用于侦测一病原体生物的数个系统及数个方法与流程

用于侦测一病原体生物的数个系统及数个方法
1.相关申请案
2.本技术根据美国专利法第119(e)条主张于2020年5月28日提交的美国临时专利申请第62/853,178号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
3.序列表声明
4.2020年5月26日创建的名称为82729.txt的所述ascii文件包括9,321个字节，与本技术的所述申请同时提交，通过引用并入本文。
5.技术领域及

背景技术：

6.本发明在其一些实施例中涉及电化学感测，更具体地但不排他地涉及一种用于电化学侦测数个基质中的一病原体微生物(例如一病原体微生物)的一存在、数量及/或类型的数个方法及数个系统，所述数个基质例如为数个农业基质，所述数个农业基质可用于确定与所述基质中的所述病原体生物相关的一疾病的一存在及/类型。在一些实施例中，本发明涉及农业，并且更具体地但不排他地涉及一种用于电化学侦测一农业基质(例如植物)中的一真菌(例如一锈菌)的一存在、数量及/或类型的一方法及系统，其可用于确定与所述基质中的所述真菌相关的一疾病的一存在及/类型。
7.锈菌是影响许多植物物种的数个生物营养病原体，所述被影响的许多植物物种包括一广泛的商业上重要的作物，例如大豆及小麦。真菌发育对于数个环境条件及植物-真菌病原体生物相互作用的所述数个遗传学受到极大地影响。
8.大豆锈病主要是由两种真菌引起的，即豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)及山马蝗层锈菌(phakopsora meibomiae)。
9.在大豆锈病的早期，它会导致叶子的上表面变黄。这个阶段很难识别，因为所述数个症状相对较小且定义不明确。后来，随着所述数个病害的不断发展，叶片变黄，病斑多在叶片背面，有时在叶柄、茎或荚上，也可观察到过早落叶的现象。
10.大豆锈病产生两种病斑：一种是在后期由灰色变为棕褐色的病斑，另一种是转为红褐色的病斑。成熟的棕褐色病斑由被数个变色坏死区域包围的数个小脓疱组成。在所述叶子下面的所述坏死区域可以找到数个棕褐色孢子。红褐色病斑具有较大的数个红褐色坏死区，所述叶子下面具有少数量脓疱及可见孢子。
11.数个大豆植物在生命周期的任何阶段都容易感染一锈病。然而，数个症状最常见于开花期间或之后。被豆锈病感染的数个大豆植物将导致豆荚产数量及饱满度下降。
12.数个小麦锈病(triticum aestivum)在世界各地均有发生，经常造成巨大的经济损失。小麦叶锈病(wheat leaf rust)、条锈病(stripe rust)及茎锈病(stem rust)由三种不同的真菌物种引起：分别为小麦锈菌(puccinia triticina)(以前称为puccinia recondite f.sp.tritici)、puccinia striiformis f.sp.tritici及puccinia graminis f.sp.tritici。
13.所述疫情的所述早期的正确诊断及监测对于有效防治小麦锈病及数个其他植物锈病至关重要，即用以选择及使用正确的数个杀菌剂及数个抗病品种。然而，锈病爆发的所述诊断、监测及预测传统上依赖于对数个疾病症状及数个体征的定期现场观察，而这种定
性发现的所述价值取决于所述观察者的所述经验及技能。
14.由于数个锈病造成的所述严重经济损失，许多研究都集中在用于快速及准确识别所述病害的数个技术的所述研发上，作为对所述耗时的叶片病害迹象实地监测的一补充或替代方法，以及疾病发展的症状。
15.这些技术包括，例如，数位成像及各种光谱技术、数个基于dna的方法及数个免疫学方法(例如，使用数个单克隆抗体)。
16.然而，数个成像及光谱方法通常需要熟练的技术人员及/或特殊设备，并且基于dna相关或免疫学相关方法的数个现有方法受到其复杂性、数个耗时的属性及数个敏感生物材料(如数个抗体及数个酶)的使用的强烈限制及酶，这使得所有这些方法在数个实时现场条件下执行的能力较差。


技术实现要素：

17.简单、直接、快速且具有成本效益的可重复使用的数个感测设备的所述开发在农业领域至关重要，对于数个植物病原体生物(如锈菌病原体)的现场快速实时超灵敏侦测的数个改良方法中存在一广泛认识的需要。
18.数个本发明人已设计并成功实践了一种新颖方法，所述新颖方法能够以超高灵敏度、高选择性、快速侦测周转及具有成本效益的特性对数个病原体微生物(例如锈菌)进行一简单的电化学感测。
19.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种侦测一基质中及/或一基质上的一病原体生物的一存在、数量及/或类型的方法，所述方法包括以下步骤：使怀疑含有所述病原体生物或其一部分的一样品与一电极接触，如果所述病原体生物或其一部分存在于所述样品中，从而将所述病原体生物或其一部分吸附到所述电极的一表面的至少一部分，从而获得具有所述病原体生物的至少一部分的一电极，所述病原体生物的至少一部分吸附到其一表面；在与所述样品接触之后，将所述电极与一适体接触，所述适体选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分；在与所述适体接触之后，将所述电极与一试剂接触，所述试剂参与一电化学可侦测反应；及在与所述试剂接触之后，在所述电极的所述存在下进行所述电化学反应，其中由所述反应产生的一电信号指示出所述试剂的一存在及/或数量，并且从而指示出所述样品中的所述病原体生物的一存在及/或数量。
