用于治疗或预防眼科病症的药剂的制作方法

用于治疗或预防眼科病症的药剂
1.导言
发明领域
2.本发明提供一种适于治疗和预防眼科病症的用途的药剂，包括但不限于涉及视神经和视网膜的损伤和/或病症的病症。
3.发明背景
4.视神经由一束超过100万条携带视觉信息的神经纤维组成。视神经将视网膜连接到大脑。这种连接在细胞水平上包括视网膜神经节细胞(rcg)。视网膜神经节细胞(rgc)是一种位于眼睛视网膜内表面(神经节细胞层)附近的神经元。rgc在大小、连接和对视觉刺激的反应方面各不相同，但它们都共享一个延伸到大脑的长轴突。这些轴突形成视神经。
5.视神经受损可能导致视力丧失。视力丧失的类型和严重程度取决于损伤发生的位置。其可能会影响一只或两只眼睛。
6.有许多不同类型的视神经病症，包括：
[0007]-青光眼是尤其在美国导致失明的主要原因的一组疾病。青光眼通常发生在眼内流体压力缓慢升高并损害视神经时。
[0008]-视神经炎是视神经的炎症。原因包括感染和免疫相关疾病，如多发性硬化症。有时原因不明。
[0009]-视神经萎缩是对视神经的损害。原因包括流向眼睛的血流不畅、疾病、外伤或接触有毒物质或由药物[乙胺丁醇、异烟肼、洋地黄、抗生素(氯霉素、磺胺类)和胺碘酮]引起。
[0010]-视神经乳头玻璃疣是随着时间的推移在视神经中积聚的蛋白质和钙盐袋。
[0011]
所有上述报道的疾病都可能导致视神经中rgc轴突的损伤，最终可能导致这些细胞死亡。对于大多数视神经疾病，没有可用的治疗方法，或者治疗只能防止进一步的视力丧失。因此，增强rgc的活力或功能仍然是基础研究和转化研究的主要目标。
[0012]
到目前为止，市场上还没有真正有效抵消眼科疾病中rcg损失的治疗方法。因此，眼科疾病，尤其是那些涉及rcg损失或损伤的疾病，迄今为止一直难以治疗。因此，今天仍然存在非常高的医疗需求。
[0013]
mesentier-louro等在《分子神经生物学(mol.neurobiol.)》2019年56卷1056-1069页中已经描述了眼部施用在视神经损伤实验模型中的一些效果。
[0014]
在大鼠视神经损伤模型中，由于包括神经生长因子(ngf)在内的生长因子逆向转运减少，视神经挤压后2周内通常会发生大量rgc变性。根据现有技术，根据预防性实验范例(mesentier-louro等，《分子神经生物学(mol.neurobiol.)》2019年56卷1056-1069页)，仅当在视神经损伤后立即给药时，重组人ngf(rhngf)的玻璃体内和滴眼给药才可能抵消成年大鼠的视神经压迫。然而，这毕竟与人类眼科病症的临床情况不同。对于人类眼科病症的预期治疗，只有在对视神经造成第一次损伤后的一段时间后才能进行治疗干预，大鼠视神经挤压模型中的这些实验结果不能转化为人类的临床应用。特别是，作为onc的结果，可能会在视神经上触发进一步的下游过程，包括对rcg的潜在进一步损害。当在rgc的onc损伤后阶
段施用时，rhngf或其他分子是否具有治疗效果仍然未知。因此，当在包括或类似人类眼科疾病的情况下施用药剂时，疗法是否有效也仍然难以捉摸。
[0015]
因此，仍然需要眼部病状、尤其是那些影响视神经的病状的有效治疗，其不会受到不利影响，例如无法忍受的或其他不希望的副作用，以及需要适用于此类目的的、用于施用于包括人类在内的哺乳动物对象的治疗剂，并以可靠和可接受的纯度可供从业者使用。
[0016]
所要解决的问题
[0017]
本发明的主要目的是提供一种没有不希望的或痛苦的副作用如疼痛的眼科病症的治疗或预防。还希望提供一种可以容易地被从业者使用和施用的治疗剂。还希望以满意的产率和纯度提供治疗活性剂，以便能够进行这种治疗。因此，本发明的进一步目的包括消除与现有技术相关的缺点。鉴于所获得的优于现有技术的优点，本发明的这些和其他进一步的目的将从以下详细描述中变得显而易见。具体目的包括提供一种可靠的方法来治疗患有眼科病症的对象而没有不希望的副作用。


技术实现要素：

[0018]
本发明提供用于治疗和/或预防哺乳动物对象中眼科病症的多肽，其中所述多肽选自seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽。这些多肽的特征在于人ngf氨基酸序列(seq id no：2)的突变，其中所述突变与降低伤害感受活性有关。尤其，hngf的100位精氨酸被谷氨酸取代。
[0019]
尤其优选的多肽是seq id no：4的多肽。所述多肽的特征在于在61位处至少不存在脯氨酸，更优选61位的脯氨酸被另一个氨基酸取代。在seq id no：4中，seq id no：3的61位的脯氨酸被丝氨酸取代。
[0020]
优选地，所述哺乳动物对象是人。
[0021]
优选地，本发明多肽的施用不会导致哺乳动物对象中的任何不良影响。特别优选根据本发明的治疗和/或预防不会引起哺乳动物对象的痛觉过敏。
[0022]
优选地，所述眼科病症涉及视神经的损伤和/或病症。
[0023]
优选地，所述眼科病症的特征在于视网膜神经节细胞的病症。
[0024]
优选地，所述多肽在视神经损伤后被施用。
[0025]
优选地，所述眼科病症包括选自青光眼、神经营养性角膜炎、视神经炎、视神经萎缩、视神经乳头玻璃疣和视路胶质瘤的至少一种。
[0026]
优选地，所述多肽用于向眼睛施用。更优选地，施用选自向眼睛局部施用和玻璃体内施用，其中局部施用是最优选的。
[0027]
优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用四天。
[0028]
在一个实施方式中，所述多肽被重复施用。在一个尤其优选的实施方式中，所述多肽每天被重复施用至少三次。
[0029]
在一个实施方式中，所述多肽在观察到例如眼科病症完全治愈之前或至少病症症状改善之前被重复施用。或者，所述多肽重复施用三至30天，优选七至14天。任选地，在所述间隔完成后停止施用。
[0030]
优选地，所述剂量/每剂具有每眼0.3至30μg多肽、更优选每眼1至10μg多肽、最优选每眼5μg多肽的量。更优选地，这些用量专门用于眼睛局部施用。
[0031]
在一个实施方式中，所述多肽包含在水性介质中，并且水性介质被施用到哺乳动物对象。更优选地，所述多肽包含在包括以下的组合物中：
[0032]
a)0.2至20mg/ml所述多肽，
[0033]
b)5至100mm乙酸钠缓冲液，
[0034]
c)5至100mm甲硫氨酸，
[0035]
d)ph 5.0至6.0。
[0036]
更优选地，所述多肽包含在包括以下的组合物中：
[0037]
a)2mg/ml所述多肽，
[0038]
b)20mm mm乙酸钠缓冲液，
[0039]
c)20mm甲硫氨酸，
[0040]
d)ph 5.5。
[0041]
在一个实施方式中，seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽获自生物来源。这可包括纯化，即从其他分子中分离，该其他分子包括其他蛋白质，例如宿主细胞蛋白质。任选地，seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽可在包括(重)折叠和/或色谱纯化和/或蛋白酶消化和任选地调节最终蛋白质浓度和/制备所需制剂的方法中获得。在一个实施方式中，所述多肽可通过重组表达和纯化获得，其中所述纯化包括在混合模式固定相上的纯化。优选地，根据本发明用途的多肽基本上不含多肽的降解产物，尤其基本上不含所述多肽的des-nona变体。
[0042]
而且，本发明还提供来自重组来源并如本文所述纯化的seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法，如本文所述。
[0043]
本发明进一步涉及包含选自seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽的多肽的组合物，其中所述组合物的特征在于ph 5.0至6.0(优选ph 5.5)的ph，以及包含以下：
[0044]
a)0.2至20mg/ml所述多肽(优选2mg/ml)，
[0045]
b)5至100mm乙酸钠缓冲液(优选20mm)，
[0046]
c)5至100mm甲硫氨酸(优选20mm)。
[0047]
发明详述
[0048]
本说明书连同权利要求书和附图一起整体公开了本发明的各个特征的特定和/或优选实施方式和变体。本发明还考虑作为特别优选的实施方式的那些实施方式，其通过组合本文中针对本发明描述的两个或更多个特定和/或优选实施方式和变体而产生。因此，本公开还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物，以及任何和所有组合或任何两种或更多种所述实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物。因此，除非本文另有明确说明或上下文另有要求，对单个实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物的引用应视为涵盖这些实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物中的一个或多个(即多于一个，例如两个或更多、三个或更多或全部)。除非另有明确说明或上下文另有要求，否则本文公开的每个实施方式、方面和实施例应被认为适用于本文公开的任何其他实施方式、方面或示例并且可与本文公开的任何其他实施方式、方面或实施例组合。
[0049]
本领域普通技术人员将理解，本文描述的本发明易于进行除具体描述的那些之外的变化和修改。因此，本公开的范围不受本文描述的特定实施方式的限制，本文提供的具体实施方式是为了说明和示例的目的。功能或其他等效的实体、化合物、特征、步骤、方法或组
合物在本公开的范围内。对本领域普通技术人员显而易见的是，本公开包括本文字面描述的实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物的所有变化和修改。
[0050]
本文引用的每个参考文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明、演示文稿等)，无论是在以上还是以下，都通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权先于特定的教导和/或承认特定参考文献，除公知常识之外的，本发明包含足够清晰和完整的信息，以供本领域技术人员执行。
[0051]
通常，除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，医学、眼科、神经学、遗传学、分子生物学、基因表达、细胞生物学、细胞培养、免疫学、神经生物学、色谱、蛋白质化学和生物化学领域)。以例如英语出版的教科书和评论文章通常定义本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0052]
表述“和/或”，例如，“x和/或y”，应理解为表示“x和y”或“x或y”，并应被视为明确披露“和”、“或”以及这两种含义(“和”或“或”)。
[0053]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”、“大约”、“基本上”均表示大约或接近，并且在本文阐述的数值或范围的上下文中，优选地表示在所列举或要求保护的数值或范围附近的 /-10％，更优选地 /-5％。
[0054]
除非另有明确说明，在本文件的上下文中使用“包含”一词或诸如“包含”或“包括”的变体表示除了“包含”引入的列表的成员之外，还可以可选地存在其他成员。然而，作为本发明的一个具体实施方式，术语“包括”包括不存在其他成员的可能性，即为了本实施方式的目的，“包括”应理解为具有“由
……
组成”的含义。
[0055]
除非另有明确说明，关于本发明的相对量的所有指示均基于重量/重量。以通用术语为特征的组分的相对量的指示意在指代所述通用术语所涵盖的所有特定变体或成员的总量。如果由通用术语定义的某个组分被指定以一定的相对量存在，并且如果该组分被进一步表征为通用术语所涵盖的特定变体或成员，这意味着没有额外存在通用术语涵盖的其他变体或成员，使得通用术语涵盖的组分的总相对量超过指定的相对量；更优选地，根本不存在通用术语涵盖的其他变体或成员。
[0056]
除非本文另有说明或除非上下文另有明确规定，否则本文所述的所有方法和过程都可以以任何合适的顺序执行。
[0057]
除非另有说明，本文所用的术语“药剂”通常指化合物或组合物，优选指化合物。药剂能够对活生物体和/或来自活生物体的细胞或源自活生物体的细胞产生作用，例如通过作用于细胞和/或身体组织，或在环境中。药剂的物理状态没有特别限制，除非另有说明，否则可以是气体、水和/或固态。除非另有说明，药剂的类型没有特别限制，因此，药剂可以是化学和/或生物分子，例如蛋白质或核酸。本文定义的特定药剂可用于本发明。
[0058]
如本文所用，“不利影响”是由向对象施用药剂(药物)导致的不希望的有害影响。不利影响包括但不限于发病率、死亡率、痛觉过敏综合征、疼痛、体重改变、酶水平、功能丧失或在微观、宏观或生理水平上检测到的任何病理变化。不利反应可能导致可逆或不可逆的变化，包括个体对其他化学品、食物或程序(例如药物相互作用)的敏感性增加或减少。
[0059]
如本文所用，术语“色谱法”、“色谱”等通常是指适用于分离混合物的技术，其中将混合物添加到称为“固定相”的非液体材料中，目的是至少部分地分离混合物的一种或多种成分。出于该目的，固定相可暴露于流体和/或混合物可以溶解在流体中；所述与固定相接
触的流体也可以称为“流动相”。通常，如本文所述的“通过色谱法进行”的任何步骤可以同义地称为“色谱步骤”。
[0060]
如本文所用，术语“流动相”具有本领域中通常使用的含义并且可以指代色谱期间与固定相接触的所有流体，即洗涤流体以及包含目标蛋白质的流体(混合物)，例如本文所述的一种或多种蛋白质。在本发明中，如本文所述，经受色谱的混合物通常包含一种或多种蛋白质，例如特别是本文所述的蛋白质，例如seq id no：3或4的多肽、这些的任何一种的前体、蛋白酶和/或宿主细胞蛋白(hcp)。
[0061]“固定相”通常包含通常所包含的基础基质，其是水不溶性材料，通常呈颗粒或凝胶形式，例如树脂。在包括本文所述的实施方式在内的许多情况下，固定相包含基础基质和可与包含在待进行色谱法的混合物中的至少一种组分结合的部分。所述基础基质通常是不溶于水的材料，通常呈颗粒或凝胶形式。基础基质的非限制性实例是琼脂糖凝胶和琼脂糖，例如高刚性琼脂糖。
[0062]
如本文所用，“色谱步骤”是指将包含至少一种待分析和/或待纯化的化合物的液体添加到色谱材料(优选固定相)中的动作，其优选是蛋白质(并且在本发明的上下文中，所述蛋白质最优选是seq id no：3或seq id no：4的多肽)，任选地用一种或多种洗涤溶液洗涤色谱材料，并洗脱所述至少一种化合物。在该上下文中，为了说明，以两个色谱步骤为特征的方法的特征在于将包含至少一种待分析和/或待纯化的此类化合物的液体加入到第一色谱材料中，如上所述，并且，在从其中洗脱之后，将包含至少一种这样的化合物的液体加入到第二色谱材料中，如上所述，它也从该色谱材料中被洗脱。任何“色谱步骤”的目的是包括在应用于固定相的混合物中，优选在色谱中，至少一种组分与固定相结合。此类化合物可以是本文所述的一种或多种蛋白质。化合物可以从固定相中回收，例如通过更换流动相和/或通过随时间持续暴露于流动相。
[0063]
当关于色谱使用时，术语“结合”例如描述固定相的结合能力，没有特别限制，但通常是指非共价结合。因此通常包含在混合物中的至少一种组分，例如至少一种蛋白质，与固定相非共价结合。色谱步骤任选地但优选地包括洗涤与至少一种组分结合的固定相。至少一种组分可以是至少一种蛋白质，如本文所述的至少一种蛋白质。
[0064]
如本文所用，术语“异源”描述了由多个不同元件组成的事物。
[0065]
在本发明的上下文中，在本领域常用的含义内使用术语“二硫化物”和“二硫键”。一般而言，“二硫键”是指具有结构r-s-s-r'的官能团。该键也称为“ss-键”，通常由两个硫醇基团偶联而成。蛋白质中的二硫键是通过氧化折叠过程在半胱氨酸残基的硫醇基之间形成的；两个半胱氨酸残基的硫醇基团之间的这种特定二硫键也可以称为“二硫键”。不希望受限于特定理论，本领域通常理解的是，在真核细胞中，二硫键在内质网的管腔(和线粒体膜间隙)中形成，但通常不在胞质溶胶中形成，对于原核生物，二硫键在(各自的有机体，特别是革兰氏阴性菌的)周质中形成；二硫键也可以在真核和原核细胞的细胞外环境的蛋白质中找到。
[0066]
如本文所用，术语“表达”和“基因表达”等涉及来自基因的信息在功能性基因产物的合成中的使用。基因表达至少包括转录，并且任选地包括一种或多种附加特征，任选地选自包括翻译和翻译后修饰的开放列表。在宿主细胞中蛋白质重组表达的上下文中，该术语通常意味着蛋白质由宿主细胞(在细胞的任何区室中和/或分泌和/或掺入包涵体中)产生，
除非上下文另有说明。
[0067]
术语“眼睛病症”和“眼科病症”在本文中可互换使用并且包括影响眼睛的所有病症。不受限制地，涉及视神经和/或视网膜的损伤和/或功能障碍的所有病症都包括在这些术语的含义中。
[0068]
如本文所用，术语“异源”描述了由多个不同元件或来源组成的事物。例如，在包含人基因(或编码非天然多肽如本发明的多肽的基因)的非人宿主细胞中，所述基因对于细胞是“异源”的，并且该细胞可能能够“异源”表达相应基因。异源基因表达也可以称为“重组”。
[0069]
术语“包涵体”具有本领域通常使用的含义，是指在宿主细胞的胞质溶胶或周质中发现的聚集体或颗粒；包涵体通常包含蛋白质，例如特别是在宿主细胞中重组表达的蛋白质。不希望受限于任何特定理论，可以理解，在重组表达领域中，包涵体通常含有重组表达的蛋白，但宿主细胞蛋白(hcp)、核糖体组分或dna/rna片段相对较少。不希望受限于任何特定理论，应理解包涵体通常至少部分包含未正确折叠的蛋白质(错误折叠的蛋白质)，特别是错误折叠的重组表达的蛋白质。应当理解，包涵体通常包含非正确折叠形式的蛋白质，即在本发明的上下文中，它们通常包含非正确折叠形式的根据本发明的多肽和/或其前体。术语“错误折叠”通常描述生物分子，例如核酸或多肽，其不在天然构象上，即处于非正确折叠形式。
