除非本说明书中另有特别规定，否则n-杂环基可以任选地被取代。
[0582]“杂环基烷基”指的是式-rbre的基团，其中rb是如上文所定义的亚烷基链并且re是如上文所定义的杂环基，并且如果杂环基是含氮杂环基，那么杂环基可以在氮原子处附接至烷基。除非本说明书中另有特别规定，否则杂环基烷基可以任选地被取代。
[0583]“杂芳基”指的是5元至14元环系统基团，其包含氢原子、一个至十三个碳原子、一个至六个选自由氮、氧以及硫组成的群组的杂原子，以及至少一个芳香族环。出于本发明的目的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连环系统；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。实例包括(但不限于)氮呯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并恶唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1，4]二氧呯基、1，4-苯并二恶烷基、苯并萘并呋喃基、苯并恶唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(benzothienyl/benzothiophenyl)、苯并三唑基、苯并[4，6]咪唑并[1，2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、吲哚嗪基、异恶唑基、萘啶基、恶二唑基、2-氧氮呯基、恶唑基、环氧乙烷基、1-氧离子基吡啶基、1-氧离子基嘧啶基、1-氧离子基吡嗪基、1-氧离子基哒嗪基、1-苯基-1h-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶
基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹恶啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基以及噻吩基(thiophenyl/thienyl)。除非本说明书中另有特别规定，否则杂芳基可以任选地被取代。
[0584]“n-杂芳基”指的是如上文所定义的杂芳基，其含有至少一个氮并且杂芳基与分子的其余部分的附接点是经由杂芳基中的氮原子。除非本说明书中另有特别规定，否则n-杂芳基可以任选地被取代。
[0585]“杂芳基烷基”指的是式-rbrf的基团，其中rb是如上文所定义的亚烷基链并且rf是如上文所定义的杂芳基。除非本说明书中另有特别规定，否则杂芳基烷基可以任选地被取代。
[0586]
本文所用的术语“被取代”意指上述基团中的任一者(即，烷基、亚烷基、烷氧基、烷基氨基、硫烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、n-杂芳基和/或杂芳基烷基)，其中至少一个氢原子经由键置换成非氢原子，诸如(但不限于)：卤素原子，诸如f、cl、br以及i；诸如羟基、羧基、磷酸酯基、硫酸酯基、烷氧基以及酯基的基团中的氧原子；诸如硫醇基、硫烷基、亚磺酸酯基、砜基、磺酰基以及亚砜基的基团中的硫原子；诸如亚膦酸酯基和膦酸酯基的基团中的磷原子；诸如胍基、胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、n-氧化物、酰亚胺以及烯胺的基团中的氮原子；诸如三烷基硅烷基、二烷基芳基硅烷基、烷基二芳基硅烷基以及三芳基硅烷基的基团中的硅原子；以及各种其它基团中的其它杂原子。“被取代”也意指上述基团中的任一者，其中一个或多个氢原子经由更高级键(例如，双键或三键)置换成杂原子，诸如氧代、羰基、羧基以及酯基中的氧；以及诸如亚胺、肟、腙以及腈的基团中的氮。举例来说，“被取代”包括上述基团中的任一者，其中一个或多个氢原子被以下置换：-nrgrh、-nrgc(＝o)rh、-nrgc(＝o)nrgrh、-nrgc(＝o)orh、-nrgso2rh、-oc(＝o)nrgrh、-org、-srg、-sorg、-so2rg、-oso2rg、-so2org、＝nso2rg以及-so2nrgrh。“被取代”也意指上述基团中的任一者，其中一个或多个氢原子被以下置换：-c(＝o)rg、-c(＝o)org、-c(＝o)nrgrh、-ch2so2rg、-ch2so2nrgrh、-(ch2ch2o)
1-10
rg、-(ch2ch2o)
2-10
rg、-(och2ch2)
1-10
rg以及-(och2ch2)
2-10