20.根据在此描述的任何实施例中的一些，所述电极是一气体透性(空气体透性电极)电极，并且通过对所述基质周围的一环境抽气来使所述电极与所述样品的接触。
21.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极以能够与所述病原体生物相互作用的数个官能团为特征。
22.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述数个官能团是带正电荷的数个基团，例如胺基团。
23.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述数个官能团共价连接至所述电极的所述表面的至少一部分。
24.根据在此描述的任何实施例中的一些，所述电极是一碳纤维电极。
25.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极是一碳纸电极。
26.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述碳纸电极是一空气体透性电极碳纸电
极。
27.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述碳纸电极具有与其表面的至少一部分共价连接的带正电的数个基团。
28.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法还包括，在使所述电极与所述样品接触之后，采用一成像技术从而确定所述电极的一表面上的一病原体生物的一存在或不存在。
29.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述成像技术包括光学显微镜术及/或扫描电极显微镜术。
30.根据本文所述的任何实施例中的一些，使所述电极与所述适体接触的步骤包括使所述电极与含有适体的一溶液接触。
31.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述溶液包含以一碱性ph为特征的一碳酸盐缓冲液。
32.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述适体包含由seq id no：35表示的一核苷酸序列。
33.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述适体具有选自seq id nos：8至18及32至36的一核苷酸序列。
34.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述适体具有由seq id no：17表示的一核苷酸序列。
35.根据本文所述的任何实施例中的一些，使所述电极与参与所述电化学可侦测反应的一试剂接触的步骤包括使所述电极与含有所述试剂的一溶液接触。
36.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述适体以一第一官能团为特征以及所述试剂以一第二官能团为特征，以及所述第一及第二官能团彼此化学相容。
37.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述第一及第二官能团形成一亲和对。
38.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述亲和对包含生物素及亲和素或链亲和素。
39.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学可侦测反应产生一电化学可侦测物质。
40.根据本文所述的任何实施例中的一些，一反应物是所述电化学可侦测反应，是一电化学可侦测物质。
41.根据本文所述的任何实施例中的一些，参与所述电化学可侦测反应的试剂是促进所述反应的一试剂，以及其中使所述电极进行所述反应的步骤包括使所述电极与含有所述电化学可侦测一反应物的一电解质溶液接触。
42.根据本文所述的任何实施例中的一些，参与所述电化学可侦测反应的所述试剂是催化所述反应的一酶。
43.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述反应产生一氧化还原反应性物质。
44.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述酶选自一磷酸酶、一葡糖苷酶、一几丁质酶及一纤维二糖水解酶。
45.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述酶是一碱性磷酸酶。
46.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述酶是一半乳糖苷酶。
47.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电解质溶液包含以一碱性ph为特征的一碳酸盐缓冲液。