[0070]“分离的”指基本或大致不含其在天然状态下通常伴有的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的肽”或“分离的蛋白质”分别是指从以天然存在的状态围绕着它的细胞环境和细胞外环境(例如组织)中、例如从表达它的细胞(例如宿主细胞)中纯化的肽或蛋白质。在替代描述中，如本文所用，“分离的肽”或“分离的蛋白质”分别是指从其天然细胞环境中以及从与肽或蛋白质正常存在的环境的其他组分的结合中体外分离和/或纯化肽或蛋白质。在另一个实例中，如本文所用，“分离的细胞”是指从细胞和细胞外环境例如组织或细胞集落中纯化出来的细胞，所述环境以天然存在的状态围绕着它，例如，一个宿主细胞已经从通常与该细胞相邻的环境中移除。根据上文对词语“分离的”的定义，如本文所用，“分离”是描述获得“分离”的材料(例如分离的细胞或分离的肽或蛋白质)的活动的动词。
[0071]
如本文所用，术语“多”和“多个”是指多个，即两个或更多的任意数量。
[0072]
如本文所用，术语“突变”是指生物体的基因组、病毒或染色体外dna或其他遗传元件的核苷酸序列的改变。该术语还延伸至氨基酸序列的突变，特别是携带至少一个(非沉默)突变的基因的氨基酸序列。除非另有说明，核苷酸序列的突变是永久性改变。种系中存在的突变通常是可遗传的。一般来说，核苷酸序列的突变会导致许多不同类型的序列变化：基因突变要么没有影响，要么改变基因的产物，要么阻止基因正常或完全发挥作用。突变也可以存在于非基因区域。除非另有说明，否则野生型序列用作描述突变的参考序列。因此，例如，当说给定突变体的特征在于多肽序列的第100位的突变时，这表明突变体在第100位不具有与野生型多肽相同的氨基酸残基。核苷酸序列和/或氨基酸序列的特定类型的突变包括改变，例如缺失、取代、添加、插入和剪接变体。核苷酸序列的“缺失”是指核苷酸序列中不存在一个或多个核苷酸。氨基酸序列的“缺失”是指多肽中不存在一个或多个氨基酸残基。核苷酸序列的“添加”是指核苷酸序列中存在一个或多个额外的核苷酸。氨基酸序列的“添加”是指相关多肽中存在一个或多个额外的氨基酸残基。核苷酸序列的“取代”是指核苷酸序列中的一个或多个核苷酸被(一个)其他核苷酸取代。氨基酸序列的“取代”是指多肽中
的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。核苷酸序列、如开放阅读框的添加、缺失和取代可以是5'末端、3'末端和/或内部的。多肽的添加、缺失和取代可以在氨基末端、羧基末端和/或内部。核苷酸序列和/或多肽序列的“插入”是分别添加一个或多个核苷酸或一个或多个氨基酸残基，特别是在相应序列的内部位置。术语“剪接变体”用于描述编码多肽序列的rna与各自的野生型rna剪接不同，通常作为核酸水平突变的结果，通常导致不同于野生型多肽的多肽翻译产物。术语“剪接变体”不仅可以用于相应的rna，还可以用于相应的模板dna序列(通常是基因组dna)和由这种rna编码的多肽的序列。
[0073]
术语“突变体”通常意指不同于野生型序列的核酸序列或氨基酸序列。因此，突变核酸序列或氨基酸序列相对于各自的野生型序列具有至少一个突变。在核酸序列存在多态性但未反映在相应编码多肽水平(沉默的突变，遗传密码的退化)的情况下，术语“突变体”在核酸水平上仅指编码突变多肽的那些核酸变体。突变体可以单独或组合包含不同的突变组合，包括一种以上的突变和不同类型的突变。
[0074]
按照本领域的通用含义，术语“神经生长因子”(缩写为“ngf”或“β-ngf”)代表参与调节某些神经元和其他细胞的生长、维持、增殖和存活的神经营养因子和神经肽(参见例如levi-montalcini,2004,progress in brain research,146卷,525-527页)。除非上下文另有说明，术语神经生长因子仅代表野生型ngf，不包括seq id no：3或4的多肽。野生型ngf是2.5s、26-kdaβ亚基，可从ngf前体获得，具有生物活性：野生型ngf与至少两类受体结合：原肌苷受体激酶a(trka)和低亲和力ngf受体(lngfr/p75ntr)。除非另有说明，术语“ngf”是指任何物种的ngf，优选哺乳动物物种；然而，人ngf始终是优选的。如本文所用，“hngf”代表人ngf。除非上下文另有说明，否则术语“ngf”和“hngf”是指野生型ngf，即hngf代表野生型ngf。野生型人ngf的氨基酸序列对应于seq id no：1的121-239位(图24中的灰色)。非人类ngf的序列可例如在科学文献中通过使用seq id no：1的121-239位作为诱饵的序列检索(如blast)以及在诸如swissprot等公共蛋白质数据库中获得。
[0075]
术语“ngf突变蛋白”和“ngf的突变蛋白”，或关于ngf的“其突变蛋白”，在本文中可互换使用，指特征在于与野生型ngf相比有至少一个突变的多肽，如本文进一步详细描述的。seq id no：3和seq id no：4的多肽是ngf的突变蛋白。优选地，ngf的突变蛋白与ngf，特别是人ngf具有80至99.5％的序列同一性，更优选地，突变蛋白与ngf，尤其是人ngf具有90至99％的序列同一性。
[0076]
关于ngf的术语“成熟部”、“成熟部分”可与术语“β-ngf”互换使用，是指ngf的多肽，其特征在于其不包含ngf的前肽(因此，当然，不是前原肽)。类似地，术语“成熟部分”也用于指seq id no：3或4的多肽，因为这些多肽同样不包含前肽(因此，当然，不是前原肽)。优选地，成熟部分也不包含野生型ngf开放阅读框编码的c端可切割肽；在人ngf的情况下，这种c端可切割肽由两个氨基酸残基“ra”(seq id no:1中的240和241)组成。更具体地，成熟部分可通过但不限于用蛋白酶弗林蛋白酶(以及能够分别精确地直接切割ngf或seq id no：3或4的多肽的第一个氨基酸残基的n末端的其他蛋白酶。例如，人类ngf和许多直系同源物的弗林蛋白酶切割位点众所周知由序列r1s2k3r4组成(单字母氨基酸代码，从n到c末端编号的序列；在图25中被加框))切割前ngf获得。在成熟的ngf中，通常既不存在弗林蛋白酶切割位点，也不存在弗林蛋白酶切割位点n端的任何氨基酸。为了说明，人ngf的成熟部分由seq id no：1的氨基酸位置122-239代表的多肽组成。可以鉴定非人ngf的成熟部分，例如通
过序列检索和/或序列分析，其中所述人ngf的成熟部分用于序列比对。
[0077]
术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸链，这两个术语包括但不限于图2所示的所有多肽。
[0078]
如本文所用，关于ngf的术语“前体”是指可通过蛋白水解切割获得ngf的任何肽序列。为了说明，前ngf和前原ngf及其变体都是ngf前体的典型例子。如本文所用，术语“前体”可以指前体，其最c端氨基酸残基是ngf的最c端残基，以及在c端延伸超过ngf的最c端残基的前体，只要ngf可通过蛋白水解切割从其获得：尽管野生型人前ngf(seq id no:1)的天然前体包含c端二肽(seq id no:1中的氨基酸残基240和241，图1中的粗体)，本发明优选前体不包含野生型ngf开放阅读框编码的c端可切割肽；在人ngf的情况下，这种c端可切割肽由两个氨基酸残基“ra”(seq id no:1中的240和241)组成。
[0079]
如本文所用，术语“前体肽”或“前体序列”通常可互换地指代由部分ngf开放阅读框编码的多肽序列，n-末端直接与前肽相邻。举例说明：前体肽是ngf，由包含从seq id no：1的残基1到seq id no：1的残基18的连续序列的序列组成。非人ngf前体的各个前体肽的序列可例如在科学文献中通过使用seq id no：1的1-18位作为诱饵的序列检索(如blast)以及在诸如swissprot等公共蛋白质数据库中获得。由前肽和前ngf组成的多肽或蛋白质，其中前肽的c端与前ngf的n端直接相邻，在本文中可称为“前原ngf”。
[0080]
如本文所用，术语“前肽”或“前序列”通常可互换地指在自然界中由部分ngf开放阅读框编码的多肽序列，n端直接与成熟ngf相邻，但该多肽序列不包括前体肽。举例说明：前肽包含在ngf的野生型前体中。ngf前体的前肽由包含从seq id no：1的残基19到seq id no：1的残基121的连续序列的序列组成。非人前ngf的各个前肽的序列可例如在科学文献中通过使用seq id no：1的19-121位作为诱饵的序列检索(如blast)以及在诸如swissprot等公共蛋白质数据库中获得。
[0081]“前ngf”，如本文所用，是指既包含ngf的成熟部分又包含相应的前肽但不包含相应的前体肽的肽序列。人前ngf由包含从seq id no：1的第19位残基到seq id no：1的至少第239位残基的连续序列的序列组成。尽管野生型人前ngf包含c末端二肽(seq id no:1中的氨基酸残基240和241，图25中的粗体)，优选地，本发明获得并使用的前ngf不包含由野生型ngf开放阅读框编码的c端可切割肽；在人ngf的情况下，这种c端可切割肽由两个氨基酸残基“ra”(seq id no:1中的240和241)组成。非人类前ngf的序列可例如在科学文献中通过使用seq id no：1的19-239位作为诱饵的序列检索(如blast)以及在诸如swissprot等公共蛋白质数据库中获得。
[0082]
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指rna和dna，包括cdna、基因组dna、合成dna和包含核苷酸类似物、磷酸盐类似物和/或糖类似物的dna/rna等价物。核酸可以是双链的或单链的(即，正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、开放阅读框、基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、sirna、微rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何类型和序列的分离核酸、核酸探针和引物，以及核酸类似物。核酸可以具有任何类型的三维结构。
[0083]
根据本发明的术语“肽”包括寡肽和多肽，是指包含两个或更多个，优选3个以上，优选4个以上，优选6个以上，优选8个以上，优选10个以上，优选13个以上，优选16个以上，优选21个以上，优选最多8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质，这些氨基酸通过
肽键共价连接成链。
[0084]
术语“蛋白质”优选指大肽，优选指具有超过100个氨基酸残基的肽，但一般而言，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用，除非上下文另有说明。因此，术语“seq id no:4的多肽和“seq id no:4的蛋白质”具有相同的含义。
[0085]
术语“药学上可接受的”一般描述某种物质可以以所使用的剂量施用于对象，任选地且优选地与药剂组合，而药剂不会引起无法耐受的副作用。
[0086]
术语“药学上可接受的运载体”和“药学上可接受的赋形剂”用于指任何一种或多种溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其在生理上是相容的并且适合于如本文所述施用于对象，或者不干扰这种施用。这种药学上可接受的运载体的实例包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。特别是对于液体药物组合物的情况，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的运载体还可以包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可提高药剂的保质期或有效性。药学上可接受的运载体通常包含在根据本发明的组合物中。
[0087]
术语“药学活性剂”是指可用于向对象施用的药剂，其中该药剂将有益于例如改善疾病或病症的症状。此外，当以治疗有效量施用于对象时，“药学活性剂”可以对对象的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。优选地，药学活性剂具有治疗特性并且可以被施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或减轻其严重性。药学活性剂可具有预防特性并可用于延迟疾病的发作或减轻此类疾病或病理状况的严重性。例如，如权利要求所述，本发明的药剂在本文中被认为是用于治疗囊性纤维化的药学活性成分。在另一个例子中，药学活性蛋白可用于治疗通常不表达蛋白质、或未达到所需水平、或错误表达蛋白质的细胞或个体，例如药学活性蛋白质可通过提供所需蛋白质来补偿突变或缺乏足够高的表达。术语“药学活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，也可以指其药学活性片段。它还可以包括肽或蛋白质的药学活性类似物。
[0088]“开放阅读框”或“orf”是一段连续的密码子，以起始密码子开始，以终止密码子结束。
[0089]
如本文所用，术语“对象”和“患者”涉及哺乳动物。例如，本发明上下文中的哺乳动物是人类、非人类灵长类动物、驯养动物(包括但不限于狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等)、实验动物(包括但不限于小鼠、大鼠、兔子等)、以及动物园动物等圈养动物。如本文所用，术语“对象”和“患者”特别包括人类。对象(人或动物)有两组染色体；也就是说，对象是二倍体。术语“患者”是指患有病症、有患病症风险、已经患有病症或预计患有病症的对象，并且可以对其进行治疗，例如通过施用药剂。患者的病情可能是慢性和/或急性的。因此，“患者”也可以描述为接受治疗和/或需要治疗的对象。
[0090]
术语“疗法”应被广义地理解并且是指以预防或治疗对象的病症为目标的对象中的治疗。在优选的实施方式中，疗法具体包括对对象施用药剂。
[0091]
如本文所用，术语“胰蛋白酶”通常指归类为ec 3.4.21.4)的蛋白水解酶。胰蛋白酶通常情况下主要在赖氨酸或精氨酸氨基酸的羧基侧切割肽链，除非其中任何一个后面是脯氨酸。不希望受理论束缚，应当理解胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，并且胰蛋白酶天然存在于许多脊椎动物的消化系统中，其中其水解蛋白质。在本发明中优选的是来自重组来源
的胰蛋白酶。尽管在体内，胰蛋白酶与前肽(称为“胰蛋白酶原”)一起形成，但本文所用的术语“胰蛋白酶”优选是指没有任何前肽的成熟胰蛋白酶。使用胰蛋白酶进行蛋白水解切割也可以称为“胰蛋白酶蛋白水解”或“胰蛋白酶化”，用胰蛋白酶切割产生的蛋白质被称为“胰蛋白酶化的”。
[0092]
ngf前体或seq id no:3或4的多肽的“变体”指一种多肽或蛋白质，其中分别不是成熟ngf(β-ngf)的一部分或不是seq id no:3或4的一部分的氨基酸序列的特征在于与ngf的野生型前体相比有至少一个突变，例如野生型前ngf或野生型前原ngf；所述至少一种突变优选地位于成熟ngf(β-ngf)的氨基酸序列的n端。因此，如本文所用，ngf前体的“变体”等是指一种肽或蛋白质，其中前体肽和/或前肽的特征在于前体肽和/或前肽的氨基酸序列的至少一个突变，例如但不限于在wo 2013/092776 a1和us 2018/0086805 a1中描述的那些变体。为了说明，wo 2013/092776 a1描述了前ngf的“变体”，其中(野生型)弗林蛋白酶切割位点由于一个或多个特定突变而缺失。
[0093]
术语“载体”或“克隆载体”通常是指可以引入宿主细胞的核酸。示例性载体包括但不限于质粒、噬菌体和可引入宿主细胞的所有其他类型的核酸。术语“载体”应被广义地理解并且将包括编码用于异源表达的肽或蛋白质的载体(此类载体可用作模板，用于产生转录物)，以及那些不编码的载体。第一类型的载体将包含编码蛋白质或肽的开放阅读框，当该载体存在于宿主细胞中时，其可以被表达。尽管技术人员将选择的载体类型将取决于技术人员将选择的宿主细胞类型，在特定情况下，包括大肠杆菌在内的所有常见宿主细胞的克隆载体都是可商购的，因此技术人员将在充分考虑所选宿主细胞的情况下选择特定载体。
[0094]
术语“野生型”在本文中用于指通常在自然界中，优选在健康对象中发现的基因或蛋白质。不是“野生型”的基因或蛋白质在本文中被称为“突变体”或“突变的”等。举例说明，seq id no：1显示了野生型人ngf前体的氨基酸序列；seq id no：2显示野生型人ngf的氨基酸序列。
[0095]
本发明基于若干发现，这些发现相互关联并因此共同引导发明人得出本发明的各个方面，这些方面将在下文中单独描述。
[0096]
根据本发明的药剂
[0097]
本发明提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物对象眼科病症的药剂。可用于向对象施用的药剂，其中该药剂将有益于例如改善疾病或病症的症状。特别是，可用于本发明的药剂是seq id no：3或seq id no：4的多肽。因此，本发明特别提供了用于疗法的seq id no：3或seq id no：4的多肽。疗法通常包括将所述多肽给予人体或动物体，如下文所述。
[0098]
根据本发明，提供seq id no：3和seq id no：4的多肽作为药物活性剂。通过本发明，提供了seq id no：3或seq id no：4的多肽用于医疗用途，特别是用于治疗和/或预防哺乳动物对象的眼科病症。任选地，seq id no：3或seq id no：4的多肽来自重组来源。因此，本发明还提供了用于医学用途的seq id no：3或seq id no：4的重组多肽，如本文所述。