rg。在前述内容中，rg和rh是相同或不同的并且独立地是氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、n-杂芳基和/或杂芳基烷基。“被取代”进一步意指上述基团中的任一者，其中一个或多个氢原子经由键置换成氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤基、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、n-杂芳基和/或杂芳基烷基。上述非氢基团在本文中一般被称作“取代基”或“非氢取代基”。另外，前述取代基中的每一者也可以任选地被上述取代基中的一者或多者取代。
[0587]
冠词“一(a/an)”在本文中用于指这个冠词的语法宾语中的一者或多于一者(即，至少一者)。举例来说，“元件”意指一个元件或多于一个元件。
[0588]“约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度对比参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、长度或本文所描述的其它单位变化至多30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0589]
术语“活化”指的是应用物理、化学或生物化学条件、物质或过程以使受体(例如，孔隙受体)以允许离子、分子或其它物质通过的方式发生结构变化。
[0590]
术语“活性状态”指的是受体处于其非静止状况中的状态或状况。
[0591]“外流”指的是离子、分子或其它物质从细胞内空间向细胞外空间移动或流出。
[0592]“肠内”或“经肠”施用指的是经由胃肠道施用，包括经口、舌下、唇下、经颊以及经直肠施用，并且包括经由胃或十二指肠饲管施用。
[0593]
术语“非活性状态”指的是受体处于其原始内源状态，即其静止状态中的状态。
[0594]
术语“调节”包括通常以与对照相比统计上显著或生理上显著的量“增加”或“提高”以及“减少”或“降低”。“增加”或“提高”的量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括由对照(例如，不存在或更少量的化合物、不同化合物或处理)产生的量，或更早时间点(例如，在用化合物处理之前)的量的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.3、4.4、4.6、4.8、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50倍或更大倍数(例如，100、200、500、1000倍)(包括介于之间并且大于1的所有整数和小数点以及范围，例如，5.5、5.6、5.7、5.8等等)的增加。“减少”或“降低”的量通常是“统计上显著的”量，并且可以包括由对照(例如，不存在或更少量的化合物、不同化合物或处理)产生的量或活性，或更早时间点(例如，在用化合物处理之前)的量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的减少(包括介于之间的所有整数和小数点以及范围)。
[0595]“前药”意欲指示可以在生理条件下或通过溶剂分解转化成本发明的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”指的是医药学上可接受的本发明化合物的代谢前体。前药当施用于有需要的受试者时可以是非活性的，但在体内转化成本发明的活性化合物。前药通常在体内快速转化以得到本发明的母体化合物，例如，通过在血液中水解。前药化合物通常提供溶解度、组织相容性或在哺乳动物生物体中延迟释放的优点(参看bundgard，h.，design of prodrugs(1985)，第7-9页，第21-24页(elsevier，amsterdam))。前药的论述提供于higuchi，t.等，a.c.s.symposium series，第14卷中和bioreversible carriers in drug design，edward b.roche编，american pharmaceutical association and pergamon press，1987中。
[0596]
术语“前药”还意欲包括任何共价键结的载剂，当将这种前药施用于哺乳动物受试者时载剂在体内释放本发明的活性化合物。本发明化合物的前药可以通过以如下方式修饰存在于本发明的化合物中的官能团来制备：这些修饰在常规操纵中或在体内裂解得到本发明的母体化合物。前药包括羟基、氨基或巯基键结至任何基团的本发明化合物，当将本发明化合物的前药施用于哺乳动物受试者时，这种基团分别裂解形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括(但不限于)本发明化合物中的胺官能团的醇或酰胺衍生物的乙酸酯、甲酸酯以及苯甲酸酯衍生物等等。
[0597]
