一种食源性化合物人参皂苷CK在抑制果蔬真菌方面的应用

一种食源性化合物人参皂苷ck在抑制果蔬真菌方面的应用
技术领域
1.本发明涉及一种食源性化合物人参皂苷ck在抑制果蔬真菌方面的应用


背景技术：

2.灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)是核盘菌科、孢盘菌属生物，是一类丝状子囊真菌。灰葡萄孢菌常在植物发育早期阶段侵入宿主，当宿主植物生理发生变化有利于其生长时，该病原菌便快速引发宿主软腐，引起组织的严重破坏。灰葡萄孢菌具有多种感染模式，能以菌丝、分生孢子和菌核侵染宿主植物地上部分，包括茎、叶、花和果实，导致其腐烂，并在侵染末期产生分生孢子。灰葡萄孢菌能够引起果蔬的灰霉病，是水果蔬菜中最常见的病害，如番茄灰霉病、草莓灰霉病等。
3.胶孢炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides penz)属于真菌界、半知菌亚门、黑盘孢目，是一种常见的炭疽菌属的一种，也是导致植物病害的主要病原真菌之一。胶孢炭疽菌能够侵染多种植物叶片、根茎及果实，如番茄、苹果、葡萄、芒果和梨等多种寄主。胶孢炭疽菌主要危害叶片，于叶片表面着生近圆形的病斑。随着菌落的生长，多个病斑会逐渐融合形成大病斑，导致植物叶片大部分枯死，果实生长势头明显减弱，外观饱满度下降。严重时直接导致落叶落果，根茎果实腐烂，产量下降，造成巨大的经济损失。
4.在当前人们对于灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌等常见的果蔬真菌的抑制，大多采用化学杀菌剂喷洒等方式，如使用苯并咪唑类和甾醇脱甲基抑制剂类等杀菌剂进行防治。防治果蔬真菌的常见杀菌剂有腐霉利、嘧霉胺、百菌清等。然而随着化学杀菌剂使用频率的增大和剂量的增加，导致真菌产生抗药性。更为严重的是，化学杀菌剂较易在植物的叶片和果实上残留，对人体造成危害。近些年来，食源性化合物应用于果蔬真菌防治的研究逐渐成为热门，因为这些化合物多提取自动植物以及微生物，并且具有多种生物活性，所以可能成为化学合成试剂的替代者。这不仅是一种科学环保的防治果蔬真菌的手段，也能够避免残留的化学药物对人体造成严重伤害。因此食源性抗真菌剂的筛选对于未来植物病害的防治具有重要意义。
5.人参是我国传统的中药材，在中药中具有重要的地位，其化学成分复杂，药理活性独特，具有“百草之王”的美称。人参皂苷是人参发挥药理作用的主要成分，是由糖和苷元组成的糖苷类化合物。其中的稀有人参皂苷ck具有高效的抗皮肤老化，抗癌，抗炎，保护心肌的诸多功效，近些年来倍受人们关注。据文献报道，人参皂苷ck能够由人参皂苷rb1转化而来，转化过程是肠道细菌作用的结果。随后的一些试验阐明人参皂苷rb1等在肠道中吸收很少，而人参皂苷ck才是被人体吸收和发挥生理活性作用的实体。因此这使得人参皂苷ck的活性研究成为热门，但是其在抑制果蔬真菌方面的应用却鲜有报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种食源性化合物人参皂苷ck在抑制果蔬真菌方面的应用，降低化学杀菌剂所引起的残留和抗性问题。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是通过使用一种食源性化合物人参皂苷ck抑制灰葡萄孢菌和胶孢炭疽菌。
8.进一步地讲，本发明的化合物人参皂苷ck是在抑制灰葡萄孢菌方面的应用。
9.进一步地讲，本发明的化合物人参皂苷ck是在抑制胶孢炭疽菌方面的应用。
10.更进一步地讲，本发明的化合物人参皂苷ck抑制灰葡萄孢菌的浓度分别为16ug/ml、32ug/ml、64ug/ml。
11.更进一步地讲，本发明的化合物人参皂苷ck抑制胶孢炭疽菌的浓度分别为32ug/ml，64ug/ml、128ug/ml。
12.本发明中的食源性化合物人参皂苷ck对灰葡萄孢菌(菌丝抑制ic
50
为27.63ug/ml,孢子抑制ic
50
为6.972ug/ml)和胶孢炭疽菌(菌丝抑制ic
50