[0099]
现在将更详细地描述根据本发明的药剂，本文也称为“seq id no：3的多肽”或“seq id no：4的多肽”。术语“seq id no:3的多肽”和类似术语在本文中表示包含由seq id no:3定义的氨基酸序列的多肽和/或具有等效生物活性的药剂。术语“seq id no:4的多肽”和类似术语在本文中表示包含由seq id no:4定义的氨基酸序列的多肽和/或具有等效生
物活性的药剂。因此，在这些术语中还包括此类多肽的功能等价部分或类似物。多肽的生物学等价部分的一个例子可以是seq id no:3的多肽或seq id no:4的多肽的结构域或子序列，其包括使结构域或亚序列能够发挥与seq id no：3的全长多肽或seq id no：4的全长多肽或编码这种多肽的基因基本相同的生物活性的结合位点。术语“基本上相同的生物活性”是指在实施例4所述的测定中具有seq id no:3的多肽或seq id no:3的多肽的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％并且最优选至少97％，至少98％或至少99％的活性的等效部分或类似多肽。多肽的生物学等效类似物的例子可以是融合蛋白，其包括seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽的氨基酸序列的至少一部分，但它也可以是多肽的同源类似物。此外，模拟seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽的特定生物活性的完全合成分子将构成“生物学等效类似物”。
[0100]
更优选地，术语“seq id no:3的多肽”和类似术语在本文中表示包含由seq id no:3定义的氨基酸序列的多肽；此类药剂任选地是融合蛋白，其尤其包含由seq id no：3定义的氨基酸序列。最优选地，术语“seq id no:3的多肽”和类似术语在本文中表示由seq id no:3定义的氨基酸序列组成的多肽；在该实施方式中，药剂由多肽组成，该多肽由seq id no：3所定义的顺序排列的118个氨基酸残基组成。在这个和其他实施方式中，多肽任选地带有一个或两个或三个内部半胱氨酸键，使得半胱氨酸(cys，c)残基彼此共价连接以形成分子内二硫键。半胱氨酸键优选等同于野生型人ngf中的那些。
[0101]
同样更优选地，术语“seq id no:4的多肽”和类似术语在本文中表示包含由seq id no:4定义的氨基酸序列的多肽；此类药剂任选地是融合蛋白，其尤其包含由seq id no：4定义的氨基酸序列。最优选地，术语“seq id no:4的多肽”和类似术语在本文中表示由seq id no:4定义的氨基酸序列组成的多肽；在该实施方式中，药剂由多肽组成，该多肽由seq id no：4所定义的顺序排列的118个氨基酸残基组成。在这个和其他实施方式中，多肽任选地带有一个或两个或三个内部半胱氨酸键，使得半胱氨酸(cys，c)残基彼此共价连接以形成分子内二硫键。半胱氨酸键优选等同于野生型人ngf中的那些。
[0102]
本发明的多肽可以任选地以进一步的翻译后修饰为特征。这种翻译后修饰任选地包括糖基化和/或磷酸化。然而，优选地，根据本发明的多肽没有糖基化和/或磷酸化。实际上，考虑到本文的实验实施例证明了对眼部病症治愈的有益作用和有益的益处-副作用比，由此使用的多肽是通过在细菌中的胞质重组表达获得的，这通常不会导致糖基化和/或磷酸化，因此本发明的有益效果不依赖于这种类型的翻译后修饰是合理的。因此，在优选的实施方式中，根据本发明的多肽不以糖基化和/或磷酸化为特征。
[0103]
通常，根据本发明的多肽是非天然多肽，其不是由施用该多肽的对象天然产生的。这不仅与施用后对象的可检测性优势相关，而且还证明需要对对象施用(来自外部来源，例如根据本公开制备的组合物)以在病症的治疗或预防中取得成功。
[0104]
优选地，根据本发明的多肽是分离的多肽。更优选地，根据本发明的多肽基本上不含宿主细胞蛋白、降解产物(例如des-nona变体)和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)。当根据本发明的多肽基本上不含宿主细胞蛋白、降解产物(例如des-nona变体)和蛋白酶(例如胰蛋白酶)时，也可以称为“纯多肽”。优选地，根据本发明的多肽作为纯多肽施用。更优选地，相对于组合物中的总蛋白质，由seq id no：3组成的纯多肽和/或由seq id no：4组成的纯多肽的重
量百分比为90％或更多，优选92％或更多，更优选93％或更多，更优选94％或更多，更优选96％或更多，更优选97％或更多，更优选98％或更多，更优选99％或更多，更优选99.2％或更多，更优选99.4％或更多，更优选99.6％或更多，更优选99.8％或更多，更优选99.9％或更多。此类纯多肽基于本文的公开内容可获得，包括实施例1和2。最优选地，根据本发明的纯多肽具有与良好生产规范(gmp)相容的纯度等级。
[0105]
如本文的实验，特别是实施例4中所证明的，根据本发明的药剂的给药剂量在单独的实验中没有诱发任何痛觉过敏综合征(疼痛)。没有疼痛是特别显著的，因为该药剂局部和反复施用于受损的眼睛，也在慢性环境中(详情参见实施例)。
[0106]
任选地，根据本发明，将有效量的seq id no：3或seq id no：4的多肽施用于有需要的对象。下文描述了施用、有效量和有需要的对象的细节。
[0107]
由seq id no：3和seq id no：4组成的多肽分别与人神经生长因子(ngf，也称为野生型人ngf或野生型ngf，参见seq id no：2)的氨基酸序列在一个或两个位置上不同。本发明多肽与seq id no：2多肽的差异对治疗或预防眼部病症具有显著效果，且无副作用，如本文所详述并有本文实验实例支持。
[0108]
神经生长因子(ngf)是特定神经元群体发育和生存所需的神经营养因子。ngf是一种同源二聚体肽，可自然触发神经元的增殖和稳态。在体内，ngf与至少两种类型的受体结合：原肌苷受体激酶a(trka)和低亲和力ngf神经营养因子受体p75(lngfr/p75ntr/p75)。两者都与人类和动物的某些疾病有关，尽管各自的作用机制可能不同。已经提出了几种ngf的治疗应用，但很少有成熟的市场。
[0109]
然而，过去设想的ngf的许多治疗用途尚未成熟到上市的治疗性ngf产品，其中一个原因可以看出，ngf除了对神经元增殖和稳态的预期作用外，还与疼痛有关：当局部或全身施用时，它会引起痛觉过敏(lewin等，1994，eur.j.neurosci.，卷6，1903-1912页；della seta等，1994，pharmacol.biochem.behav.，卷49，701页；dyck等，1997，neurology，卷48，501-505页；mcarthur，等，2000，neurology，卷54，1080-1088页；svensson等，2003，pain，卷104，241-247页；ruiz等，2004，brain res.，卷1011，1-6页)。作为一种解决方式，开发了ngf的突变版本(“突变蛋白”)，其与伤害感受活性降低相关(“无痛ngf”)，其特征在于ngf结构域中的至少一个突变与trka受体相互作用(wo 2008/006893 a1,malerba等。plos one，2015，卷vol，e0136425)。然而，到目前为止，公众还不能获得药学上可接受的纯度的此类多肽，并且可能还考虑到对该治疗领域中生长因子研究的偏见和普遍负面经验，尚未提出或开发用于治疗或预防眼部眼科病症。
[0110]
已知(野生型)ngf通过与两个独立的受体结合来影响靶细胞，(a)受体酪氨酸激酶a(trka)，导致神经元存活，和(b)p75神经营养因子受体，参与调节细胞死亡(mesentier-louro等，2017,int.j.mol.sci.,卷18(98)，因此，具有野生型ngf的多肽序列元件，在视神经挤压后，也可能具有通过刺激细胞凋亡而加剧视网膜变性的作用，参见mesentier-louro等，2018，mol.neurobiol.，vol.56，1056-1069页。还已知野生型人ngf的残基r100参与ngf与p75的结合，并且该残基的突变影响p75结合，参见例如wo2008/006893a1。与野生型ngf、hngf相比，本发明的多肽对p75具有较低的结合亲和力(参见例如malerba等，2015，plosone，10(9)：e0136425)。人ngf p61sr100e对应于seq id no：4的多肽。在人ngf的几种突变体(hngf突变体)中，突变体人ngf p61sr100e被认为是最有前途的，并且提到该突变体
尤其适用于眼科疾病。然而，那些参考文献没有教导根据本发明的治疗和/或预防的具体用途，并且那些参考文献也未能使相应的多肽以足够高的纯度获得以使其能够在人类中用于医学用途。因此，根据本发明使用的多肽，如本文所描述和提供的，与野生型人ngf相比提供了几个意想不到的优势。特别地，本发明的实验发现(参见实施例)不能仅仅通过根据本发明的药剂是“无痛的”这一事实来解释，因为它诱发疼痛的能力从未在眼睛的神经支配区域(即以暴露的伤害感受器为特征的区域)进行过实验研究。此外，即使根据本发明的药剂的施用引起神经强化(参见例如实施例3)，施用与疼痛无关。
[0111]
根据本发明，seq id no：3或其seq id no：4的多肽的稳定性和因此的长期纯度可以通过本文描述的方面和实施方式获得和/或改善。因此，本公开不仅提供了一种用于眼科病症的新的治疗或预防，而且还提供了适用于这种治疗或预防的药剂，其纯度等级适用于治疗应用，包括给予哺乳动物。在本发明的药剂以前无法以如此有利的纯度等级向公众提供。
[0112]
seq id no：3或seq id no：4的多肽在自然界中不存在，也可称为非天然多肽。因此，根据本发明的药剂不是野生型ngf，尤其不是野生型人ngf。
[0113]
优选地，根据本发明的非天然多肽以高纯度提供。任选地，多肽包含内部二硫键。任选地，多肽被适当折叠。任选地，多肽可溶于水性介质。
[0114]
本发明部分地基于对视神经损伤或病症的动物模型的实验(参见实施例4)。与安慰剂治疗的动物相比，该多肽在涉及视神经损伤和/或病症的病症的治愈时间方面诱导了显著的和剂量依赖性的改善。这种改善在没有与疼痛相关的副作用的剂量下是明显的，因此证明了对现有技术的潜在益处。
[0115]
特别地，在涉及视神经损伤和/或病症的病症的体内模型中产生的数据已经证明本发明的多肽是无痛的，但仍保留靶向ngf受体系统的活性，并由此提供作为治疗或预防眼科病症的治疗手段。实际上，本发明的多肽保留了野生型ngf对血管生成和神经再支配的营养特性，这有利于视神经的愈合，而不在应用部位和全身水平上发挥野生型ngf的伤害感受前效应。
[0116]
本发明提供用于治疗和/或预防哺乳动物对象的眼科病症的多肽，其中所述多肽选自seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽。因此，本发明还提供了seq id no：3或seq id no：4的多肽，用于如本文所述通过疗法治疗人体或动物体的方法。
[0117]
更具体地，本发明涉及seq id no:3的多肽和seq id no:4的多肽的特定治疗用途，其中特定治疗用途是治疗和/或预防哺乳动物对象的眼科病症。因此，本发明还提供了seq id no:3的多肽和seq id no:4的多肽，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中，其中所述疗法包括治疗和/或预防哺乳动物对象的眼科病症。哺乳动物对象通常是以需要这种治疗为特征的对象。
[0118]
seq id no：3的多肽以及seq id no：4的多肽的特征在于人ngf的氨基酸序列(hngf，seq id no：2)的突变，其中所述突变与伤害感受活性降低相关。尤其，hngf的100位精氨酸被谷氨酸取代。本发明部分基于令人惊讶的发现，即可以在没有现有技术已知的副作用的情况下实现治疗效果。
[0119]
不希望受限于特定理论，优选根据本发明的多肽包含一个或多个二硫键，最优选三个二硫键。成熟且正确折叠的人ngf以三个二硫键为特征(连接位置
位置编号参考seq id no：1；参见wiesmann等，1999，nature，卷401，184-188页)。不希望受限于特定理论，优选地，根据本发明的多肽包含等效的二硫键(其位置编号对于本领域技术人员而言可通过将根据本发明的多肽与seq id no：1和wiesmann等人的多肽进行比对而获得。
[0120]
有无不良反应的描述
[0121]
优选地，治疗和/或预防不会在施用或已经施用多肽的对象中引起副作用或不良作用。因此优选地，本发明多肽的施用不会导致哺乳动物对象中的任何不良影响。
[0122]
在这种情况下优选不存在的一种副作用或不良作用是痛觉过敏或疼痛。特别优选根据本发明的治疗和/或预防不会引起哺乳动物对象的痛觉过敏。因此，优选地，根据本发明的药剂的施用不诱导任何痛觉过敏综合征(疼痛)。
[0123]
重要的是要指出，与疼痛相关的参照化合物(例如野生型ngf)的施用相比，没有疼痛不仅会导致更愉快(或不那么不愉快)的治疗，而且至少是成功治疗或预防眼部病症的部分原因：考虑到根据本发明的多肽优选局部施用，更优选局部施用到眼睛上，不存在疼痛将使受治疗的对象能够接受多肽的施用而没有不良反应，例如刮掉或洗掉它或以其他方式去除它以避免疼痛，并且因此，该多肽将发挥治疗上有益的作用，例如治疗或预防眼部病症。因此，不存在与本发明的多肽相关的疼痛将适合于克服消费者的不情愿和监管机构的担忧。换句话说，与与疼痛相关的药物相比，没有疼痛与收益风险比的显著增加有关。
[0124]
特别地，优选地，治疗和/或预防不会引起哺乳动物对象的痛觉过敏。在一个实施方式中，给予本发明多肽的对象不患有机械性异常性疼痛。更准确地说，在给予本发明多肽的对象中不会诱发机械性异常性疼痛，因此给予该多肽的对象不会患有机械性异常性疼痛。
[0125]
在这种情况下优选不存在的另一个副作用或不良作用是恶性肿瘤或癌症。特别地，本发明的多肽对对象的施用优选与异常细胞生长无关，甚至更优选与可能侵入或扩散到身体其他部位的异常细胞生长无关。特别优选，本发明的多肽对对象的施用与眼癌无关。
[0126]
因此，总而言之，优选地，向对象施用本发明的多肽与诸如恶性肿瘤和/或疼痛的副作用无关。
[0127]
通常，根据本发明的药剂的施用被对象很好地耐受。特别地，优选地，根据本发明的多肽的施用与对象中抗药物抗体的形成无关。实际上，由于根据本发明的多肽的氨基酸序列与野生型人ngf仅在一个或两个氨基酸位置上不同，因此在人中的免疫耐受性是特别有利的，这似乎是合理的，并且本发明的多肽的施用与人体内抗药物抗体的形成无关，这似乎是合理的。
[0128]
优选地，根据本发明的施用对以下一项或多项产生积极影响：炎症、细胞外基质沉积、神经支配和血管生成。
[0129]
多肽的可检测性
[0130]
优选地，根据本发明使用的多肽可以被关于内源性(例如人)ngf的特定试剂选择性地识别。术语“选择性识别的”和“可检测的”在本文中可互换使用，通常是指生物样品中蛋白质的特异性鉴定，优选通过分子手段进行鉴定。
[0131]
在这方面，根据本发明的多肽优选地可被抗体或其他免疫反应性分子检测到。
[0132]
可被抗体或其他免疫反应性分子检测的蛋白质也可以称为抗原。在一些实施方式
中，生物样品可以通过展示或不展示一种或多种特异性抗原来表征。在本发明的上下文中，施用给对象的多肽优选地在多肽施用后在从对象获得的生物样品中是可检测的。显示蛋白质存在的一种非限制性方式是通过蛋白质印迹法，但其他免疫学方法同样包括在本发明的上下文中。抗体或其他免疫反应性分子本身被标记(例如荧光团标记)，或被标记的二抗或其他免疫反应性分子识别，后者为此目的添加。因此，在一些情况下，还添加有助于检测的二级分子，例如任选标记的二级抗体以促进检测。
[0133]
根据本发明，如果抗原水平高于检测限和/或如果水平高到足以允许添加到样品中的抗原特异性抗体结合，则称抗原存在于生物样品中。根据本发明，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不能被添加到样品中的抗原特异性抗体结合，则称抗原不在细胞上表达。
[0134]
抗体或其他免疫反应分子可以识别细胞上的表位。术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即分子中被免疫系统识别(即结合)，例如被抗体或其他免疫反应分子识别的部分或片段。对任何特定抗原特异的表位的检测通常可以得出结论，该特定抗原存在于被分析的细胞上。
[0135]
在一个实施方式中，从对象，特别是已经给予根据本发明的多肽的对象获得的样品可以通过免疫表型来表征。“免疫表型分析”通常是指细胞或样品可以通过抗原特异性分子(例如抗体或其他免疫反应分子)来表征，这些分子被添加到样品中以确定是否存在抗原。免疫表型分析包括使用各种方法(包括流式细胞术)进行细胞分选，以及对裂解细胞和裂解样品的分析方法，例如蛋白质印迹法。
[0136]
在本发明中，特别优选即使存在野生型ngf如野生型人ngf也能被特异性检测的多肽。尽管氨基酸序列的任何突变，例如任何点突变，都可以使多肽即使在相应的非突变野生型多肽存在的情况下也可特异性检测，因此即使在存在野生型人ngf的情况下，seq id no:3的多肽和seq id no:4的多肽中的每一个也可以被初步特异性地检测到，尤其是seq id no：4的多肽，其可用抗体将所述多肽与野生型人ngf区分开来(wo 2008/006893 a1)。
[0137]
因此，优选地，多肽的特征在于在61位处至少不存在脯氨酸(其存在于seq id no：2的61位，供参考)，更优选地，特征在于在61位处脯氨酸被另一个氨基酸取代。在一个特别优选的实施方式中，61位的脯氨酸被丝氨酸取代。在该优选实施方式中，根据本发明使用的多肽是seq id no：4的多肽。该多肽的特征在于在61位处至少不存在脯氨酸，更优选61位的脯氨酸被另一个氨基酸取代。在seq id no：4中，seq id no：3的61位的脯氨酸被丝氨酸取代。