本文所公开的发明内容还意欲涵盖所公开的化合物的体内代谢产物。这类产物可以从例如所施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等等得到，这主要归因于酶促过程。因此，本发明包括通过包括将本发明的化合物施用于哺乳动物持续一段足以得到其代谢产物的时间的过程产生的化合物。这类产物通常通过将本发明的放射性标记化合物以可检测的剂量施用于诸如大鼠、小鼠、天竺鼠、猴的动物或施用于人类，允许经过足够的时间以使代谢发生，以及从尿液、血液或其它生物样品中分离其转化产物来鉴别。
[0598]“哺乳动物”包括人类以及家畜，诸如实验动物和家庭宠物(例如，猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)，与非家畜，诸如野生动物等等。
[0599]“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，并且这个描述包括所述事件或情形发生的情况和其不发生的情况。举例来说，“任选地被取代的芳基”意指芳基可能被或可能不被取代并且这个描述包括被取代的芳基与不具有取代的芳基。
[0600]“医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包括(但不限于)如可接受用于人类或家畜的已经由美国食品和药物管理局(united states food and drug administration)核可的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等张剂、溶剂或乳化剂。
[0601]“医药学上可接受的盐”包括酸加成盐与碱加成盐。
[0602]“医药学上可接受的酸加成盐”指的是保留游离碱的生物有效性和性质，在生物学上或其它方面不会不合需要，并且与以下酸形成的那些盐：无机酸，诸如(但不限于)盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；以及有机酸，诸如(但不限于)乙酸、2，2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1，2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、萘-1，5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等等。
[0603]“医药学上可接受的碱加成盐”指的是保留游离酸的生物有效性和性质，在生物学上或其它方面不会不合需要的那些盐。这些盐从无机碱或有机碱与游离酸的加成来制备。来源于无机碱的盐包括(但不限于)钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。优选的无机盐是铵、钠、钾、钙以及镁盐。来源于有机碱的盐包括(但不限于)以下的盐：伯胺、仲胺以及叔胺、被取代的胺(包括天然存在的被取代的胺)、环胺以及碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、葡甲胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺树脂等等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱以及咖啡碱。
[0604]
结晶通常产生本发明化合物的溶剂化物。如本文所用的术语“溶剂化物”指的是包含本发明化合物的一个或多个分子与溶剂的一个或多个分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等等，以及对应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明的化合物可以仅保留不定水或是水加上一些不定溶剂的混合物。
[0605]“医药组合物”指的是本发明的化合物和在本领域中一般公认用于递送生物活性
化合物至哺乳动物(例如，人类)的介质的配方。这样的介质包括用于此的所有医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
[0606]