48.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法用于侦测一大豆锈菌的一存在及/或数量，所述方法包括：使怀疑含有所述大豆锈菌或其一部分的所述样品与一气体透性电极碳电极接触，如果所述病原体生物或其一述部分存在于样品中，从而将所述病原体生物或其一部分吸附到所述电极表面的至少一部分，从而获得具有所述病原体生物的至少一部分的所述气体透性电极碳电极，所述病原体生物的至少一部分吸附到其一表面；在与所述样品接触之后，将所述电极与一适体接触，所述适体选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分，所述适体具有选自由seq id no：8至18及32至36组成的群组的一核碱基序列并具有与其共轭的生物素；在与所述适体接触之后，使所述电极与一碱性磷酸酶接触，所述碱性磷酸酶具有与其共轭的亲和素或链亲和素；以及在将所述电极与所述碱性磷酸酶接触之后，将电极与包含所述碱性磷酸酶基质的一电解质溶液接触并在所述电极存在下进行所述电化学反应，其中由所述反应产生的一电信号指示出所述或碱性磷酸酶的一存在及/的数量，从而指示出所述样品中的所述大豆真菌的一存在及/或数量。
49.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述大豆锈菌是豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)。
50.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述样品为怀疑被所述病原体生物感染的一基质的一部分或所述基质周围的一环境的一部分。
51.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述基质是一农业基质。
52.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体微生物选自由一锈菌、一白粉病、一咖啡叶锈病、一镰刀菌赤霉病、一马铃薯晚疫病、一苹果黑星病、一绿化(细菌或昆虫载体)、一褐飞虱、一水稻螟虫及一毛虫/鳞翅目害虫所组成的群组。
53.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体生物是一病原体微生物。
54.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体微生物是一真菌。
55.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体微生物是一锈菌。
56.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体生物是一锈菌，以及所述样品是怀疑被所述锈菌感染的一植物周围的一环境的一空气样品。
57.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种感测电极，所述感测电极具有吸附于其的一病原体生物或其一部分以及一适体，所述适体选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分，附接于所述病原体生物或其所述部分。
58.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种电极，所述电极具有吸附于其的一大豆锈菌及一适体，所述适体具有一核碱基序列，所述核碱基序列选自由seq id no:8至18及32至36所组成的群组并附接于所述锈菌。
59.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种感测电极，所述感测电极具有吸附于其的一病原体生物或其一部分、一适体、以及一试剂，所述适体选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分并附接于所述病原体生物或其所述部分，以及所述试剂参与一电化学可侦测反应并附接于所述适体。
60.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了所述电极具有吸附于其的一大豆锈菌、一适体、以及一碱性磷酸酶，所述适体具有选自由seq id no：8至18及32至36所组成的
群组的一核碱基序列并附接于所述锈菌，所述碱性磷酸酶附接于所述适体。
61.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述适体及所述碱性磷酸酶之一者具有与其共轭的生物素，以及所述适体及所述碱性磷酸酶中的另一者具有与其共轭的亲和素或链亲和素，以及其中所述碱性磷酸酶通过形成一生物素-亲和素/链亲和素亲和对来附接于所述适体。
62.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种电化学系统，所述电化学系统包括吸附于其上的所述电极、一大豆锈菌、一适体、以及接附于所述适体的一碱性磷酸酶，所述适体具有选自由seq id no：8至18及32所组成的群组的一核碱基序列并接附于所述大豆锈菌，其中所述电极形成一电化学电池的一部分，以及所述电化学电池可通过将所述电极电性连接到一电源来操作。