[0138]
眼科病症
[0139]
根据本发明，根据本发明的多肽用于治疗和/或预防眼科病症。对于此类用途及其所有实施方式，seq id no：4的多肽是特别优选的。
[0140]
眼科病症可以是遗传性和/或获得性眼科病症。
[0141]
在一些实施方式中，眼科病症是或包括眼部损伤。在一个实施方式中，眼部损伤包括视神经和/或视网膜的损伤和/或病症。
[0142]
尽管本文以单数形式使用诸如“眼科病症”、“损伤”、“病症”、“眼睛”、“视神经”、“视网膜”等术语，本发明还适用于患有多种眼科病症、损伤、病症的对象，并且适用于对对象的所有(两只)眼睛、所有(两只)视神经和所有(两只)视网膜进行施用和治疗。
[0143]
根据本发明要治疗或预防的优选病症是涉及视路的疾病。一般来说，视路包括视网膜、视神经、视交叉、视辐射和枕叶皮质。因此，根据本发明要治疗或预防的优选病症是影响视网膜、视神经、视交叉、视辐射和枕叶皮质中的任何一种或多种的病症。沿视路的损伤会导致多种视野缺损。根据本发明可以治疗或预防这种视野缺损。因此，本发明还考虑治疗和/或预防视野缺损，包括部分和完全视力丧失。
[0144]
眼科病症包括但不限于眼疲劳，红眼，夜盲症，懒惰眼，交叉眼(斜视)，眼球震颤，色盲，葡萄膜炎，老花眼，视力模糊，眼痛，光敏感，飞蚊症，眼睛干涩，过度流泪，白内障，青光眼，视网膜疾病，结膜炎，角膜疾病，眼痛，眼睑问题，视力改变，视力下降，与隐形眼镜相关的问题，与视神经损伤和/或疾病相关的疾病以及与视网膜神经节细胞损伤和/或疾病相关的疾病。可以将根据本发明的多肽施用于患有任何这些病症的对象，以治疗相应的病症。替代地或附加地，可以将根据本发明的多肽施用于具有患有任何这些病症风险的对象，以预防相应的病症。本发明也适用于包括青光眼、神经营养性角膜炎、视神经炎、视神经萎缩、视神经乳头玻璃疣和视路胶质瘤在内的疾病列表，但不限于此。本发明适用的视神经神经病变包括但不限于以下：青光眼、视路胶质瘤、前部缺血性视神经病变、创伤后视神经病变、脑积水后视神经萎缩、视神经纤维的跨突触变性、视前交叉通路受压、常染色体显性遗传性视神经萎缩、leber遗传性视神经病变、wolfram综合征视神经病变。
[0145]
本发明还包括但不限于以下列表中的一种或多种病症的治疗和预防：常染色体显性遗传性视神经萎缩、leber遗传性视神经病变、前部缺血性视神经病变、创伤性视神经病变、视路胶质瘤、神经营养性角膜炎、角膜溃疡、青光眼、色素性视网膜炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜神经节细胞功能障碍。
[0146]
特别优选的是根据本发明的多肽用于治疗和/或预防涉及视神经的眼科病症的用途。在一些实施方式中，视神经受损或受影响。如例如实施例4所示，当在本发明的一个实施方式中施用时，本发明的多肽对此类眼科病症具有直接的疗效。因此，优选地，通过使用根据本发明的多肽来治疗和/或预防的眼科病症涉及视神经的损伤和/或病症。本文描述了具有这种视神经损伤和/或病症的对象，并且本发明和以下对涉及视神经的具体损伤和/或病症的描述适用于所有这样的对象，除非上下文另有说明。涉及视神经损伤和/或病症的病症包括但不限于青光眼、神经营养性角膜炎、视神经炎、视神经萎缩、视神经乳头玻璃疣和视路胶质瘤。本发明包括治疗和/或预防所有这些病症以及涉及视神经的其他病症。在这样的实施方式中，提供根据本发明的药剂用于治疗或预防涉及视神经损伤和/或病症的病症。
[0147]
特别优选的是根据本发明的多肽用于治疗和/或预防涉及视网膜的眼科病症的用途。在一些实施方式中，视网膜受损或受影响。视网膜是哺乳动物眼睛最内层的感光组织层。眼睛在视网膜上以光学方式创建视觉世界的聚焦二维图像，视网膜将该图像转化为大脑的神经冲动以产生视觉感知。神经视网膜由通过突触互连的几层神经元组成，并由外层色素上皮细胞(感光细胞)支撑。优选地，所述眼科病症的特征在于视网膜的病症。例如，该病症可能由神经视网膜和/或视网膜上皮细胞的病症引起。优选的视网膜疾病包括黄斑变性(与年龄有关或与年龄无关)、视网膜病变(糖尿病性视网膜病变与否)、色素性视网膜炎、视网膜母细胞瘤、视杆状营养不良(cord)和视网膜脱离(视网膜分离)，色素性视网膜炎通常是遗传性的并导致夜视力和周边视力丧失。黄斑变性的特征是由于黄斑中的细胞死亡或受损而导致中心视力丧失。在视网膜分离中，视网膜从眼球后部脱离。高血压性视网膜病和
糖尿病性视网膜病均以对供应视网膜的微小血管的损害为特征，并且在一些实施方式中由糖尿病引起。视网膜母细胞瘤是一种视网膜癌。在一些实施方式中，视神经受到物理损伤或影响，例如视神经挤压(onc，实施例4)和视路胶质瘤。本发明包括所有这些和其他视网膜疾病的治疗和/或预防。在这样的实施方式中，提供根据本发明的药剂用于治疗预防涉及视网膜损伤和/或病症的病症。
[0148]
在一些实施方式中，将根据本发明的多肽施用于患有神经病变的对象。在优选的实施方式中，根据本发明的药剂用于给予患有神经病变，例如特别是视神经的神经病变的对象。这样的对象可以是糖尿病或非糖尿病对象。神经病变可能是局部的或全身的。在一些实施方式中，根据本发明的施用可以减少对象的神经病变。神经病变的减轻可以是局部的和/或全身的。在一个实施方式中，减少神经病变包括减少施用本发明多肽的眼睛中的神经病变。本发明适用的视神经神经病变包括但不限于以下：青光眼、视路胶质瘤、前部缺血性视神经病变、创伤后视神经病变、脑积水后视神经萎缩、视神经纤维的跨突触变性、视前交叉通路受压、常染色体显性遗传性视神经萎缩、leber遗传性视神经病变、wolfram综合征视神经病变。本发明明确考虑对儿童施用，特别是但不限于以下情况：脑积水后视路胶质瘤和视神经萎缩。
[0149]
特别优选的是根据本发明的多肽用于治疗和/或预防涉及视网膜神经节细胞的眼科病症的用途。在一些实施方式中，视网膜神经节细胞受损或受影响。此类疾病已被例如garcia等，2016,cytokin groth fact.rev.，卷34，1359-1601页和levin等，2002,progr.retin.eye res.,卷21，465-484页所描述。一般来说，视网膜神经节细胞(rgc)是一种位于眼睛视网膜内表面(神经节细胞层)附近的神经元。然而，所有视网膜神经节细胞也有一个长轴突延伸到大脑中。这些轴突形成视神经、视交叉和视束。因此，许多涉及视神经的疾病也是涉及视网膜神经节细胞的疾病，反之亦然。这些术语并不相互排斥。同样，许多涉及视网膜的疾病也是涉及视网膜神经节细胞的疾病，反之亦然。这些术语并不相互排斥。无论如何，在本发明的优选实施方式中，待治疗和/或预防的眼科病症优选以视网膜神经节细胞病症为特征。涉及视网膜神经节细胞损伤和/或病症的病症包括但不限于青光眼、视路胶质瘤、前部缺血性视神经病变、创伤后视神经病变、脑积水后视神经萎缩、视神经纤维的跨突触变性、视前交叉通路受压、常染色体显性遗传性视神经萎缩、leber遗传性视神经病变、wolfram综合征视神经病变。本发明明确考虑对儿童施用，特别是但不限于以下情况：脑积水后视路胶质瘤和视神经萎缩。在一些实施方式中，rcg受到物理损伤或影响，例如视神经挤压(onc，实施例4)和视路胶质瘤。本发明包括所有这些和其他涉及rgc损伤和/或病症的病症的治疗和/或预防。在这样的实施方式中，提供根据本发明的药剂用于治疗预防涉及rgc损伤和/或病症的病症。
[0150]
根据本发明要治疗和/或预防的最优选的眼科疾病选自青光眼、视路胶质瘤、前部缺血性视神经病变、创伤后视神经病变、脑积水后视神经萎缩、视神经纤维的跨突触变性、视前交叉通路受压、常染色体显性遗传性视神经萎缩、leber遗传性视神经病变、wolfram综合征视神经病变。本发明明确考虑对儿童施用，特别是但不限于以下情况：脑积水后视路胶质瘤和视神经萎缩。
[0151]
本发明的药剂特别适合的对象
[0152]
根据本发明，可以将seq id no：3或seq id no：4的多肽施用于需要这种施用的对
象。需要这种施用的对象可以是患有本文所述的病症的对象、有患这种病症的风险的对象、或以其他方式患有这种病症的对象。该药剂以治疗有效量施用于对象。治疗有效量可以由医师根据本文的公开内容确定。
[0153]
具体而言，将根据本发明的多肽施用于哺乳动物对象。对象也可以称为“患者”。最优选地，所述哺乳动物对象是人。
[0154]
对象可以是成人对象或非成人对象，例如儿童或青少年。在本发明中明确考虑了对儿童的施用。
[0155]
本发明还涉及治疗患有眼科病症的患者的方法，其中该方法包括向患者施用有效量的seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽。术语“患者”和“对象”在本文中可互换使用，特别是指以本文所述的眼科病症为特征的患者/对象。
[0156]
优选地，眼科病症的特征在于对象的视神经和/或视网膜和/或视网膜神经节细胞的损伤和/或病症。这种损伤和/或病症包括视网膜神经节细胞的功能障碍和功能降低。以视神经和/或视网膜和/或视网膜神经节细胞的损伤和/或病症为特征的疾病已在上文进行了描述，以下对对象的描述适用于此类对象的所有此类损伤和/或病症，除非上下文另有规定。
[0157]
在本发明的上下文中，术语“预防”应被广义地理解并且不仅包括预防病症的发作，还包括预防病症的进展。特别地，在涉及视神经损伤和/或病症的病症的上下文中，术语“预防”还包括预防视神经损伤的进一步进展。
[0158]
在本发明的上下文中，术语“治疗”应被广泛理解并且包括但不限于病症症状的改善。实际上，优选并且还通过本文的实验实施例证明，实现眼科病症的改善、例如视力的(部分)恢复或病况或病症的其他改善或转好，是如本文要求保护的本发明的优选组成部分。实际上，获得要求保护的治疗效果是本发明的功能性技术特征。本文的实施例使作为施用本发明多肽的直接结果可实现所述功能性技术特征是合理的。换言之，本发明人已经确定本发明的多肽是患有眼科病症的对象中实现改善的起因。眼科病症优选以视神经的损伤和/或病症为特征。
[0159]
本发明特别适用于患有眼科病症的对象亚组。此类亚组在本文中进行了描述。特定对象也可能属于本文所述的一个或多个亚组；将根据本发明的多肽施用至落入本文所述的亚组之一的对象与将根据本发明的多肽施用至落入本文所述的多于一个亚组的对象同样包含在本发明中。
[0160]
本发明不限于视神经损伤和/或病症的特定原因。视神经损伤和/或病症的机械原因以及其非机械原因包括在本发明中。而且，视神经损伤和/或病症的糖尿病原因以及其非糖尿病原因包括在本发明中。
[0161]
在一些实施方式中，根据本发明的多肽任选地用于施用于已经历手术的对象。因此，根据本发明的多肽适用于治疗或预防眼中的一种或多种术后并发症。或者，根据本发明的多肽也适用于在对象中预防手术。例如，在视路胶质瘤中，可以通过施用本发明的多肽来加强视神经，这可以使手术变得不必要或可有可无。因此，本发明还提供了一种非侵入性施用。
[0162]
本发明适用于治疗糖尿病和非糖尿病对象的眼科病症，例如特别是视神经的损伤和/或病症。上文描述了视神经损伤和/或病症的进一步细节。
[0163]
糖尿病患者可能会出现眼科病症。可以基于本发明治疗和/或预防此类眼科病症。
[0164]
在一些实施方式中，被施用本发明多肽的哺乳动物优选为人，其患有糖尿病或具有患糖尿病的倾向；相应的对象在本文中被称为“糖尿病对象”。
[0165]
糖尿病是一种常见且使人衰弱的疾病，会影响多种器官。用于检测糖尿病的方法是本领域众所周知的。在一个实施方式中，检测糖尿病的方法不是本发明的一部分，但它们可以促进根据本发明的眼科病症的治疗或预防。
[0166]
在典型的实施方式中，糖尿病选自1型糖尿病和2型糖尿病。
[0167]
任选地，眼科病症包括由糖尿病引起的或以其他方式涉及糖尿病的病症。因此，本发明适用于患有糖尿病的对象以及未患有糖尿病的对象。在一些实施方式中，根据本发明的药剂用于向糖尿病患者施用。因此，本发明的多肽可以施用于糖尿病对象的眼睛。因此，在一个实施方式中，根据本发明的多肽的用途包括向糖尿病对象的眼睛施用。
[0168]
因此，本发明提供了对受糖尿病影响的对象的眼科病症的治疗和/或预防。实际上，根据本发明，有效的医学治疗不仅可以帮助患者从这些眼部并发症中恢复，而且还可以使他们获得更好的生活质量和减少医疗护理和/或费用。
[0169]
因此，本发明提供了优于目前的治疗方法的优势，目前的治疗方法通常不能提供治疗眼科病症的有效方法。本发明提供了这种眼科病症的治疗和/或预防。
[0170]
眼部施用
[0171]
根据本发明的治疗或预防可以通过施用、优选局部施用本发明的多肽来进行。根据本发明，对象的眼睛是本发明多肽的优选施用部位。一般而言，当本文中提到将多肽施用到对象的眼睛上时，除非上下文另有说明，否则这种施用可以是在眼睛表面上或眼睛内。
[0172]
优选地，所述多肽用于向眼睛施用。更优选地，施用选自向眼睛局部施用和玻璃体内施用，其中向眼睛局部施用是最优选的。
[0173]
在优选的实施方式中，根据本发明的药剂用于治疗或预防涉及视神经损伤和/或病症的病症，并且为此目的，将其施用于眼睛。根据本发明，该多肽适用于治疗或预防视神经的损伤和/或病症，并且为此目的，将其施用于眼睛。
[0174]
本发明不限于仅一只眼睛患有眼科病症的对象，也不限于双眼患有眼科病症的对象。因此，术语“眼睛”和“视神经”，独立于它们在本公开中以单数或复数形式使用，明确地包括所有那些单数和复数实施方式。
[0175]
在一些实施方式中，施用在医院进行。在一些实施方式中，治疗不是在医院进行的。例如，滴眼剂施用通常不需要对象住院。
[0176]
任选但不相互排斥的眼科疾病包括至少一种机械损伤。因此，本发明还包括机械损伤的治疗或预防，其中这种损伤的治疗实际上比预防更有意义。此类病症包括涉及视神经挤压(onc)的病症和影响视神经的其他病症。
[0177]
总之，如本文详述，根据本发明，将多肽施用于患有或有患眼疾风险的对象的眼睛。
[0178]
在另一个实施方式中，根据本发明的药剂用于治疗或预防眼部癌症，例如但不限于视路胶质瘤，和/或与此类癌症相关的眼部病症。
[0179]
在进一步的实施方式中，根据本发明的药剂用于治疗或预防由对象的遗传病症引起或受对象的遗传病症影响的眼科病症。
[0180]
施用途径
[0181]
本发明提供了用于施用于对象的异源多肽。
[0182]
优选地，该多肽用于局部施用。因此，优选地，将本发明的多肽施用于眼睛。在一些实施方式中，所述多肽在玻璃体内施用。在一些实施方式中，所述多肽局部施用于眼睛。
[0183]
更优选地，所述多肽施用于眼睛表面。换而言之，根据本发明的多肽优选局部施用，更优选局部施用到眼睛上。最优选地，所述多肽施用到对象的结膜上。施用于对象的结膜也称为“结膜”施用。结膜施用最优选通过滴眼剂进行。
[0184]
根据本发明的施用通常不涉及对象的手术。在一个实施方式中，本发明的多肽的施用不包括或涵盖代表对身体的实质性物理干预的侵入性步骤，这需要专业的医疗专业知识，即使在具有所需要专业护理和专业知识的情况下进行，也会带来巨大的健康风险。相反，在更典型的实施方式中，本发明的多肽的施用、特别是局部施用，通常被认为对对象是安全的，因此该多肽可以由对象自己施用，特别是在人类对象的情况下。
[0185]
任选地，在施用之前和/或期间和/或之后用膏药和/或眼敷料覆盖眼睛。可用的各种类型的膏药和/或眼部敷料不受本发明的限制。因此，除非技术上明显不合适，否则可以使用任何膏药和/或眼部敷料。适合覆盖眼睛的膏药和/或眼部敷料是优选的。在一些实施方式中，本发明的多肽与膏药或眼部敷料的施用同时施用；任选地，膏药或眼部敷料包含本发明的多肽，任选地以水性介质的形式在施用之前施用于眼部敷料。
[0186]
在一个替代的和更优选的实施方式中，所述多肽被重复施用。在一个尤其优选的实施方式中，所述多肽每天被重复施用至少一至五次。在一个实施方式中，所述多肽每天施用一次。在一个实施方式中，所述多肽每天施用二次。在一个实施方式中，所述多肽每天施用三次(另见实施例4)。在一个实施方式中，所述多肽每天施用四次。在一个实施方式中，所述多肽每天施用五次。特别优选将所述多肽每天两次施用于人对象。如本文所公开的，所有上述施用优选在几天的过程中重复。例如，所述多肽可重复施用三至30天，优选七至14天，优选这些天的每天1至5次。
[0187]
优选地，当根据本发明的药剂如本文所述被施用于眼睛时，不会引起痛觉过敏综合征(疼痛)。因此，根据本发明的药剂可以与包括视神经在内的伤害感受性纤维(神经)接触，而不会引起痛觉过敏综合征(疼痛)。由于这个和其他原因，本发明提供了主要优点，特别是对于涉及视神经的疾病的治疗和/或预防。
[0188]
施用时间
[0189]
通常，根据本发明的多肽被重复施用或单次施用。
[0190]
在一种实施方式中，所述多肽以单次施用方式施用。在该实施方式中，所述多肽以单次施用方式施用，并且在该单次施用后停止施用。
[0191]
在一个替代的实施方式中，所述多肽重复施用三至30天，优选七至14天。任选地，在所述间隔完成后停止施用。
[0192]
在一个实施方式中，所述多肽被重复施用。在一个实施方式中，所述多肽在观察到例如眼科病症完全治愈之前或至少病症症状改善之前被重复施用。或者，所述多肽重复施用三至30天，优选七至14天。任选地，在所述间隔完成后停止施用。在一个尤其优选的实施方式中，所述多肽每天被重复施用至少三次。
[0193]
优选地，所述多肽在视神经损伤后被施用。
[0194]