本发明的化合物或其医药学上可接受的盐可以含有一个或多个不对称中心并且因此可以产生对映体、非对映体以及其它立体异构形式，其可以依据绝对立体化学定义为(r)-或(s)-，或对于氨基酸定义为(d)-或(l)-。本发明意欲包括所有这类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性( )和(-)、(r)-和(s)-或(d)-和(l)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如色谱法和分步结晶来解析。用于个别对映体的制备/分离的常规技术包括从适合的光学纯前体进行手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(hplc)解析外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。当本文所描述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，并且除非另有规定，否则预期化合物包括e与z几何异构体。同样地，还预期包括所有互变异构形式。
[0607]“稳定化合物”和“稳定结构”意欲指示足够稳固以从反应混合物中分离至适用的纯度并且配制成有效治疗剂后仍存在的化合物。
[0608]“统计上显著的”意指结果不可能偶然发生。统计显著性可以通过本领域中已知的任何方法确定。显著性的常用量度包括p值，其为如果无效假设是真的，那么所观测的事件将发生的频率或概率。如果所获得的p值小于显著性水平，那么拒绝无效假设。在简单的情况下，显著性水平定义为0.05或更小的p值。
[0609]“实质上”或“基本上”包括接近全部或完全，例如，一定给出量的80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大。
[0610]
术语“继发性”指的是可以与另一种疾病病况、病状或处理一起发生，可以继另一种疾病病况、病状或处理之后发生，或可以由另一种疾病病况、病状或处理引起的病状或病况。这个术语还指的是疾病病况、病状或处理可以在形成患者的最终疾病病况、症状或病状的症状或反应中仅起到次要作用的情况。
[0611]
需要用本公开的化合物治疗的“受试者”或“患者”(这些术语在本文中可互换使用)包括例如“需要降低磷酸盐”的受试者，其可以包括需要“磷酸盐管理”，例如磷酸盐或磷水平的预防性管理的受试者。包括患有本文所描述的疾病和/或病状或处于患有本文所描述的疾病和/或病状的风险下的哺乳动物，特别是可以在存在或不存在其它活性剂的情况下用本发明的化合物治疗，以达成有益的治疗和/或预防结果的疾病和/或病状。有益的结果包括症状的严重性降低、症状的发作延迟、维持正常磷酸盐血、发展成高磷酸盐血症的风险降低、调节本文所描述的一个或多个指标(例如，患有高磷酸盐血症或处于高磷酸盐血症风险下的患者的血清或血液中的磷水平降低、患有高磷酸盐血症或处于高磷酸盐血症风险下的患者中的磷酸盐离子的粪便输出量增加)、寿命增加和/或疾病或病状更快速或更完全消退。
[0612]“立体异构体”指的是由相同键键结的相同原子组成，但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明涵盖各种立体异构体和其混合物并且包括“对映体”，其指的是分子是彼此的不可重叠镜像的两个立体异构体。
[0613]“互变异构体”指的是从分子的一个原子至相同分子的另一个原子的质子位移。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。
[0614]“治疗有效量”或“有效量”包括本发明的化合物当施用于哺乳动物(优选地人类)
时足以抑制或以其它方式减少磷酸盐离子从胃肠腔的转运，增加磷酸盐离子的粪便输出量，降低磷酸盐离子的血清水平，治疗哺乳动物(优选地人类)的高磷酸盐血症和/或治疗本文所描述的任何一种或多种其它病状的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将取决于化合物、病状和其严重性、施用方式以及所治疗的哺乳动物的年龄而变化，但可以由本领域的一般技术人员考虑到其自己的知识和本公开来常规地确定。
[0615]
如本文所用的“治疗(treat/treatment)”涵盖患有所关注的疾病或病状的哺乳动物(优选地人类)中的所关注的疾病或病状的治疗，并且包括：
[0616]
(i)预防疾病或病状在哺乳动物中发生，特别是在这种哺乳动物易患上病状，但尚未诊断为患有病状时；
[0617]
(ii)抑制疾病或病状，即，遏制其发展；
[0618]
(iii)减轻疾病或病状，即，促使疾病或病状衰退；或
[0619]
(iv)减轻由疾病或病状产生的症状，即，减轻疼痛而不会解决潜在的疾病或病状。如本文所用的术语“疾病”和“病状”可以互换使用或不同之处可以为特定的疾患或病状可能不具有已知的病原体(因而尚未研究出病源)并且因此其尚未被认为是疾病，而仅仅是不合需要的病状或综合症，其中或多或少的一组特定症状已经由临床医师鉴别。
[0620]
实施例
[0621]
实施例1
[0622]
增加的细胞内ph使得细胞中的磷酸盐摄取减少
[0623]
进行实验以测试细胞内ph的变化与人胚肾细胞(hek-293细胞)中磷酸盐离子(pi)的摄取之间的关系。
[0624]