为43.01ug/ml)均具有明显抑制效果。本发明的人参皂苷ck来源于为五加科植物人参的干燥根，是二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物和最终吸收形式。人参皂苷ck是一种非天然的人参皂苷,它可由其他二醇型人参皂苷转化而来，目前常用的方法通常包括酶转化法和微生物发酵法。本发明针对目前化学杀菌剂在防治果蔬病害中日益加重的残留和抗性问题，使用食源性人参皂苷ck分别对灰葡萄孢菌和胶孢炭疽菌进行抑菌试验，发现人参皂苷ck对灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌的孢子和菌丝均能够产生较大破坏，从而抑制它们的生长。
附图说明
13.图1为人参皂苷ck作用后受试菌种菌丝生长抑制率图(a灰葡萄孢菌；b胶孢炭疽菌)
14.图2为人参皂苷ck作用灰葡萄孢菌后菌丝盘生长状态图
15.图3为人参皂苷ck作用灰葡萄孢菌后菌丝体形态图
16.图4为人参皂苷ck作用胶孢炭疽菌后菌丝盘生长状态图
17.图5为人参皂苷ck作用胶孢炭疽菌后菌丝体形态图
18.图6为人参皂苷ck作用灰葡萄孢菌后孢子超微结构图
19.图7为人参皂苷ck作用胶孢炭疽菌后孢子超微结构图
20.图8为人参皂苷ck作用后受试菌种细胞内容物泄露量变化图(a灰葡萄孢菌；b胶孢炭疽菌)
21.图9为人参皂苷ck作用后受试菌种胞外ph值变化图(a灰葡萄孢菌；b胶孢炭疽菌)
具体实施方式
22.为进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体操作方式及作用结果进行详细地说明。
23.实施例1：
24.步骤一：制备人参皂苷ck药液
25.将20mg人参皂苷化合物ck溶于500μl二甲基亚砜(dmso)中，使其溶解后的终浓度为40mg/ml，避光保存于4℃冰箱中备用。使用时用马铃薯葡萄糖肉汤(pdb)采用倍比稀释的方法配置成所需的浓度梯度。
26.步骤二：灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌菌盘的制备和培养
27.将高压灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂pda培养基冷却至55℃倒板，直至培养基凝固。采用划线法分别把灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌菌种接种于pda平板上，28℃恒温培养箱培养备用。
28.步骤三：灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌孢子悬浮液的制备
29.培养7天后的真菌菌盘会产生大量分生孢子，加入高压灭菌后的无菌蒸馏水，采用划线法刮取菌丝，经四层无菌纱布过滤后，得到孢子悬浮液，在光学显微镜下对孢子悬浮液计数，使用无菌水调整孢子悬浮液浓度为106cfu/ml
30.实施例2
31.步骤一：人参皂苷ck抑制灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌菌丝生长ic
50
值的测定
32.融化的pda培养基冷却到55℃左右，按照浓度梯度将人参皂苷ck药液与pda培养基充分混合，每一浓度均制备三个平板。待培养基凝固后，将直径为5mm的菌饼放入平板中央，另准备三个不加药液的培养基平板做空白对照，28℃恒温培养至空白对照组菌丝长满培养皿。采用十字交叉法测量菌丝生长直径，根据公式：
33.菌丝抑制率(％)＝1-(药物组直径-菌饼直径)/(对照组直径-菌饼直径)，计算菌丝生长抑制率。使用spss软件计算得到人参皂苷ck抑制灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌菌丝生长ic
50
值分别为为27.63ug/ml、43.01μg/ml。
34.由图1可以看出随着人参皂苷ck浓度的增加，灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌的菌丝生长均受到抑制，当浓度为32ug/ml时，对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制率达到了69.51％，对胶孢炭疽菌菌丝生长抑制率仅为38.98％。根据图2和图4可以看出人参皂苷ck对受试菌种的抑制效果都呈现药物浓度依赖关系，浓度越大，对菌丝生长的抑制程度越大。在光学显微镜下观察不同浓度人参皂苷ck处理后的受试菌种菌丝，从图3中我们可以看到，随着浓度的增大，菌丝形态逐渐卷曲并变短，当浓度为32ug/ml时，对灰葡萄孢菌菌丝已经有了非常明显的伤害；根据图5我们可以看到当人参皂苷ck浓度大于64ug/ml时，胶孢炭疽菌菌丝才开始出现卷曲缩短的现象。这表明人参皂苷ck对灰葡萄孢菌菌丝更易造成严重的损害。