优选地，在诊断出视神经损伤后尽快施用多肽，以使rgc死亡的程度最小化。“尽快”包括诊断视神经损伤后一天或更短的实施方式。然而，如果在视神经损伤发生几天后施用，所述多肽仍然具有神经保护作用。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用三天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用四天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用五天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用六天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用七天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用八天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用九天。优选地，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用十天。最优选地，然而，所述多肽在诱导视神经损伤后至少施用四天。在所有这些前述实施方式中，“在诱导损伤后至少(数)天”旨在表示，在重复施用的情况下，在指定天数后施用第一剂。任选地，根据本文的公开内容，可以稍后、在同一天和/或在随后的几天施用进一步的剂量。
[0195]
剂量
[0196]
本文所述的药剂和组合物以有效量施用。根据本发明，“有效量”是单独或与其他剂量一起实现所需反应或所需效果的量或剂量。在治疗特定病症的情况下，所需反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减缓病症的进展并且优选地中断或逆转病症的进展。治疗疾病或病症的所需反应还可以包括延迟所述疾病或所述病症的发作或预防所述疾病或所述病症的发作。在一些实施方式中，所需反应包括局部和/或全身性地完全治愈病症的症状。
[0197]
本文所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病况或病症，病症的严重程度、施用药剂的对象的个体参数，例如年龄、生理状况、伴随状况(如果存在)、大小和体重、治疗的持续时间、伴随治疗的类型(如果存在)、具体的施用途径和其他参数。因此，本文所述的药剂的施用剂量可取决于各种此类参数。在初始剂量对患者的反应不充分的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现的有效更高的剂量)。
[0198]
根据本发明，用于向人类对象施用以治疗和/或预防眼睛的治疗剂的合适和治疗有效剂量可以基于实验确定的用于向啮齿动物对象施用以治疗和/或预防眼部疾病的治疗剂的合适和治疗有效剂量来确定。
[0199]
动物模型(实施例4)有助于建立药理反应，以及评估治疗产品的潜在毒性。在一些实施方式中，向对象施用的剂量是如实施例4或实施例5或实施例6中公开的剂量。
[0200]
优选地，多肽的剂量在治疗开始时或之前确定。在一个实施方式中，根据治疗的进展调整剂量以用于以后的施用。在一个替代实施方式中，不调整剂量以用于以后的施用，因此随后的剂量对应于第一次剂量。
[0201]
所述多肽通过局部(例如)结膜和通过玻璃体内施用都具有活性。特别是对于局部(最优选结膜)给药(优选滴眼剂)优选剂量/每剂具有每眼0.3至30μg多肽、更优选每眼1至10μg多肽、最优选每眼5μg多肽的量。最优选地，这些指示的剂量专门用于人眼施用。
[0202]
获得所述多肽的方法
[0203]
在一个实施方式中，seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽获自生物来源。任选地在一个实施方式中，seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽获自重组表达。出于此目的，将编码相应多肽的开放阅读框引入重组蛋白来源，例如用于蛋白质表达的宿主细胞或无细胞系统。事实上，考虑到人ngf在体内仅产生微量，小鼠ngf通常作为各种蛋白质的异质混合物产生(参见wo 2000/022119a1)，且根据现有技术中对野生型ngf的等效建议，本发
明的多肽是非天然的，因此根本不在体内产生，产生本发明多肽的最有意义的可能性是通过重组表达(wo 2000/022119 a1，wo 2008/006893 a1；rattenholl等，eur.j.biochem，2001，卷268，3296-3303页，us 2018/0086805 a1)。然而，获得足以施用于哺乳动物的纯度等级的此类多肽一直是一个挑战。如本文中详细公开的，本发明已经克服了这一挑战(也参见实施例1和2)。
[0204]
优选地，根据本发明的多肽可通过在细菌中重组表达而获得。更优选地，根据本发明的多肽可通过在细菌中胞质重组表达而获得。通常，细菌细胞，特别是大肠杆菌，能够重组生产大量重组蛋白，但与许多其他重组表达基因的情况一样，细菌中重组ngf和类似多肽的产生会产生无生物学活性的翻译产物，然后以聚集体的形式在细胞(胞质溶胶)中积累(所谓的包涵体(ib)(wo2000/022119a1；us 2018/0086805 a1)。与ngf相比，已知前ngf相当不稳定，需要付出很大努力才能以低回收率进行重折叠和纯化，这使得通过前ngf在细菌中生产ngf的过程相对困难且昂贵。因此，与细菌产生的ngf和类似的细菌产生的多肽(通过各自的前形式)相关的主要困难涉及重组蛋白的折叠、加工和纯化。这些困难现在已经解决了(参见实施例1和实施例2)。结果，se id no：3和seq id no：4的多肽以适合施用于哺乳动物、包括人的纯度等级变得可用。
[0205]
优选地，根据本发明的多肽与前序列一起表达。没有限制，合适的前序列是野生型人ngf的前序列(seq id no：1的氨基酸位置18至121)，通常与seq id no：3或4的多肽的n末端融合。对于野生型ngf，虽然不是成熟ngf的一部分，因此不是ngf的生物学功能所必需的，但已证明共价连接的前序列的存在可促进重组ngf从包涵体重折叠，同时成熟部分形成二硫键(β-ngf)。因此，与来自包涵体的成熟ngf的体外重折叠相比，共价连接的前序列的存在对重折叠的产量和速率产生积极影响(rattenholl等，eur.j.biochem，2001，卷268，3296-3303页)。不希望受限于特定理论，对于seq id no:3和4的多肽，这在本文中是合理的和假设的。
[0206]
因此，当根据本发明的多肽已经在包涵体中产生时，需要正确折叠，这通常在翻译后实现，从共价连接的前序列的切割也是如此；过去已经提出了用于折叠、切割和纯化的复杂方法，特别是对于野生型人ngf。值得注意的是，大多数已发表的关于ngf的研究都应用了rattenholl等先前建立的一般重折叠机制(2001，eur.j.biochem，卷268，3296-3303页)。在这项原始研究中，详细研究了蛋白质重折叠的几个参数(例如温度、重折叠时间、重折叠反应的ph值、精氨酸、谷胱甘肽和蛋白质浓度)，并评估了它们对重折叠效率的影响。rattenholl等的方案依赖于前形式的复性，其溶解度非常差，可在原核生物中重组生产后从包涵体中获得，从而将前ngf溶解在变性浓度的变性剂溶液中，转移到不变性或弱变性的溶液中，从而保持溶解度并且溶解的变性前ngf可以呈现生物活性构象，包括在天然ngf中形成二硫键，然后纯化ngf并通过蛋白水解去除前序列(wo 2000/022119 a1；rattenholl等，eur.j.biochem，2001，卷268，3296-3303页)。值得注意的是，在这项研究中发现，与较高的蛋白质浓度相比，低蛋白质浓度导致正确折叠产物的比产量更高。示例性的，每升的重折叠反应中约50mg的蛋白质浓度导致正确折叠的前ngf的比产率为约25％，而在500mg/l的蛋白质浓度下，该部分减少至10％。基于此，rattenholl等建议重折叠溶液中的蛋白质浓度必须非常低：根据rattenholl等的说法，预计每升的重折叠反应可产生15-20mg正确折叠的蛋白质作为产量。然而，这将需要扩大规模(例如超出实验室规模)以纯化甚至几百毫克的重
组蛋白。
[0207]
虽然人类前ngf含有蛋白酶弗林蛋白酶的天然切割位点(arg
1-ser
2-lys
3-arg4；r1s2k3r4)，并且弗林蛋白酶在体内切割前ngf的该位点，但无法以商业相关的纯度或数量获得弗林蛋白酶。根据本发明，当与前序列一起表达时，例如在大肠杆菌中，本发明的多肽优选被可商购的蛋白酶胰蛋白酶(ec 3.4.21.4)切割。事实上，据报道，对于野生型ngf，胰蛋白酶会产生令人满意的生物活性成熟ngf，最终可以被纯化(rattenholl等人，eur.j.biochem，2001，卷268，3296-3303页)，而重组表达的前ngf的基于胰蛋白酶的蛋白水解同时被其他人采用(例如d'onofrio等人，2011，plos one，卷6，e20839)。然而，后来发现用胰蛋白酶切割野生型前ngf以产生β-ngf有几个缺点，因为少量的胰蛋白酶会导致切割效率低下，而大量的胰蛋白酶会进一步降低切割的选择性，因为胰蛋白酶能够切割任何精氨酸和赖氨酸残基(r和k残基)的c端，因此，通过胰蛋白酶消化含有r1s2k3r4的前ngf，将获得几种替代消化产物；因此，使用胰蛋白酶作为切割酶将导致正确切割的ngf的产量非常低，并导致纯化和产量问题，因为不同的切割产物在标准条件下无法经济地分离。作为一种解决方案，提出了表达前ngf的一种变体，其中前肽中的蛋白酶切割位点r1s2k3r4至少在对应于人野生型前ngf序列(seq id no:1)的位置101和103的位置r1和k3被另一个氨基酸取代(wo 2013/092776a1)。在一个实施例中，r1和k3分别被缬氨酸(v)和丙氨酸(a)取代，将原始弗林蛋白酶切割位点r1s2k3r4转化为v1s2a3r4，其中胰蛋白酶仅能特异性切割r4的c端；胰蛋白酶介导的相应前ngf切割也可以称为“vsar方法”。尽管wo2013/092776a1未提及根据本发明的seq id no:3或4的多肽，vsar方法最初被提议适用于前ngf突变蛋白的某些变体，尽管据报道需要小心滴定蛋白水解条件(us 2018/0086805 a1)。在实现本发明的过程中，本发明人发现，与早先的建议相反，vsar技术不能令人满意地解决与以令人满意的纯度重组生产本发明多肽相关的纯度问题。实际上，不只从宿主细胞蛋白(hcp)、而且从胰蛋白酶(或其他用于切割的蛋白酶)中纯化重组表达的β-ngf或其突变蛋白仍然是一个挑战；不用说，需要在药物蛋白质的最终制剂中不存在蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)，以避免在多肽储存期间发生蛋白水解，因此，根据本发明，在将其施用于对象的时间点，多肽基本上是纯的且未降解。如本文所述，本发明人已经解决了这一挑战。因此，本发明使根据seq id no：3或4的多肽以高纯度可获得，因此基本上不含胰蛋白酶和/或多肽的降解产物。尽管先前已经描述了用于产生ngf(例如w02013092776a1)和seq id no:4的多肽(例如malerba等，2015，plos one，卷10，e0136425)的某些方法，本公开内容令人惊讶地表明，先前公开的方法不足以获得高纯度的相应多肽。作为这些不足的解决方案，本公开提供了一种新的过程和相关方面，如本文中详细描述的。
[0208]
根据本发明，例如在宿主细胞中从重组表达获得seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽的方法可以包括纯化。在最广义上，纯化是指seq id no：3或seq id no：4的多肽与其他分子，包括其他蛋白质，例如宿主细胞蛋白质分离。因此，纯化可包括从一种或多种其他分子分离，包括其他蛋白质，例如宿主细胞蛋白质、蛋白酶(例如胰蛋白酶)和/或根据本发明的多肽的降解产物。
[0209]
根据本发明的seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽的生产方法优选包括以下步骤：
[0210]
(a)获得seq id no:3或seq id no:4的多肽的前体，
[0211]
(d)纯化，
[0212]
并且步骤(d)中的纯化通常包括在混合模式固定相上的纯化。因此，在一个实施方式中，seq id no：3或seq id no：4的多肽可通过重组表达和纯化获得，其中所述纯化包括在混合模式固定相上的纯化。术语“在混合模式固定相上”应被广义地理解，是指包含seq id no：3或seq id no：4的多肽或任何这些多肽的前体以及其他分子种类的混合物暴露于混合模式固定相，例如通过色谱法或其他合适的工艺步骤。实际上，优选对包含seq id no：3或seq id no：4的多肽或任何这些多肽的前体以及其他分子种类的混合物进行色谱，从而步骤(d)中的纯化包括通过混合模式色谱法纯化。优选地，混合模式色谱法包括使用具有带电基团、优选带负电基团和芳族基团和/或疏水基团的固定相。
[0213]
在最广泛的意义上，根据本发明，纯化是指seq id no：3或其seq id no：4的多肽至少部分地与其他分子种类分离，包括其他蛋白质，例如宿主细胞蛋白质、前体和/或降解产物。结果，可获得至少部分纯化的seq id no：3或seq id no：4的多肽。尽管可以任选地丢弃或不丢弃其他分子种类，但优选地获得并保留seq id no：3或seq id no：4的多肽作为纯化的结果。
[0214]
优选地，混合模式色谱法包括使用具有带电基团、优选带负电基团和芳族基团和/或疏水基团的固定相。
[0215]
这些步骤中的每一个本身可以包括几个动作，为简单起见，这些动作也可以称为步骤。为了说明，并且如下详述，步骤(d)可以包括多于一个纯化步骤，例如在多于一个固定相上。
[0216]
本文所用的与一个或多个工艺步骤相关的任何字母或数字，例如(a)、(b)、(c)、(d)、(d1)、(d2)，不应被理解为限制性的，而是供参考。不应理解，根据本发明的过程或使用中的事件顺序可能受限于字母的字母顺序或数字的数字顺序。尽管有前述，强烈优选根据本发明的方法或用途中的事件顺序是本文所述的顺序。
[0217]
混合模式色谱法的其他方面，特别是合适的固定相，将在下面更详细地描述，但这些方面通常适用于本发明。因此，特别是所有那些固定相(包括其所有实施方式，其在下文描述特别适用于步骤(d2)中的混合模式色谱法)通常用于根据本发明的seq id no：3的多肽和/或seq id no：4的多肽的纯化，并且可以在所有类型的实施方式中使用，例如与(d1)捕获色谱的步骤结合或不结合使用。实际上，实施例2b描述了一些优点可以通过在根据现有技术的方案的变体中使用混合模式色谱法来实现。
[0218]
任选地，seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽可在包括(重)折叠和/或色谱纯化和/或蛋白酶消化和任选地调节最终蛋白质浓度和/制备所需制剂的方法中获得。
[0219]
因此，如本文所公开的，也可以通过seq id no:3或seq id no:4的多肽的工业相关纯度和产率向有需要的对象施用seq id no:3或seq id no:4的多肽，这对于技术人员基于本文的公开内容是可获得的。因此，本公开还描述了用于产生seq id no：3或seq id no：4的多肽的方法。
[0220]
根据本发明的seq id no：3和seq id no：4的多肽的生产方法优选包括以下步骤：
[0221]
(a)获得seq id no:3或seq id no:4的多肽的前体，例如，通过重组表达，
[0222]
(d)纯化，其中纯化包括在混合模式固定相上的纯化。
[0223]
本发明还优选对seq id no：3或seq id no：4的多肽的前体进行步骤
[0224]
(c)暴露于蛋白酶。
[0225]
所述暴露通常在步骤(d)之前进行。
[0226]
本发明的方法优选的特征还在于在暴露于蛋白酶之前不进行色谱纯化。实际上，本公开(实施例1、2)表明，用蛋白酶消化在得自宿主细胞的粗级分中也进行得很好且有效，即当在暴露于蛋白酶之前没有进行色谱纯化时。
[0227]
优选地，获得(a)的步骤包括表达seq id no：3或seq id no：4的多肽的前体，优选重组表达。更优选地，重组表达在宿主细胞中。在培养宿主细胞后，在细胞培养物的一个级分中获得seq id no：3或seq id no：4的多肽。该级分可以由宿主细胞组成，即在蛋白质基本上不从宿主细胞分泌的情况下。例如当seq id no：3或seq id no：4的多肽在包涵体中和/或在包括胞质溶胶的细胞内区室中产生时就是这种情况。合适的宿主细胞可以选自原核和真核宿主细胞，尽管在典型实施方式中原核宿主细胞是优选的。优选的原核宿主细胞包括大肠杆菌(e.coli)，优选大肠杆菌rosetta(de3)。在一个实施方式中，seq id no：3或seq id no：4的多肽以不同于天然构象的构象和/或聚集体获得，最优选在包涵体中获得。然后，优选地，本发明的方法包括(重)折叠seq id no：3或seq id no：4的多肽的步骤(b)。优选地，步骤(c)在步骤(b)之后进行。
[0228]
优选地，在步骤(c)中，蛋白酶是能够以释放seq id no：3或seq id no：4的(成熟)多肽的方式切割seq id no：3或seq id no：4的多肽的蛋白酶。在一个具体实施方式中，所述蛋白酶是胰蛋白酶，优选猪胰蛋白酶，任选重组表达。
[0229]
优选地，纯化步骤(d)包括以下步骤，优选按顺序：
[0230]
(d1)捕获，
[0231]
(d2)精制。
[0232]
优选地，捕获步骤(d1)通过色谱法进行，优选柱色谱法。更优选地，所述捕获步骤(d1)使用阳离子交换色谱固定相或混合模式色谱固定相进行。甚至更优选地，所述捕获步骤(d1)使用混合模式色谱固定相进行，其优选为capto mmc。
[0233]
优选地，精制步骤(d2)通过色谱法进行，优选柱色谱法。更优选地，所述精制步骤使用阳离子交换色谱固定相进行。甚至更优选地，所述捕获步骤(d1)使用sp琼脂糖凝胶，优选具有小粒径的sp琼脂糖凝胶进行。sp是磺丙基的缩写。
[0234]