将hek-293细胞以25,000个细胞/孔接种至96孔板中并且培养过夜。然后用大鼠或人类nap2b cdna转染细胞，或使用转脂胺2000(lipofectamine 2000)(invitrogen)假转染(无dna)。在第二次过夜孵育期间使细胞接近汇合。
[0625]
使用铵脉冲程序使细胞内ph从约7.4降至约6.8。从孔中抽出培养基，用nacl-hepes缓冲液(100mm nacl、50mm hepes、10mm葡萄糖、5mm kcl、2mm cacl2、1mm mgcl2，ph 7.4)洗涤细胞两次，然后在室温下与含有5μm bcecf-am的nh4cl-hepes缓冲液(20mm nh4cl、80mm nacl、50mm hepes、5mm kcl、2mm cacl2、1mm mgcl2，ph 7.4)一起孵育30分钟。用无铵、无na

的hepes(100mm胆碱、50mm hepes、10mm葡萄糖、5mm kcl、2mm cacl2、1mm mgcl2，ph 7.4)洗涤细胞两次，并且在室温下在相同缓冲液中孵育10分钟以降低细胞内ph。细胞内ph降至约ph 6.8通过监测针对ph不敏感性bcecf荧光(λex 439nm，λem 538nm)标准化的bcecf荧光(λex 505nm，λem 538nm)的ph敏感性变化来验证。包括省略铵脉冲程序的对照，并且bcecf用于显示7.4的正常细胞内ph。
[0626]
然后用无钠摄取缓冲液(14mm tris、137mm氯化胆碱、5.4mm kcl、2.8mm cacl2、1.2mm mgso4、100μm kh2po4、1mg/ml牛血清白蛋白，ph 7.4)洗涤细胞，并且通过用含钠摄取缓冲液(14mm tris、137mm氯化钠、5.4mm kcl、2.8mm cacl2、1.2mm mgso4、100μm kh2po4、1mg/ml牛血清白蛋白，ph 7.4)覆盖细胞来起始
33
p摄取。对于用大鼠或人类nap2b转染的细胞系，用pit沉默剂抑制内源pit活性，以使得钠依赖性
33
p摄取仅归因于nap2b。对假转染的细胞不使用pit沉默剂，因此钠依赖性
33
p仅归因于pit。
[0627]
在存在和不存在5μm eipa(nhe1的特异性抑制剂)的情况下测量
33
p的摄取。在室温
下23分钟后，去除试验混合物，并且用冰冷的无钠摄取缓冲液洗涤细胞两次。通过添加20μl 0.1％tween 80、继之以100μl闪烁流体使细胞溶解，并且使用topcount(perkin elmer)计数。
[0628]
如图22a-22c中所示，细胞内酸化引起pit(22a)或napi2b(22b-22c)介导的
33
p摄取减少＞75％。阻断nhe1介导的质子从细胞质输出的eipa也引起未进行预处理以降低细胞内ph的细胞中的pi摄取的小而显著的减少。
[0629]
实施例2
[0630]
鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂减少磷酸盐吸收
[0631]
进行实验以确定鸟苷酸环化酶c(gc-c)受体激动剂是否可以减少如由
33
p摄取测量的小肠中的磷酸盐吸收/摄取。用
33
p和利那洛肽同时向大鼠给药，如下所示：
[0632]
1.媒剂(n＝5/组)
[0633]
2. 0.1mg/kg的利那洛肽(n＝6/组)
[0634]
3. 0.3mg/kg的利那洛肽(n＝4/组)
[0635]
在
33
p施用后5、15、30、45以及60分钟收集血液并且进行血浆闪烁计数。结果示于图1a-1b中。图1a示出了使用重复测量的双因素anova、继之以邓奈特氏多重比较检验(dunnett
′
s multiple comparison test)的结果，并且图1b示出了单因素anova、继之以邓奈特氏多重比较检验的结果。这些结果显示，两个剂量的利那洛肽都减少胃肠道中磷酸盐的吸收。
[0636]
实施例3
[0637]
i1受体激动剂和腺苷酸环化酶激动剂减少磷酸盐吸收
[0638]
进行实验以确定其它种类的药物是否可以减少如由
33
p摄取测量的小肠中的磷酸盐吸收/摄取。用
33
p和咪唑啉亚型1(i1)受体激动剂(莫索尼定)或腺苷酸环化酶激动剂(水溶性佛司可林类似物nkh477)同时向大鼠给药，如下所示：
[0639]
1.媒剂
[0640]
2. 2mg/kg的莫索尼定
[0641]
3. 6mg/kg的莫索尼定
[0642]
4. 1mg/kg的nkh477
[0643]
5. 3mg/kg的nkh477
[0644]
在
33
p施用后5、15、30、45以及60分钟收集血液并且进行血浆闪烁计数。结果示于图2a-2b中。图2a示出了使用重复测量的双因素anova、继之以邓奈特氏多重比较检验的结果，并且图2b示出了单因素anova、继之以邓奈特氏多重比较检验的结果。这些结果显示，所有测试化合物在15分钟时都显著减少