35.实施例3人参皂苷ck处理后灰葡萄孢菌及胶孢炭疽菌超微结构的观察步骤一：参照实例2分别制备32μg/ml和64μg/ml的灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌菌盘，并在28℃的恒温培养箱中培养3天。将培养后的菌饼切下并用pbs缓冲液清洗2-3次，3000g/min离心20min，经过后续多重处理后，使用透射电镜观察真菌表面超微结构变化。
36.由图6可看出空白对照组的大多数灰葡萄孢菌呈现正常状态，具有完整的细胞壁、细胞膜，细胞核等细胞器完整清晰。经过人参皂苷ck处理后，孢子的细胞壁和细胞膜变得粗糙和模糊。并在内部出现明显的空泡，而细胞核等细胞器溶解消失，细胞质变得混浊并出现严重渗漏。由图7可看出空白对照组中大多数胶孢炭疽菌呈正常状态，处理组胶孢炭疽菌的细胞壁和细胞膜同样变得粗糙模糊，出现明显的褶皱凹陷，且内部出现大面积空腔，细胞器模糊不清。这说明人参皂苷ck处理对受试菌种均造成了严重的破坏。
37.实施例4
38.步骤一：人参皂苷ck处理后受试菌种细胞内容物泄露量的测定
39.在pdb培养基中分别加入已配置好的1.0
×
105cfu/ml灰葡萄孢菌和胶孢炭疽菌孢子菌悬液，置于28℃恒温振荡器中振荡培养3d；待菌丝体长出后，各组取1g菌丝体重悬，分别加入不同浓度的人参皂苷ck(0，16，32μg/ml)，放置于28℃恒温振荡器中进行振荡，每组
设置3个平行；当处理时间为0，30，60和120min时，将各组离心处理留取上清液，在260nm波长下测定其吸光度值。
40.从图8a中可以看出，灰葡萄孢菌对照组在不同时间段内细胞内容物的泄露量变化很小，几乎没有发生细胞破损。经过人参皂苷ck处理后，细胞内容物的泄漏量随着浓度的增大而增大，且在处理前30min内，细胞内容物的泄漏量快速升高，说明人参皂苷ck造成细胞膜通透性发生明显变化，从而使胞内物质发生渗漏，最终导致细胞内容物泄漏量增加。图8b是人参皂苷ck处理胶孢炭疽菌后细胞内容物泄漏量的变化图。空白对照组基本处于稳定，而处理组则发生较大变化。同样说明人参皂苷ck对胶孢炭疽菌孢子细胞膜造成了破坏，从而导致内容物的泄露。
41.实施例5
42.步骤一：人参皂苷ck处理后受试菌种胞外ph值的测定
43.按照实例1叙述方法分别配制灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌孢子悬液，各取500μl加入到pdb培养基中，28℃恒温震荡培养2d。然后加入不同浓度的人参皂苷ck(0，16，32μg/ml)分别处理0，30，60和120min后，高速离心处理，留取上清液进行测量。受试菌种孢外ph值使用phs-3eph计来测量。
44.通过图9a我们可以看到，经过16μg/ml，32μg/ml人参皂苷ck处理后，灰葡萄孢菌胞外ph值的下降趋势基本一致。在0-120min范围内，32μg/ml人参皂苷ck处理组ph下降最明显，降幅达到17.6％。由以上可推断，灰葡萄孢菌细胞内呈现酸性，所以当细胞大量破损后，细胞内容物泄露导致ph值降低。通过图9b我们可以看到，人参皂苷ck处理胶孢炭疽菌后在0-120min的时间内，32μg/ml人参皂苷处理组ph值从7.2降至6.6左右，降幅达到8.3％。这说明人参皂苷ck对胶孢炭疽菌也造成了破坏，使其内容物出现泄露的情况。
45.本发明通过菌丝生长抑制、透射电镜观察、细胞内容物泄漏量检测等多个实验验证了食源性人参皂苷ck对于果蔬真菌具有明显的抑制作用。在64μg/ml的浓度下，对灰葡萄孢菌菌丝抑制率达到了85.19％，相同浓度下对胶孢炭疽菌菌丝的抑制率也达到了60.13％。收集数据并进行分析后，得到人参皂苷ck对灰葡萄孢菌、胶孢炭疽菌菌丝的ic
50
值分别为27.63μg/ml和43.01μg/ml。其他实验的结果同样表明，人参皂苷ck药液可对受试菌种的孢子细胞壁和细胞膜具有损伤作用，导致细胞内容物泄露，进而造成了真菌的衰败和死亡。以上实验结果表明，人参皂苷ck是一种对果蔬真菌具有明显抑制效果的食源性化合物，有潜力成为一种能够替代化学杀菌剂的食源性抑菌剂。