任选地，根据本发明的方法包括调节最终蛋白质浓度和/制备所需制剂的附加步骤。结果，可获得根据本发明的组合物。
[0235]
换言之，本发明提供了用于制备seq id no：3或seq id no：4的多肽的混合模式色谱法。混合模式色谱法可用于制备seq id no：3或seq id no：4的多肽。在优选的实施方式中，将seq id no：3的多肽的前体或seq id no：4的多肽的前体暴露于蛋白酶以用于消化，并且在暴露于蛋白酶之后的步骤中使用混合模式色谱法。在优选的实施方式中，在所述暴露于蛋白酶之前不进行seq id no：3或seq id no：4的多肽的色谱纯化。
[0236]
多肽的纯度
[0237]
本发明的多肽基本或大致不含其在天然状态下通常伴有的组分。本发明的多肽在施用之前是分离的。在一个实施方式中，“分离的多肽”是指从以天然存在的状态围绕着它的细胞环境和细胞外环境(例如组织)中、例如从表达它的细胞(例如宿主细胞)中纯化的多肽。在另一个实施方式中，“分离的多肽”是指分别从其天然细胞环境中以及从与该多肽正
常存在的环境的其他组分的结合中体外分离和/或纯化多肽。
[0238]
优选地，根据本发明使用的seq id no：3或seq id no：4的多肽基本上不含杂质。此类有利地纯的seq id no：3或seq id no：4的多肽可如本文所述获得。
[0239]
本文所述的seq id no：3或seq id no：4的多肽被认为是药学活性肽或蛋白质。
[0240]
在本发明的一个特别有利的实施方式中，所得的根据本发明的多肽基本上不含所述多肽的降解产物。特别地，本公开表明，与现有技术中关于野生型人ngf的报道相反，在纯化之前或之后，如果纯化不能完全去除胰蛋白酶(des-nona变体，数据未显示)，seq id no：4的前体在胰蛋白酶中的暴露将导致固有地部分切割seq id no：4的精氨酸(arg，r)残基9的所述前体c末端。通过本发明提供的具体纯化方法，可以得到基本上不含胰蛋白酶和/或des-nona变体的本发明多肽。
[0241]
优选地，如上所述可获得的多肽基本上不含该多肽的降解物。特别地，本公开使本发明的多肽以新的、改进的纯度等级可用，并且优选地以如此高的纯度施用所述多肽。优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少90％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少91％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少92％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少93％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少94％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少95％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少96％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少97％的纯度等级。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少98％的纯度等级。甚至更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于至少99％的纯度等级。
[0242]
最优选地，根据本发明使用的本发明的多肽的特征在于纯度等级大于99.0％，例如纯度等级大于99.1％，大于99.2％，大于99.3％，大于99.4％，大于99.5％，大于99.6％，大于99.7％，大于99.8％，大于99.9％。
[0243]
在此，“纯度等级”一般是指本发明的多肽的重量(w)相对于本发明的多肽以外的生物材料的重量(w)的百分比。为了说明，一般而言，在纯度等级为99.0％的情况下，本发明的多肽以99.0单位(例如1.0mg)的相对量(重量)存在，且本发明的多肽以外的所有生物材料的重量之和为1.0个单位(例如1.0mg)。本发明多肽以外的此类生物材料包括但不限于宿主细胞蛋白、核酸、蛋白酶，例如灭活或未活化的胰蛋白酶，本发明多肽的降解产物，例如和其他生物来源的大分子。在一个具体实施方式中，“纯度”等级是指相对于本发明多肽以外的多肽的纯度。为了说明，在那个实施方式中，在纯度等级为99.0％的情况下，本发明的多肽以99.0单位(例如1.0mg)的相对量(重量)存在，并且与本发明的多肽不同的所有多肽的重量总和为1.0单位(例如1.0mg)。为避免疑义，本发明多肽的降解产物包括在“与本发明多肽不同的多肽”中。一种特定的降解产物是des-nona变体(参见实施例1和2)。
[0244]
特别是基本上不含多肽的des-nona变体。des-nona变体是本发明多肽的先前未表征的降解产物，其与ngf的某些变体(包括本发明的多肽)的产生相关，除非该多肽是通过本文公开的新方法产生的(参见例如实施例1和2)。“基本上不含”在本上下文中意指根据本发明使用的本发明的多肽的特征在于相对于des-nona变体，纯度等级大于99.0％，例如纯度等级大于99.1％，大于99.2％，大于99.3％，大于99.4％，大于99.5％，大于99.6％，大于
99.7％，大于99.8％，大于99.9％，所有这些都是相对于des-nona变体的纯度等级。在最优选的实施方式中，des-nona变体是不可检测的和/或不存在的。
[0245]
还优选根据本发明的多肽基本上不含任何蛋白酶(例如胰蛋白酶)。“基本上不含”在本上下文中意指根据本发明使用的本发明的多肽的特征在于相对于所有蛋白酶(包括胰蛋白酶)的总和，纯度等级大于99.0％，例如纯度等级大于99.1％，大于99.2％，大于99.3％，大于99.4％，大于99.5％，大于99.6％，大于99.7％，大于99.8％，大于99.9％，所有这些都是相对于所有蛋白酶(包括胰蛋白酶)的总和的纯度等级。在最优选的实施方式中，胰蛋白酶是不可检测的和/或不存在的。
[0246]
在上述实施方式中，这种高纯度等级与监管机构提高的可接受性有关，并且使本发明的多肽有资格作为用于哺乳动物对象、特别是人类的药物。因此，根据本发明的纯度等级首次使得该多肽能够以安全和可靠的方式施用于眼睛，包括人眼的施用。就蛋白酶(胰蛋白酶)而言，高纯度等级尤其能够以非冷冻形式储存多肽。
[0247]
组合物
[0248]
下面将描述包含本发明多肽的组合物。此类组合物本身以及在根据本发明的用于预防和/或治疗眼科病症的特定上下文中都是本发明的一部分。因此，本发明既针对此类组合物的医学用途，也针对此类组合物本身。
[0249]
在根据本发明的组合物中，包含seq id no：3或seq id no：4的多肽作为活性成分。可以包含其他成分。
[0250]
在一个实施方式中，所述多肽包含在水性介质中。所述水性介质用于施用于哺乳动物对象。
[0251]
根据本发明使用的特定水性组合物是适合用作滴眼剂的液体组合物。通常，滴眼剂是适合在眼部施用的液体滴剂。术语“滴眼剂”没有特别限制，并且通常是指一种组合物，通常是一种水性液体组合物，其可以施用于眼睛而不会对眼睛造成伤害。一般来说，滴眼剂的副作用风险低于例如口服药物或玻璃体内注射药物。由于这些和其他原因，滴眼剂是特别优选的。
[0252]
因此，在一个实施方式中，多肽包含在适合用作滴眼剂的组合物中。
[0253]
预计将所述滴眼剂施用于哺乳动物对象。滴眼剂预计可用于眼部施用途径以施用本发明的药剂。优选地，滴眼剂局部施用于眼睛。
[0254]
制备滴眼剂的方法是本领域已知的。非限制性且仅用于说明，制备滴眼剂的方法已在wo2016/162812a1中进行了描述。
[0255]
在一些实施方式中，本文所述的seq id no：3或seq id no：4的多肽包含在组合物中，例如滴眼剂组合物，另外还包含一种或多种运载体和/或一种或多种赋形剂。如本文所用，术语“运载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其与活性成分结合在一起以实现、增强或促进活性成分的应用。如本文所用，术语“赋形剂”旨在表示可能存在于本发明的药物组合物中并且不是活性成分的所有物质。
[0256]
优选地，根据本发明的组合物至少包含水作为赋形剂。在一些实施方式中，根据本发明的组合物包含水性介质，更优选根据本发明的组合物为水溶液形式。在一个实施方式中，所述多肽包含在水性介质中，并且水性介质被施用到哺乳动物对象。水性介质可以是例如水溶液。在一些实施方式中，水溶液和其他相应的组合物可直接从水性介质中的ngf纯化
获得。例如，当根据本发明的药剂通过纯化从生物来源纯化获得时，相应的水性组合物可以直接从最后的纯化步骤获得，例如从最后的色谱柱(通常是精制步骤)的洗脱和/或过滤。或者，通过调节最终蛋白质浓度和/制备所需制剂的附加步骤可获得相应的组合物。这样的附加步骤可以包括例如，如本文所述的澄清或过滤步骤，和/或添加一种或多种赋形剂和/或一种或多种运载体。本文描述了可用于本发明的示例性组合物，但不限于此。
[0257]
因此，本文所述的seq id no：3或seq id no：4的多肽可以存在于组合物中，例如药物组合物中。本文所述的组合物优选地是无菌的并且优选地包含seq id no：3或seq id no：4的多肽作为药物活性肽或蛋白质，并且任选地包含本文提及或未提及的其他药剂。组合物可以处于任何状态，例如液体、冷冻、冻干等。
[0258]
本文所述的组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、运载体、稀释剂和/或赋形剂，所有这些均优选为药学上可接受的。术语“药学上可接受的”描述了无毒和/或不与药物组合物的活性成分的作用相互作用的事物。
[0259]
用于本发明的合适的缓冲物质包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。例如，优选地，由于本发明的各个方面，本发明的多肽可在具有4.5和6.5之间、优选5.0和6.0之间的ph的缓冲液中获得。在一个实施方式中，乙酸盐缓冲液是用于此类目的的合适缓冲液，因此是特别优选的。因此，在一个实施方式中，本发明的多肽在具有4.5和6.5之间、优选5.0和6.0之间的ph的乙酸盐缓冲液中获得。特别地，认为乙酸盐是在ph 5.0至ph 5.8的ph范围内稳定ngf及其衍生物的最佳缓冲剂。
[0260]
由于ngf，并且可能还有根据本发明的多肽，对甲硫氨酸残基的氧化敏感，因此优选在制剂中包含甲硫氨酸。
[0261]
本发明进一步涉及包含选自seq id no：3的多肽和seq id no：4的多肽的多肽的组合物，其中所述组合物的特征在于ph 5.0至6.0(优选ph 5.5)的ph，以及包含以下：
[0262]
a)0.2至20mg/ml所述多肽(优选2mg/ml)，
[0263]
b)5至100mm乙酸钠缓冲液(优选20mm)，
[0264]
c)5至100mm甲硫氨酸(优选20mm)。
[0265]
因此，优选地，所述多肽包含在包括以下的组合物中：
[0266]
a)0.2至20mg/ml的本发明的多肽，
[0267]
b)5至100mm乙酸钠缓冲液，
[0268]
c)5至100mm甲硫氨酸，
[0269]
d)ph 5.0至6.0。
[0270]
更优选的ph范围是5.0至5.8。
[0271]
更优选地，所述多肽包含在包括以下的组合物中：
[0272]
a)2mg/ml所述多肽，
[0273]
b)20mm mm乙酸钠缓冲液，
[0274]
c)20mm甲硫氨酸，
[0275]
d)ph 5.5。
[0276]
本发明的另一种优选制剂如下：
[0277]
1mg/ml seq id no：3的多肽或seq id no：4的多肽(优选)
[0278]
10mm乙酸钠缓冲液
[0279]
10mm甲硫氨酸
[0280]
154mm nacl
[0281]
0，1mg/ml聚山梨醇酯80
[0282]
ph 5.5
[0283]
设想这些和其他制剂适合作为用于眼部使用的药物产品。
[0284]
上述组合物优选为滴眼剂。上述组合物优选为水性组合物。
[0285]
根据以下一种或多种实施方式，本发明的组合物(制剂)可以被保存，但不限于：
[0286]-第一实施方式：上述制剂可-70℃冷冻保存(数据未显示)，施用前解冻。
[0287]-第二实施方式：上述制剂可以储存在冰箱中，优选在 2至 8摄氏度的温度范围内(数据未显示)。
[0288]-第三实施方式：上述制剂可以进行干燥或冷冻干燥，然后例如在室温下储存(数据未显示)。它可以在施用前重构。
[0289]
所有上述实施方式都提供了在例如
–
20摄氏度下冷冻的某些优点，因为这避免了使用干冰运输、解冻和解冻后重新混合的必要性等。在这样的实施方式中，根据本发明的制剂克服了现有技术药物ngf制剂例如特别是oxervate(cenegermin)的某些不便。
[0290]
根据本发明的用于施用的特别优选的组合物在实施例3中举例说明。
[0291]
用于根据本发明的组合物的合适的防腐剂包括本领域已知的那些，其中用于说明但不限于苯甲醇、苯扎铵及其盐、间甲酚、苯酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。这些和其他防腐剂任选地包含在根据本发明的组合物中。
[0292]
因此，本发明提供了用于治疗用途的seq id no：3或seq id no：4的多肽，即用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中的用途。疗法可以包括疾病的预防和/或治疗。鉴于治疗用途的潜力，所述多肽也可称为药物活性蛋白或肽。
[0293]
任选地，根据本发明的施用伴随施用至少一种抗微生物剂，例如抗生素。抗微生物剂可以是包含根据本发明的多肽的组合物的一部分，或者可以通过相同或不同的施用途径分别向对象的相同或不同部位施用。
[0294]
工业适用性
[0295]
本文所述的seq id no：3或seq id no：4的多肽适用于多种目的，例如用于本文所述的治疗应用。
[0296]
以下实施例和附图旨在说明本发明的一些优选实施方式，而不应解释为限制由权利要求限定的本发明的范围。
实施例
[0297]
多个实施例通用的材料和方法
[0298]
除非另有说明，以下实验实施例特别涉及seq id no：4的多肽，相对于野生型人ngf，其特征在于取代p61s r100e(称为“ngf p61s r100e”，malerba等，plos one，2015，卷10，e0136425，seq id no:4)，以及其前体等。seq id no:4的多肽也可称为“ngf突变蛋白”，但必须牢记，根据本发明并且如在实验实施例，特别是实施例4中所证明的，该蛋白质特异性的治疗适用性与野生型人ngf显著不同。同样，如实施例2所述，seq id no 4的多肽的纯化不同于公开的野生型ngf的纯化方案，并且根据本发明制备所述多肽的具体方法适于实
现高纯度，特别是不存在des-nona变体和胰蛋白酶。
[0299]
seq id no：4的多肽作为前体被重组表达。为此，将seq id no：4与野生型人ngf的前肽(seq id no：1的1-121位)融合。换言之，seq id no:4的多肽的前体由人野生型ngf的前体(seq id no:1)组成，除了人野生型ngf的成熟部分中的取代p61s r100e(但是，为了清楚起见，缺少seq id no：1的不形成人野生型ngf的多肽序列的一部分的2个最c端氨基酸)。表达以不溶性包涵体的形式在大肠杆菌rosetta(de3)(菌株：e.coli rosetta(de3)/pet11a-hpro ngf p61s r100e)中进行。
[0300]
设备
[0301][0302][0303]
表1使用的设备列表。
[0304]
本文的蛋白质和肽的蛋白质参数
[0305]
使用expasy的protparam-tool计算相关蛋白质的蛋白质参数的理论值，该工具可
在http://web.expasy.org/protparam获得。这些如表2所示，如下所示：
[0306][0307]
表2：相关蛋白质/多肽的理论推导性质
[0308]
分析方法
[0309]
sds-page和蛋白质印迹
[0310]
使用标准程序进行sds-page和蛋白质印迹。对于sds-page，12％bis-tris nupage凝胶(来自thermo fisher的产品编号np0342box)在nupage mes运行缓冲液(来自thermo fisher的产品编号np0002)中在恒定电压(175v)的还原条件下操作。蛋白质印迹的一抗购自santa cruz biotechnology(ngf(h-20)sc-548)。实施例的结果显示在例如图9a和图10中。
[0311]
分析型cex-hplc
[0312]
使用来自dionex的propac scx-10进行cex-hplc。使用50mm柠檬酸盐缓冲液，ph 5.5，以1ml/min操作该柱。对于洗脱，加入1m nacl(b)并在50分钟内执行从0-100％b的线性梯度。实施例的结果如图9b所示。
[0313]
se-hplc
[0314]
se-hplc使用ge healthcare的superdex 200增加10/300gl进行。该柱在pbs中操作。在280nm检测产物。
[0315]
内毒素、dna和hcp
[0316]
根据标准方案测定内毒素、dna和宿主细胞蛋白(hcp)。
[0317]
实施例1：seq id no：4的多肽作为前体蛋白的表达
[0318]
菌株生产
[0319]