33
p摄取/吸收。
[0645]
实施例4
[0646]
a2b激动剂和p2y2激动剂减少磷酸盐吸收
[0647]
进行实验以确定通过不同机制增加细胞内钙(ca

)是否也可以减少如由
33
p摄取测量的小肠中的磷酸盐吸收。用
33
p和测试化合物同时向大鼠给药，如下所示：
[0648]
1.媒剂，n＝6
[0649]
2. 10mg/kg的bay 60-6583(腺苷a2b激动剂)
[0650]
3. 15mg/kg的up4u(p2y2受体激动剂)
[0651]
在
33
p施用后5、15、30、45以及60分钟收集血液并且进行血浆闪烁计数。图3示出了p2y2受体激动剂up4u(15mg/kg)显著减少
33
p摄取/吸收。
[0652]
实施例5
[0653]
对大鼠中的急性磷酸盐摄取的药效学作用
[0654]
测试化合物减少在施用于大鼠中的消化道之后循环放射性标记磷酸盐的出现的能力。大鼠血液中放射性标记磷酸盐示踪剂积聚的速率被视为来自胃肠道的磷酸盐膳食的肠吸收速率的替代者。为此，在将磷酸盐示踪剂膳食连同实例化合物一起胃内共同施用于大鼠之后监测循环放射性标记磷酸盐。然而，因为所测试的一些化合物潜在地具有可能阻碍这个试验的性质，诸如具有假定胃肠蠕动效应(例如，延迟胃排空)或有目的地在胃肠道中化学上不稳定，所以有时也进行磷酸盐示踪剂大丸药的直接十二指肠内施用。
[0655]
8周龄的雄性斯普拉格-杜勒大鼠(sprague-dawley rat)购自查尔斯河实验室(charles river laboratories)(hollister，ca)。为了能够进行血液取样，大鼠与由供应商手术植入颈静脉中的导管一起购买。对于需要十二指肠内施用的研究，由供应商手术植入额外的导管以允许直接输注至十二指肠腔。向大鼠喂饲含有0.65％p、1％ca以及1.5iu/g维生素d3的正常的基于谷物的食物(harlan teklad，madison，wi；2018 teklad global 18％蛋白质啮齿动物膳食)并且随意提供水引导至研究。
[0656]
在过夜禁食之后，向大鼠施用含有[
33
p]正磷酸盐(perkinelmer，waltham，ma)作为示踪剂的磷酸盐溶液，而存在或不存在以所指示的剂量分散于溶液中的测试物品。这种给药溶液通常含有8mm磷酸二氢钠(1.25μci[
33
p]正磷酸盐/μmol)、4mm氯化钙、0.4％羟丙基甲基纤维素(w/v)以及2％二甲亚砜(w/v)。在水中制备给药溶液用于以10ml/kg胃内管饲，并且如果使用先前植入的导管以5ml/kg作为大丸药十二指肠内施用，那么在盐水中制备。
[0657]
在给药后从清醒大鼠经由植入的导管从颈静脉对血液进行取样，并且通过闪烁计数来测定与所得血浆相关的放射性同位素。使用总循环血浆的体重估算来评估从所施用的剂量至血浆的磷酸盐摄取的相对量。参看bijsterbosch等，experientia.37：381-382，1981(相对于体重的威斯塔大鼠(wistar rat)的血浆体积)。对于每个组(n＝6)在给药后15分钟时磷酸盐摄取的比较量以相对于研究媒剂组(n＝6)的百分比表示为平均值
±
sem。通过单因素方差分析、继之以邓奈特氏事后检验(dunnett
′
s posthoc test)来确定与媒剂组的平均值相比每个测试组的平均值的统计比较，并且p＜0.05被公认为统计上显著的(ns，不显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；以及***，p＜0.001)。
[0658]
用胃内给药测试实例化合物的研究的结果概述于下表e1中。
[0659][0660][0661]
用十二指肠内给药测试实例化合物的研究的结果在下表e2中。
[0662][0663]
作为a2b受体激动剂、碳酸酐酶抑制剂、多巴胺d1受体激动剂、咪唑啉i1受体激动剂、鸟苷酸环化酶2c激动剂、mt2褪黑素受体激动剂、no释放剂、可溶性鸟苷酰环化酶活化剂以及佛司可林的可溶性类似物的实例的测试化合物全部个别地显著减少磷酸盐从经胃递送的膳食的急性摄取。另外，确定直接向小肠的十二指肠给药的佛司可林的可溶性类似物抑制从共同施用的测试大丸药的磷酸盐摄取。
[0664]
实施例6
[0665]
尤斯室
[0666]
从麻醉的动物中立即移出十二指肠和空肠的区段并且沿着肠系膜线打开并且固定于最上面有粘膜表面的pyrex板上。将上皮组织从肌肉层剥离并且安置于具有100mm2的暴露面积的电脑控制尤斯室(national physiology instrument，california)中。将组织的两侧与13ml含有(mmol/l)nacl 125.4、kcl 5.4、cacl
2 1.2、nahco
3 21、nahpo 0.3、nah2po