将编码前ngf的基因克隆到pet11a表达质粒中。该基因来源于智人(h.sapiens)，并将两个点突变(即p61s和r100e)引入开放阅读框。随后，用表达质粒转化化学感受态rosetta(de3)细胞并选择单个菌落(得到的菌株被称为e5901 strain(＝e.coli rosetta(de3)/pet11a-前ngf p61s r100engf rcb c-151101))。等分试样以1.0ml储存在＜-60℃。
[0320]
在实施例1中，描述了基于菌株e5901 strain的初始发酵发展。
[0321]
设备
[0322][0323][0324]
生长培养基
[0325]
发酵用复合培养基
[0326]
用于发酵的复合培养基由以下组成：49.3g/l酵母提取物，0.61g/lmgso4*7h2o，0.5g/l nh4cl，14.2g/l k2hpo4*3h2o和10g/l葡萄糖。用于该发酵的进料由263g/l酵母提取物和133g/l葡萄糖组成。
[0327]
用于发酵的最小培养基(mm)
[0328][0329][0330]
对于分批阶段，两种基本培养基均添加了30g/l葡萄糖。如果没有另外说明，进料具有与相应批次培养基相同的组成，但含有300g/l的相应碳源。
[0331]
含有氨苄青霉素和氯霉素的lb琼脂平板
[0332]
lb-琼脂板是新倒的。培养基由10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l nacl和15g/l琼脂组成。高压灭菌后，培养基中添加100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素。
[0333]
发酵
[0334]
如果没有另外说明，发酵，在该实施例1中，发酵在由来自sartorius的biostat b单元控制的1l搅拌玻璃生物反应器中进行。通常，使用2m磷酸和25％氢氧化铵将po2控制在30％，将培养温度设置为37℃，并将ph控制在7。除非另有说明，分批阶段之后是指数进料，f0＝6g/l/h和μ＝0.25/h。出于实际原因，所有指数进料均由两个线性进料近似。通常，通过添加1mm iptg来诱导产物表达，诱导后，应用10g/l/h的恒定进料速率。使用来自thermo scientific的sorvall evolution rc通过离心收集细胞生物质。离心机配备slc-6000转子，培养物在8500rpm和4℃下离心30分钟。
[0335]
生物质样品中产物的相对定量
[0336]
在给定的时间点，将培养样品稀释至od
600
为10，并将来自该稀释液的100μl等分试样的生物质制成颗粒。将颗粒重新悬浮在150μl(非还原)laemmli缓冲液中，并将样品在95℃下煮沸5分钟。在来自novex的10％bis-tris凝胶上分析10μl每个样品。在125v下进行90分钟的电泳分离，凝胶用考马斯染色。扫描脱色凝胶并通过光密度测定法定量对应于seq id no：4的多肽前体的条带的丰度。为了进一步校正所利用的生物质的不一致性，将对应于seq id no：4的多肽前体的条带的强度标准化为管家蛋白的强度。
[0337]
从对应于seq id no：4的多肽前体的条带在诱导后和诱导前的增加计算相对产物积累。值得注意的是，测量值代表特定产量(即标准化为od
600
＝10)。对于给定发酵的绝对产量，必须考虑实际的细胞密度(参见下文)。
[0338]
生物质样品中产物的绝对定量
[0339]
seq id no：4的多肽前体的标准品获自欧洲脑研究所(ebri，意大利罗马)。标准品在laemmli缓冲液中稀释至65μg/ml的浓度。所述蛋白质浓度由ebri定义。用260、520、780、1040和1300ng seq id no：4的多肽前体的标准品制备标准曲线。在与标准曲线相同的凝胶上分析样品，并考虑样品的稀释倍数来计算给定时间产品的绝对产率。
[0340]
实施例1的总结和结论
[0341]
基于上述，得出生产菌株(e5901 strain，参见上文)成功用于1l规模发酵的结论。虽然已经评估了不同培养基组合物促进细菌生长和产物表达的能力，但事实证明，添加5g/l酵母提取物的最小培养基mm i在表达产量和可获得的细胞密度方面是有利的。就产物形成而言，无论是否使用抗生素(氨苄青霉素和氯霉素，数据未显示)进行主要培养时，均未观察到显著差异。
[0342]
可以放大实施例1以便以工业规模生产多肽。
[0343]
实施例2：实验室规模纯化，capto mmc的建立
[0344]
本实施例中使用的seq id no:4的前体如实施例1所述在包涵体中获得。
[0345]
鉴于现有技术的优化起点
[0346]
在一开始，据推测，在没有相反指示的情况下，可以遵循文献中先前报道的ngf纯化的基本基础来改进本发明多肽纯化的方法。然而，还应牢记，为了大规模高效生产，应考虑适于以后扩大规模的调整。因此，据推测，基于rattenholl等(同上)、wo2013092776 a1和
其他出版物，seq id no：4的多肽同样可以至少在实验室规模的过程中，使用胰蛋白酶的非特异性消化和随后的纯化，以其前体形式获得。推测由此可以获得高纯度的seq id no：4的成熟多肽。然而，只有通过本实施例中报道的特定调整和修饰，才能获得高纯度的seq id no：4的成熟多肽。因此，特别考虑到如本文所述的seq id no：4的多肽的高纯度，能够将seq id no：4的多肽施用于有需要的对象。
[0347]
设备，seq id no：4的多肽的生产
[0348]
[0349]
实施例2中使用的设备列表。
[0350]
根据本实施例的制造工艺的细节，包括实施例2b中描述的改进，在图1的工艺概览中给出。
[0351]
除非另有说明，否则分析方法如上述“分析方法”部分所述。
[0352]
实施例2a：根据先前描述的方案进行纯化。
[0353]
如实施例1中所述产生表达seq id no：4的多肽前体(“生物质”)的大肠杆菌细胞，并通过加入溶菌酶和随后在冰上超声处理来裂解细胞。包涵体(“ib”)被(1)从宿主细胞中提取并用6％triton x100(在1.5m nacl、60mm edta中)洗涤，然后，(2)溶解在6m盐酸胍(“ghcl”)、0.1m tris-hcl ph 8.0、1mm edta、100mm(新鲜)dtt中。ib在室温下溶解2小时。之后，通过添加37％hcl将ph值降至3-4。将由此获得的包含seq id no：4的多肽的前体的溶解前体(“溶解物”)的溶液相对于6m ghcl(ph 3-4)进行透析。
[0354]
seq id no：4的多肽前体的重折叠在0.1m tris-hcl、1m l-精氨酸、5
[0355]
mm edta、0.61g/l氧化型谷胱甘肽和1.53g/l还原型谷胱甘肽( 4℃时ph 9.5)中进行。因此，每小时每ml重折叠缓冲液添加50μg蛋白质。重折叠后，用50mm磷酸钠ph 7.0透析反应。在更换缓冲液时，出现明显的沉淀。
[0356]
seq id no：4的多肽的前体在阳离子交换色谱(sp sepharose hp使用50
[0357]
mm磷酸钠、ph 7.0操作，并使用nacl梯度洗脱)和随后的疏水相互作用色谱(phenyl sepharose hp，使用50mm磷酸钠、1m硫酸铵ph 7.0操作)的连续序列上被纯化。之后，采用另一次透析将样品的缓冲液与ph 7.0的50mm磷酸钠交换(请注意，在该过程中可以省略这种第二次透析)。在缓冲液电导率降低的整个过程中，再次沉淀出大量产物。
[0358]
通过每250mg前ngf添加1mg胰蛋白酶，对由此制备的seq id no：4的多肽的前体进行有限的蛋白水解。seq id no：4的多肽的前体在2-8℃下暴露于蛋白酶14小时。
[0359]
成熟的ngf最后在阳离子交换剂上精制(sp sepharose xl用50mm磷酸钠、ph 7.0操作，用nacl梯度洗脱)。最后，将产品浓缩至0.5
–
1mg/ml并在＜-65℃下冷冻。
[0360]
实施例2b：改进
[0361]
在下文中，描述了与实施例2a相比在实现本发明的过程中测试和实施的几个改进。除非上下文另有说明，否则所有未明确指出的细节均如上文实施例2a所述。
[0362]
ib溶解的优化
[0363]
虽然先前已报道少量ib(如从摇瓶培养物中获得的示例)在增溶缓冲液(6m ghcl、0.1m tris-hcl ph 8.0、1mm edta、100mm(新鲜)dtt)中很容易溶解，但从高细胞密度发酵中获得的ib无法完全溶解。这可以通过向所述增溶缓冲液中添加2m尿素来解决，结果证明这显著提高了增溶产率(数据未显示)。为避免疑义：除了6m ghcl和其他成分外，还存在2m尿素。
[0364]
重折叠优化
[0365]
最初基于rattenholl等(2001，eur.j.biochem，卷268，3296-3303页；rattenholl，2001，学位论文取得博士学位(dr.rer.nat.),martin-luther-halle-wittenberg(德国))、但重要的是还考虑到以后的(向上)可扩展性，决定每升重折叠反应用200至500mg seq id no：4的多肽的前体、优选每升重折叠反应用200至300mg seq id no：4的多肽的前体进行重折叠。这导致seq id no：4的多肽的溶解前体的相对良好的产量。尤
其，重要的是考虑到与重折叠反应的体积相比ngf的量增加，重折叠反应包含相对昂贵的成分(例如谷胱甘肽和精氨酸)，每体积重折叠反应可以重折叠相对多的seq id no：4的多肽的前体，这应该使得重折叠在经济上可行，在生产规模上也是可行的。
[0366]
seq id no：4的多肽前体的纯化
[0367]
通过利用前ngf相当高的等电点并使用阳离子交换固定相(即sp sepharose)进行纯化的方法，在重折叠后纯化seq id no：4的多肽的前体。为了运行这种类型的色谱，出于技术原因，必须将重折叠缓冲液更换为低电导率的缓冲液。在这样做的同时，大量的seq id no：4的多肽的前体沉淀(数据未显示)。该观察结果可归因于缓冲液中精氨酸浓度的降低。
[0368]
因此，采取了一些措施来用不同的捕获柱(具有不同选择性的柱)替换捕获柱，这可以更耐受重折叠反应中精氨酸的存在。在第一次尝试这样做时，评估了几个r固定相的性能，但没有一种方法产生有希望的结果(参见表6)。因此，用于捕获柱的固定相保持与之前过程中定义的相同。然而，由于seq id no：4的多肽前体的高等电点(pi)，运行缓冲液的电导率增加(通过添加250mm l-精氨酸)是可能的而不影响性能。这样，重折叠的seq id no：4的多肽前体可以在一定程度上稳定并且沉淀的前体的量减少(数据未显示)。
[0369]
[0370][0371]
上表：测试用于捕获seq id no：4的多肽的前体的替代选择性，并对其进行评估。
[0372]
然而，关于混合模式色谱法，应当理解，但不希望受限于特定理论，seq id no：4的多肽的前体不能从混合模式色谱法中有效洗脱，而seq id no：4的成熟多肽可以。
[0373]
蛋白酶消化产生成熟ngf
[0374]
对于seq id no:4的多肽的生产，蛋白酶(胰蛋白酶)是必需的，因此推断理想情况下，选择的特定胰蛋白酶应满足以下标准：
[0375]
1.源自重组来源。不含动物成分的原材料的认证对于以后的符合gmp要求的工艺是至关重要的。
[0376]
2.胰蛋白酶的低副活性。值得注意的是，胰蛋白酶可以进行自溶。这一过程可能会产生所谓的假胰蛋白酶，它具有加宽的底物谱并具有胰凝乳蛋白酶样活性。可以添加ca
2
(例如1mm cacl2)以减少自溶。然而，现在“修饰的胰蛋白酶”通常适用于每个方案，这需要严格的序列特异性(例如肽指纹)。这种修饰的胰蛋白酶通常通过胰蛋白酶暴露的赖氨酸残基的ε-氨基的酰化获得。
[0377]
3.批次间变化性低，以实现可重复的生产过程。或者，所选酶应附有说明相应批次的比活性的证书。然后所需的酶量可以基于活性而不是质量。
[0378]
尽管进行了全面搜索，但在商业市场上没有发现满足标准1和2的胰蛋白酶。理由是标准1更为重要。为了减少自溶，添加cacl2可能就足够了。因此，选择来自罗氏的重组“gmp级”胰蛋白酶(roche 06369880103，批号：11534700)作为该工艺的原料。这种酶在毕赤酵母中表达，其序列来源于野猪(sus scrofa)。根据其证书，所使用的胰蛋白酶批次的比活度为4997u/mg(根据usp测定)。
[0379]
在胰蛋白酶消化之前省略第二个纯化步骤
[0380]
在寻找用于预期胰蛋白酶消化的最佳酶/底物比率的初始筛选中，使用从捕获柱(见上文)获得的seq id no：4的多肽的前体。与先前建立的方法(欧洲脑研究所(ebri)，未公布细节，基于rattenholl等，同上)相比，决定在胰蛋白酶消化之前不使用额外的疏水相互作用色谱。在胰蛋白酶消化之前省略第二个柱纯化步骤的决定主要基于两个思路：一方面，在捕获柱后获得的产物根据sds-page已经几乎是纯的。另一方面，胰蛋白酶化本身可能有助于通过消化剩余的宿主细胞蛋白(hcp)来改善杂质谱。
[0381]
表7总结了第一轮筛选的条件矩阵。用12％sds-page研究胰蛋白酶消化的结果(数据未显示)。结果(数据未显示)表明，胰蛋白酶消化在相当宽的酶/底物比率范围内可重复地产生稳定的seq id no：4的多肽(即每375μgseq id no：4多肽的前体，1-5μg胰蛋白酶)。消化的时间不是很关键。因此，反应的停止和将反应加载到精制柱所需的时间显然不是限制性的。这一发现特别重要，因为反应不能以制备规模适当或经济地淬灭。
[0382]
进行了一些额外的实验，以改进设想的胰蛋白酶化的最佳酶/底物比例，并且发现在酶/底物比率为1/100至1/200(蛋白质重量/蛋白质重量)的情况下，一方面可以再现性地获得seq id no：4的多肽的良好产量，另一方面可以获得少量的截短产物。必须说明的是，在所使用的条件下(即在2-8℃的磷酸盐/精氨酸缓冲液(ph 7.0)中孵育(暴露于蛋白酶)2到6小时)，消化的质量并不高度依赖于酶/底物的比例。这一发现特别重要，因为潜在的酶消化容易在实验设置中发生微小变化(例如，由于批次间差异或酶的储存导致胰蛋白酶活性的改变；孵育步骤(暴露于蛋白酶)的时间和温度；蛋白质浓度测定的误差)。此外，这也是为什么在小规模内扩展微调以进一步减少潜在的截断产物似乎没有意义。如果在小规模内确定了“最佳”条件，那么在下一次在更大规模内重复几乎相同的消化时，仍然有很好的机会产生稍微改变的产物模式。
[0383]
目的为在胰蛋白酶消化后获得纯多肽的精制色谱
[0384]
与使用sp sepharose固定相来精制成熟多肽(注：sp sepharose是一种阳离子交换固定相)的先前建立的工艺(欧洲脑研究所(ebri)，未公布细节，基于rattenholl等，同上)相比，这里基于以下考虑寻找更合适的固定相：为了有效地加载到sp sepharose柱上，需要降低包含seq id no：4的多肽的前体的溶液的电导率，例如通过缓冲液交换。然而，已知(例如实施例2a)溶液离子强度的降低确实会导致目标分子沉淀，因此应避免将缓冲液更换为低电导率缓冲液。此外，阳离子交换固定相已经用于捕获seq id no：4的多肽的前体，为了更好地分离剩余污染物，优选正交选择性。反对使用sp固定相纯化胰蛋白酶化反应的第三个也是最后一个论点是seq id no：4的多肽前体的潜在剩余多肽前体将与该柱结合，并且可以仅通过洗脱选择性而不是通过结合选择性与seq id no：4的成熟多肽分离。
[0385]
为了建立这种用于纯化seq id no：4的成熟多肽的正交精制柱，首先打算使用疏水相互作用(hic)柱。这种固定相的选择不仅具有正交选择性，而且还因为不需要将缓冲液更换为低电导率缓冲液。尽管测试了几种hic固定相和条件(例如分别使用1m(nh4)2so4和0.5m(nh4)2so4操作的苯基琼脂糖和丁基琼脂糖)，但无法实施基于hic的令人满意的精制步骤(数据未显示))。
[0386]
然而，在用于精制步骤的进一步实验设置中，对混合模式固定相capto mmc进行了测试，可以成功实施。发现在优化条件下，固定相可逆地与seq id no：4的多肽结合，并且可
以通过增加ph来洗脱产物(数据未显示)。相反，seq id no：4的多肽的前体不可逆地结合到固定相上并且只能通过使用1m naoh作为流动相来洗脱(数据未显示)。此外，可以证明胰蛋白酶根本不与在相同条件下操作的柱结合(数据未显示)。这些结果提供了capto mmc固定相能够有效地将成熟的seq id no：4的多肽与胰蛋白酶和seq id no：4的多肽的剩余前体分离的明确证据。
[0387]
建立额外的膜层析
[0388]
为了进一步去除内毒素和dna，该过程中加入了额外的阴离子交换膜。通常，并且众所周知，膜色谱法的特征在于使包含待分析或纯化的组分(在本例中为seq id no：4的多肽)的溶液穿过或通过通常带电的膜。为此，在本例中，在图1所示的位置加入了stic膜(sartorius，哥廷根，德国)。可以显示seq id no：4的多肽不与膜结合，因此提供了概念证明，即膜色谱法适用于纯化seq id no：4的多肽。为了说明在整个过程中的结合，包括膜色谱法，请参见图1。
[0389]
根据实施例2的方法的再现性
[0390]
为了探测该过程的稳健性，该过程进行了五次，并分析了所得级分的产率和纯度。在这些运行过程中，对工艺细节进行了稳定的优化，并采用了缓冲液组成、梯度等，直到最终的优化工艺细节(见图1)确立。结果表明，在实验室规模中，可以从一次一致的生产运行中产生约50至100mg seq id no：4的多肽。值得注意的是，通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后是考马斯染色或银染色，一致地发现获得的产物相对纯净(少于5％的污染宿主细胞蛋白和只有痕量的截短ngf，数据未显示)。
[0391]
对于seq id no：4的多肽的前体，无法建立有意义的se-hplc方法。相反，对seq id no：4的成熟多肽的se-hplc分析是直接的，并产生约16kda的均质产物峰，其与seq id no：4n的多肽的单体状态相吻合(数据未显示)。