4 1.2的等张缓冲溶液(ph 6.0或ph7.4)一起孵育。将用响应茶碱(10mm浆膜)或葡萄糖(10mm粘膜)或l-丙氨酸(5mm粘膜)的短路电流(i
sc
)的测量来确保在通量测量的开始和结束时组织的功能可行性和完整性。
[0667]
对于单向pi通量率(j
ms
：从粘膜至浆膜侧的通量，j
sm
：相反方向的通量)的计算，将185kbq[
33
p]-正磷酸盐(370mbq/ml，perkin-elmer)和测试化合物添加至组织的一侧。在稍后的20分钟从标记侧并且随后以至少三个10分钟时间间隔从尤斯室的未标记侧(0.5ml)获取样品(0.1ml)。从未标记侧获取的所有样品用等体积的等渗浸浴流体置换。净通量(j净)以电导相差不超过25％的成对组织的j
ms
与j
sm
之间的差异计算。在另一个系列的实验中，在添加砷酸盐(粘膜)或乌巴因(浆膜)至浸浴溶液中之前和之后完成通量测量。在topcount(perkin elmer)液体闪烁计数器中测量放射性测量值。
[0668]
实施例7
[0669]
体外-离体试验
[0670]
从使用戊巴比妥钠(pentobarbitone sodium)麻醉的动物中移出十二指肠和空肠的区段(5cm)，用冰冷的0.9％盐水冲洗并且在玻璃棒上翻转。将样品紧固地安置于棒上，并且然后在37℃下在含有以下(mm)的氧化缓冲液(ph 7.4或6.0)中预孵育5分钟：羟乙基哌嗪-n
′‑
2-乙磺酸16、葡萄糖10、kcl 3.5、mgso
4 10、cacl
2 1、nacl 125，继而在含有100mm 33
pi(
33
pi特异性活性1.85mbq/ml)和测试化合物的相同缓冲液中孵育2分钟。使用磁性跳蚤(magnetic flea)快速搅拌缓冲液以使粘膜表面处静态水层的影响降至最低。
[0671]
通过在室温下使组织暴露于含有10倍过量的非放射性磷酸盐的磷酸盐缓冲盐水持续10分钟来终止摄取。这个程序后继之以在室温下在磷酸盐缓冲盐水中再洗涤10分钟，并且然后吸干样品并记录重量。在二羟丙酮(protosol)(perkinelmer)中消化样品过夜。消
化的样品和初始摄取溶液的闪烁计数允许计算组织的磷酸盐滞留(nmol/g)。
[0672]
实施例8
[0673]
基于标靶的筛选试验
[0674]
肠管受体的活化可以引起信号传导，其促使直接或间接抑制磷酸盐吸收(例如，通过改变肠管的腔膜的局部ph)。化合物与这些标靶相互作用的能力的测量可以使用异源表达所关注的标靶的商业细胞系来实现。这些细胞系通常可从公司获得，诸如perkin elmer或multispan。或者，还通常使用表达所关注的标靶的初级细胞。
[0675]
假定配体的相互作用的测量可以通过两种方法中的任一者来实现(参看下表e3)：(1)替代来自完整细胞或从这类细胞制备的膜的放射性同位素标记的标准配体，或(2)测量在用测试化合物处理后的第二信使产生。对于第二信使的测量，众多商业试剂盒可用于测量细胞内camp、cgmp(例如，来自cis bio)以及钙(例如，来自molecular devices的钙6染料)。
[0676][0677]
在直接影响可溶性酶的活性的情况下，可以采用酶试验，其中使用纯化的酶制剂并且监测酶促反应的产物(参看下表e4)。
[0678][0679]
实施例9
[0680]
抑制肠钠和磷酸盐吸收
[0681]
为了评估所选的实例化合物抑制磷酸盐从肠腔吸收的能力，在大鼠中测量磷酸盐的摄入与排泄平衡。八周大的斯普拉格-杜勒大鼠购自查尔斯河实验室(hollister，ca)，并且在自由获取食物和水的情况下适应至少6天。在这段时间期间并且在整个研究中，可以向大鼠喂饲标准膳食(harlan teklad，madison，wi；2018 teklad global 18％蛋白质啮齿动物膳食)或由0.6％ca和0.35％或0.6％磷组成的纯化的蛋清合成膳食(harlan teklad；分
别是td.84122和td.130318)。
[0682]
在起始研究前一天，在自由获取水和上文所列的粉末状型式的膳食的情况下使大鼠适应个别的代谢笼。基于大鼠食物的每日质量已经确定消耗，在开始至黑暗期之前约1小时经口以10ml/kg有效剂量的测试物品或经由药物混合的食物向动物给药。在两种给药模式下，使每只大鼠在其圈养于代谢笼中的每一天自由获取水和粉末状食物的等分试样，对于相同类型的大鼠(即，8周龄的雄性大鼠平均消耗18g/d的上文所列的纯化膳食)，这个等分试验是那种类型的食物的随意消耗量的每日平均值。这是为了减小可变性并简化后续的24小时消耗和排泄测量。连续1至4天追踪每日水和食物消耗测量以及每日尿液和粪便收集。
[0683]
通过离子色谱法测定尿液样品的磷酸盐、钠以及钾含量。通过重量体积测定，继而用6n hcl酸化来加工尿液样品。简单地离心(3,600
×
g)酸化的样品，并且然后用10mm hcl稀释上清液。在注射于离子交换色谱系统(dionex ics-3000)上之前过滤稀释的样品、校准用标准(sigma/fluka analytical)以及qc样品(内部制备的标准)。使用由25mm甲磺酸流动相和dionex cs12a阳离子交换分析柱组成的等度方法解析钠和钾。使用由35mm氢氧化钾流动相和dionex as18阴离子交换分析柱组成的等度方法解析磷酸盐。使用dionex chromeleon软件进行定量分析。基于色谱峰面积从校准曲线内推所有样品浓度。
[0684]
通过原子发射光谱法测定每个24小时粪便样品的磷酸盐、钠、钙以及钾含量。在65-95℃下经过2至3小时反复添加浓硝酸和过氧化氢来消化干燥的粪便团粒或来自改造的均化粪便的代表性样品。然后用1％硝酸稀释样品溶液，随后在以下元素发射波长下用原子发射光谱仪(agilent 4100 mp-aes)分析：钙(422.673nm)、钠(588.995nm)、钾(766.491nm)以及磷(214.915或213.618nm)。铯溶液用作电离缓冲液与内标。使用agilent mp expert软件进行数据分析。
[0685]
相对于每一天测量的每只动物的膳食中消耗的p计算每日尿液和粪便磷酸盐输出。通过测定与对照组(食物中无药物的动物)相比这些比率的减小来表示磷吸收的百分比抑制。这也可以用所关注的其它离子来完成。如果测试多天，那么这些可以代表每只大鼠的磷酸盐平衡的稳态测量的重复实验，在这种情况下动物的常规每日消耗是先决条件。增加的粪便磷酸盐与尿液p的近似伴随减少以维持大鼠中的中性平衡是用实例化合物处理的大鼠中总体减少的磷酸盐吸收的指示。
[0686]
实施例10
[0687]
在大鼠慢性肾病(ckd)模型中的作用
[0688]
为了评估所选的实例化合物影响通常与较后期的ckd相关的软组织钙化的能力，利用5/6肾切除(5/6nx)大鼠模型检查疾病病况中的矿物质动态平衡。研究ckd的各种方面的常用模型，5/6nx大鼠，通常不是高磷酸盐血的，除非用膳食磷酸盐激发(参看shobeiri等，am j nephrol.31：471-481，2010，动物ckd模型中的血管钙化：综述(vascular calcification in animal models of ckd：a review))。因此，为了确保这些动物中的有效和稳定的磷酸盐血血管钙化进展，如从lopez小组开发的方案(参看lopez等，j am soc nephrol.17：795-804，2006.钙模拟物r-568减少用骨化三醇处理的尿毒症大鼠中的骨外钙化(calcimimetic r-568 decreases extraosseous calcifications in uremic rats treated with calcitriol))修改来实施膳食中提高的生物可用性磷酸盐与维生素d3处理
的组合。
[0689]
雄性斯普拉格-杜勒5/6肾切除大鼠与由供应商进行的手术程序一起购自查尔斯河实验室(hollister，ca)。通过两个手术达成功能性肾质量的减少：左肾的次全肾切除继之以1周恢复，随后右肾的单侧肾切除。从第二次手术的3天恢复期之后，将9周龄的大鼠转运至测试设施。
[0690]
在到达后并且在整个研究中，向大鼠喂饲由0.9％无机p(磷)和0.6％ca(td.10809，harlan-teklad，madison，wi)组成的纯化的粉末状膳食。通过眶后或尾静脉放血获得早晨的血清，并且只有具有0.9至1.2mg/dl的血清肌酐水平的动物被录入研究中，其中基于血清肌酐和体重分组(n＝12)。使用与上文所描述的媒剂组相同的膳食，用含药物的食物向处理组中录入的大鼠给药。另外，起始每周三次施用骨化三醇(活性维生素d
3 80ng/kg，腹膜内)的方案。
[0691]
经由标准临床化学或elisa分析，用适当的血清标志物测量每周监测肾功能、磷酸盐血状态以及其它参数。具有大于2mg/dl的血清肌酐或具有平均群组体重的80％或更小的体重的大鼠由于晚期疾病病况而从研究中去除。通过将大鼠放置于代谢笼中以允许收集排泄物也可以测量肾功能的尿液标志物。
[0692]
在4周后，对大鼠施以无痛致死术并且将器官收集并称重。测定主动脉弓、心、胃以及肾残留物的矿化。在65-95℃下经过2至3小时反复添加浓硝酸和过氧化氢来消化全组织样品。然后用1％硝酸稀释样品溶液，随后在以下元素发射波长下用原子发射光谱仪(agilent 4100 mp-aes)分析：钙(422.673nm)、钠(588.995nm)、钾(766.491nm)以及磷(214.915或213.618nm)。铯溶液用作电离缓冲液和内标。使用agilent mp expert软件进行数据分析。
[0693]
用测试物品处理的动物与其未处理的配对物相比血管钙化的减少与所报道的驱动这种ckd大鼠模型中的疾病病况所需的膳食磷酸盐吸收的抑制相一致。