[0392]
总结和结论
[0393]
对于该工艺，使用sp sepharose ff(“ff”代表快速流动柱(fast flow)，即具有相对大颗粒的固定相)捕获重折叠的seq id no：4的多肽前体，随后用胰蛋白酶处理以产生成熟ngf。出于此目的，重折叠反应的精氨酸浓度从1m(如现有技术推荐的)降低到350mm。
[0394]
控制seq id no：4的多肽前体的蛋白水解切割以产生seq id no：4成熟多肽被认为是该工艺的最关键因素。在此，确定了既可重复地促进高效切割、又防止形成ngf降解产物的条件。本文的实验数据表明，可以在相当宽的酶/底物比率范围内建立明显稳健的生产工艺。对于胰蛋白酶化，步骤产率显然很好，并且在该工艺的这个阶段预计不会有重大损失。获得的产物模式显然不强烈依赖于所使用的反应条件(在酶/底物比率和孵育时间(暴露于蛋白酶的时间)方面)。值得注意的是，即使预期酶精制的良好产量，也必须加工至少2
×
x克seq id no：4的多肽以交付x克seq id no：4的成熟多肽。
[0395]
根据该实施例的纯化是仅由两个色谱纯化步骤组成的精益工艺。对现有纯化工艺进行了进一步优化，并采用了几个方面的放大(见图1)。示例性的、先前使用的细胞破碎方法被高压均质化所取代，并且所有透析步骤都可以被切向流过滤所取代。如此建立的方法能够以高纯度交付seq id no：4的多肽。
[0396]
尽管存在上述挑战，但整个工艺能够交付质量可接受的产品。特别地，该方法产生的seq id no：4的多肽处于基本上不含多肽降解物，特别是基本上不含多肽的des-nona变
体的状态。因此，该方法产生了高纯度的多肽。
[0397]
图1示意性地描绘了包含根据实施例2的改进的完整工艺，包括膜色谱法。
[0398]
可以放大实施例2以便以工业规模生产多肽。
[0399]
实施例3：本发明的制剂的制备
[0400]
考虑到eng等，1997，anal.chem.，卷69，4184-4190页的建议，制备了包含先前根据实施例2制备的seq id no：4的多肽的制剂。
[0401]
具体而言，制备的制剂具有以下组成：
[0402]
2mg/ml如实施例2所述获得的根据seq id no:4的多肽
[0403]
20mm乙酸钠缓冲液
[0404]
20mm甲硫氨酸
[0405]
ph 5.5
[0406]
特别地，认为乙酸盐是在ph 5.0至ph 5.8的ph范围内稳定ngf及其衍生物的合适缓冲剂。由于ngf，并且可能还有根据本发明的多肽，对甲硫氨酸残基的氧化敏感，因此在制剂中包含甲硫氨酸。
[0407]
以下实施方式尤其适用于制剂的保存：
[0408]-第一实施方式：上述制剂可-70℃冷冻保存(数据未显示)，施用前解冻。
[0409]-第二实施方式：上述制剂可以储存在冰箱中，优选在 2至 8摄氏度的温度范围内(数据未显示)。
[0410]-第三实施方式：上述制剂可以进行干燥或冷冻干燥，然后例如在室温下储存(数据未显示)。它可以在施用前重构。
[0411]
所有上述实施方式都提供了在例如
–
20摄氏度下冷冻的某些优点，因为这避免了使用干冰运输、解冻和解冻后重新混合的必要性等。在这样的实施方式中，根据本发明的制剂克服了现有技术药物ngf制剂例如特别是oxervate(cenegermin)的某些不便。
[0412]
实施例4：非人类哺乳动物的概念证明
[0413]
本实施例的目的是研究seq id no：4的多肽在治疗和/或预防非人类动物眼科病症中的功效。
[0414]
本发明部分地基于对动物模型的实验。
[0415]
本文报道了将seq id no：4的多肽施用于非人类动物的研究。seq id no:4的多肽可通过如实施例1所述的表达和如实施例2所述的纯化以高纯度获得。如实施例3所述配制。
[0416]
材料和方法
[0417]
视神经挤压(onc)模型
[0418]
将大鼠(sprague dawley，雄性，180-200g，charles river，意大利)饲养在温度和湿度控制的饲养箱中(12小时黑暗/光照循环，自由获取食物和水)。行为实验在上午9点到下午5点之间在一个安静的温度控制室(20到22℃)中进行，操作者对药物治疗的状态是不了解的。
[0419]
为了进行视神经挤压(onc)，用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为90mg/kg和3mg/kg，腹膜内，i.p.)对大鼠进行麻醉，并通过眼周结膜中的切口进入视神经。左侧视神经在距视盘1mm处被挤压10秒，使用交叉作用钳施加恒定且一致的力。所有程序均在无菌条件下对左眼进行。在左实验眼中诱导onc，而右眼作为内部对照。手术前后，通过手术显微镜观
察眼底，评估视网膜血流的完整性。
[0420]
在第一个实验环境中，在onc后第4、7和14天解剖视网膜并进行视网膜神经节细胞免疫检测，以评估视网膜损伤的时间进程。未触及和未处理的对侧右眼用作onc诱导的视网膜神经节细胞丢失的对照。选择onc后第7天作为对seq id no：4的多肽的作用进行初步研究的最佳时间点，因为存在约50％的视网膜神经节细胞群。
[0421]
大鼠在玻璃体内注射和滴眼后按照抢救治疗方案进行药物治疗，以研究seq id no:4的多肽在可能转化为临床的实验环境中的作用：
[0422]
·
用载剂或seq id no:4的多肽处理：20、2、0.2μg/ml溶液；从受伤后第4天开始进行2μl体积的玻璃体内注射，持续到第7天。
[0423]
·
用载剂或seq id no:4的多肽处理：200μg/ml溶液；从受伤后第4天开始进行25μl体积的滴眼，持续到第7天，每天一次、两次或三次。
[0424]
处理后，解剖视网膜并进行视网膜神经节细胞免疫检测以量化视网膜损伤和用seq id no：4的多肽进行不同处理的效果。
[0425]
免疫组化
[0426]
解剖的视网膜在福尔马林中后固定24小时并石蜡包埋。一些福尔马林固定石蜡包埋切片(5μm)用苏木精和伊红(h&e)染色以进行组织学检查。其他切片通过在二甲苯和递减乙醇系列(100％、90％和70％)中连续孵育进行脱蜡和再水化。通过将切片在10mm柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)中微波加热5分钟来实现抗原修复。将切片与一抗(brn3a，1:500；和rbpms 1:500)在湿度室中孵育1小时。然后将切片与预稀释的生物素化抗小鼠/兔igg二抗或生物素化抗豚鼠二抗(1:200，#ba-7000，vector laboratories，burlingame，美国)在室温下孵育30分钟，并在抗生物素蛋白-生物素复合物溶液(#pk-7200，vectastain elite abc-hrp试剂盒，vector laboratories，burlingame，美国)中在室温下孵育30分钟。然后将切片转移到过氧化物酶底物(#k3468，immpact dab，vector laboratories，burlingame，美国)4-6分钟以进行显色反应，并在安装前用蒸馏水冲洗。细胞核用mayer's苏木精复染。组织被可视化，并使用光学显微镜leica dm2500(leica microsystems，米兰，意大利)捕获数字图像。
[0427]
在对免疫阳性细胞进行低倍放大选择后，在7
×
104μm2的盒子中在高倍视野(hpf、x400、leica microsystem)下对总细胞、brn3a 和rbpms 细胞进行定量。对于每只大鼠，分析每只眼睛的3个不同切片。
[0428]
使用单向方差分析比较数据(平均值
±
sem)，然后使用bonferroni校正进行事后比较。graphpad prism(5.00版，拉霍亚，美国)用于所有分析，p＜0.05被认为具有统计学意义。
[0429]
结果
[0430]
在onc后第4天开始接受载剂玻璃体内治疗的大鼠中，与生成的数据一致，在模型建立期间，观察到视网膜神经节细胞数量减少了约60％。以3个不同剂量水平(20、2、0.2μg/ml溶液；注射量2μl)玻璃体内施用的seq id no：4的多肽对视网膜神经节细胞损失发挥剂量依赖性保护作用，这在用20μg/ml溶液接受玻璃体内注射的大鼠中达到统计学显著性。在该组中，遭受onc的眼睛中视网膜神经节细胞的数量与健康的对侧眼睛相似(图3)。
[0431]
此外，在遭受onc并在损伤后第4天开始接受载剂滴眼剂治疗的大鼠组中，视网膜
神经节细胞的损失与在模型的建立阶段和在评估玻璃体内注射后seq id no：4的多肽的作用的实验中量化的损失相比是超级强加的。通过应用3种不同的治疗方案研究了seq id no：4的多肽(200μg/ml)的滴眼剂的抢救治疗效果：每天一次，两次或三次。生成的数据显示，每天三次施用的200μg/ml溶液的生物活性显著提高，即使在每天施用一次和两次后疗效趋势也很明显(图4)。
[0432]
结论:seq id no：4的多肽在视神经损伤后四天给予的抢救效果是完全出乎意料的，并且每当rgc损失是病理过程的一部分时，开启了该化合物可有效恢复患有因外伤、缺血、炎症、代谢或肿瘤原因而患有视神经和其他视网膜疾病的患者的功能的可能性。
[0433]
实施例5：seq id no:2的多肽和seq id no:4的多肽在小鼠眼部施用后引发伤害性行为和面部异常性疼痛的比较
[0434]
本实施例的目的是研究seq id no：4的多肽在治疗和/或预防非人类动物眼科病症中的功效。
[0435]
本发明部分地基于对动物模型的实验。
[0436]
本文报道了将seq id no：4的多肽施用于非人类动物的研究。seq id no:4的多肽可通过如实施例1所述的表达和如实施例2所述的纯化以高纯度获得。如实施例3所述配制。
[0437]
本实施例的目的：
[0438]
1.本实施例旨在比较seq id no：4的多肽在眶下神经收缩(cion)小鼠模型中眼部滴注后与野生型人ngf(seq id no：2的多肽)和野生型小鼠ngf(mngf)的致痛活性。
[0439]
2.ngf类似物(seq id no：4的多肽)的效果将通过测量它们在眼部滴注后诱导急性伤害性反应的能力与seq id no：2的多肽mngf和已知诱导伤害性反应的刺激性参考化合物辣椒素相比较来评估。测试以下剂量：0.5、1、5和10μg，5μl/眼，用等渗盐水(nacl 0.9％)稀释。辣椒素的测试浓度为0.001-0.5nmol/5μl/眼。
[0440]
3.然后将测试不同化合物的亚阈值剂量在眶下神经收缩(cion)模型中在眼部滴注后诱导伤害性反应的能力。
[0441]
材料和方法
[0442]
鼠ngf(小鼠ngf、mngf)
[0443]
小鼠ngf是高纯度的天然小鼠ngf 2.5s(＞95％)，按照boccini等1969，pro.c natl.acad.sci.u s a，卷64，787-794页描述的方法从小鼠颌下腺中提取纯化获得。mngf由uniprot p01139多肽序列的第129-241位残基组成。
[0444]
伤害感受的体内模型
[0445]
动物实验将根据欧盟(eu)动物护理程序指南和欧盟指令2010/63/eu的意大利立法(dlgs 26/2014)应用进行。研究将在佛罗伦萨大学研究许可#194/2015-pr下进行。c57bl/6小鼠(雄性，25-30g，envigo，米兰，意大利)将用于伤害性测试。将动物饲养在温度和湿度控制的饲养箱中(12小时黑暗/光照循环，自由获取食物和水)。行为实验在上午9点到下午5点之间在一个安静的温度控制室(20到22℃)中进行，操作者对药物治疗的状态是不了解的。
[0446]
眶下神经收缩(cion)
[0447]
据报道，cion将在c57bl/6小鼠中进行(vos等，1994，j.neurosci.，卷14，2708-2723页；luiz等，2010，neuropeptides，卷44，87-92页)。简而言之，将通过腹膜内(ip)注射
氯胺酮(90mg/kg)和甲苯噻嗪(3mg/kg)的混合物对小鼠进行麻醉，并将左上唇鼻侧皮肤切开，露出眶下神经喙端。然后，将两个松散的收缩结扎线(#6/0丝线缝合线)放置在眶下神经周围，距离为2毫米。在假手术中，左侧眶下神经将被暴露但不结扎。将硫酸新霉素和磺胺噻唑(粉末，分别为0.05g和9.95g；boehringer ingelheim italia s.p.a，意大利)施加于伤口并缝合切口。将监测小鼠、充分补水并保持在受控温度(37℃)直至完全从麻醉中恢复。所有实验将在术后第10天进行。在实验结束时，用吸入的co2加10-50％o2对动物实施安乐死。
[0448]
小鼠擦眼试验
[0449]
如前所述，将使用测试化合物、seq id no：4的多肽、seq id no:2的多肽、mngf(全部，0.5、1、5和10μg，5μl/眼)和辣椒素的(0.5nmol/5μl/eye)或它们各自的载剂(等渗盐水，nacl 0.9％和1％二甲亚砜，dmso)的眼部滴注(5μl)来诱导急性伤害性反应(de petrocellis等，2010，pharmacol.res.，卷63，294-299页)。小鼠将被单独放置在有机玻璃室中，并在刺激前适应20分钟。记录5分钟的时间段内药物滴入眼睛后的擦眼动作次数，并视其为刺激性指标。
[0450]
在cion或假手术后第10天，小鼠将接受亚阈剂量的seq id no：2的多肽、mngf和seq id no：4的多肽或辣椒素的眼部滴注(5μl/眼)，并且将测量伤害性反应。
[0451]
结果
[0452]
在实施例的第一部分中，测试了不同剂量(0.001-0.5nmol)通过眼部滴注(5μl/滴眼)施用的辣椒素诱导急性伤害性反应的能力，测量5分钟时间段内擦眼的次数。辣椒素诱导剂量依赖性伤害性反应，如在辣椒素眼部滴注(0.001-0.5nmol/5μl/眼)后测量的擦眼反应增加所证明的(图5)。
[0453]
接下来，评估小鼠ngf(mngf)、人ngf(seq id no：2的多肽)和seq id no：4的多肽)的不同剂量(0.001-5μg 5μl/眼)。所有化合物均诱导伤害性反应的剂量依赖性增加，伤害性反应作为眼部应用后擦眼的次数测得。与mngf相比，更重要的是与seq id no：2多肽的突变形式相比，seq id no：2多肽的应用显示出更强的诱导伤害性反应的效力(图6)。
[0454]
接下来，评估了不同化合物在眶下神经收缩(cion)模型中的亚阈值剂量的效果。cion模型诱导了对进一步伤害性刺激的敏感性(trevisan等，2016，brain，139(pt 5)，1361-1377页)。
[0455]
在cion或假手术后第10天，小鼠接受亚阈值剂量的辣椒素(0.001nmol/5μl/眼)、mngf(0.001nmol/5μl/眼)、seq id no：2的多肽(0.001nmol/5μl/眼)和seq id no：4的多肽(0.001nmol/5μl/眼)的眼部滴注，测量擦眼的伤害性反应。
[0456]
数据显示，在致敏模型(cion模型)中，与在假手术小鼠中相比，亚阈值剂量的辣椒素产生的伤害性反应在cion手术小鼠中引起的反应更强烈(图7)。当将mngf和seq id no：2的多肽滴入cion手术小鼠的眼中时，获得了相同的结果。seq id no：4的多肽的眼部滴注未能诱导伤害性反应的增加。
[0457]
实施例6：治疗或预防人类眼科病症的用途
[0458]
该实施例的目的是进一步支持seq id no：4的多肽在治疗和/或预防人类眼科病症中的功效。
[0459]
本领域技术人员可以根据本文给出的指导确定多肽的合适剂量。
[0460]
发明人期望在人类中使用与发现对患有视神经损伤的大鼠有效的相同浓度(对于
每天三次200μg/ml的滴眼液)，特别是用于局部施用。最优选的是结膜施用。
[0461]
附图简要说明
[0462]
图1：根据实施例2的方法概述，包括实施例2b中描述的改进。
[0463]
图2：多肽序列。星号(*)＝成熟人ngf中的第61位；十字( )：成熟人ngf中的第100位。
[0464]
a：seq id no:1由各自的人类开放阅读框编码的前原人ngf序列。
[0465]
前体肽：氨基酸第1-18位；前肽：氨基酸第19-121位；成熟ngf：氨基酸第122-239位；c-末端二肽：氨基酸第240-241位。
[0466]
二硫键(在正确折叠的成熟部分)：连接氨基酸位置二硫键(在正确折叠的成熟部分)：连接氨基酸位置
[0467]
弗林蛋白酶切割位点(rskr)：氨基酸第118-121位。
[0468]
b:前体肽、前肽和成熟ngf的示意图。
[0469]
c:seq id no:2成熟人ngf的序列。
[0470]
d:seq id no：3
[0471]
e:seq id no：4
[0472]
图3：seq id no:4(“chf 6467”)的多肽在玻璃体内施用后的作用。通过one-way-anova进行统计分析，然后进行bonferroni事后分析。n＝6/组。
[0473]
图4：seq id no：4的多肽在用滴眼剂处理后的作用。通过单向方差分析进行统计分析，然后进行bonferroni事后分析。n＝3/组(详见实施例4)。
[0474]
图5：在c57bl/6小鼠中，由辣椒素(0.001-0.5nmol)的眼部滴注(5μl/滴眼)诱发的剂量依赖性擦眼反应。误差条表示平均值
±
sem，每组6-8只小鼠。veh是cps的载剂。*p＜0.05，***p＜0.001vs.载剂。带有bonferroni事后校正的单向方差分析。
[0475]
图6：在c57bl/6小鼠中，由小鼠ngf(mngf)、seq id no：2的多肽(“人ngf”)和seq id no：4的多肽(“突变的ngf”)(0.001-0.5nmol)的眼部滴注(5μl/滴眼)诱发的剂量依赖性擦眼反应。误差条表示平均值
±
sem，每组6-8只小鼠。veh是mngf、seq id no：2的多肽和seq id no：4的多肽的载剂。*p＜0.05，***p＜0.001vs.载剂。带有bonferroni事后校正的单因素方差分析。