63.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种电化学系统，其包括如本文所述的任何相应实施例及其任何组合的一电极，所述电极具有吸附于其的一病原体生物或其一部分、一适体以及一试剂，所述适体选择性地结合到一病原体生物或其一部分并接附于所述病原体生物或其所述部分，所述试剂参与一电化学可侦测反应并接附于所述适体，其中所述电极形成一电化学电池的一部分，以及所述电化学电池可通过将所述电极电性连接到一电源来操作。
64.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学电池还包括一参考电极及任选的一辅助电极。
65.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学系统包括一硬件处理器，所述硬件处理器配置用于接收由所述电极产生的所述信号并处理所述信号。
66.根据这里描述的任何实施例中的一些，所述硬件处理器配置成用于将所述经处理的信号传输到一远程位置处的一服务器计算机。
67.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述硬件处理器配置用于处理所述信号以确定在所述电极上的一病原体生物或其所述部分的存在、数量及/或类型，并将与所述确定有关的信息传输到一远程位置处的一服务器计算机。
68.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学系统包括一硬件处理器，所述硬件处理器配置用于接收由所述电极产生的所述信号并将所述信号传输到一远程位置的一服务器计算机。
69.根据在此描述的任何实施例中的一些，所述硬件处理器配置成通过一通信网络接收数个软件及/或固件更新。
70.根据这里描述的任何实施例中的一些，所述硬件处理器配置成为通过一通信网络接收数个控制命令。
71.根据在此描述的任何实施例中的一些，所述数个控制命令包括数个灵敏度校准命令。
72.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学系统包括用于接收数个控制命令的一用户界面。
73.根据在此描述的任何实施例中的一些，所述数个控制命令包括数个灵敏度校准命令。
74.根据本发明一些实施例的一方面，提供了一种监测方法，包括以下步骤：在一时间
段内从多个电化学系统在多个各自的位置处接收与一病原体生物的一存在、数量及/或类型有关的数据；及监测所述时间段内的所述数个位置的每一者处的所述病原体生物的所述存在、数量及/或类型的数个改变；其中所述多个电化学系统的每一者包括如本文在相应实施例中的任一个中描述的系统。
75.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述监测的步骤包括根据所述病原体生物的所述存在、数量及/或类型来将所述数个位置绘制成图谱。
76.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法包括监测所述病原体生物在所述多个位置之间的扩散。
77.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括一电极及一溶液，所述溶液包括一适体，所述适体选择性地结合到单独包装在所述试剂盒内的一病原体生物或其一部分。
78.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述试剂盒还包括数个指示，以使所述电极与怀疑含有所述病原体生物或其所述部分的一样品接触，并随后使所述电极与所述溶液接触。
79.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述试剂盒还包括一溶液，所述溶液含有能够与所述适体结合并参与一电化学可侦测反应的一试剂，所述溶液单独包装在所述试剂盒内。
80.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述试剂盒还包括数个指示，以使所述电极与怀疑含有所述病原体生物或其所述部分的一样品接触，随后将所述电极与包括所述适体的所述溶液接触，并且随后将所述电极与包含所述试剂的所述溶液接触。
81.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述试剂盒还包括单独包装在所述试剂盒内的所述电化学可侦测反应的一反应物。
82.根据本发明一些实施例的一方面，一种减少一基质中及/或一基质上的一病原体生物的一负载的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1至30中任一项所述的方法来确定所述基质中及/或所述基质上的所述病原体生物的一存在、数量及/或类型，并且基于所述确定，将所述基质与能够减少所述病原体生物的一族群的一抗微生物剂接触。
83.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述病原体生物是一锈菌，以及所述抗微生物剂是可用于减少所述锈菌的一负载及/或控制所述锈菌的一族群的一杀真菌剂。
84.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述锈菌是大豆锈菌。
85.根据本文所述的任何实施例中的一些，根据本文在相应实施例中的任一个及其任何组合来确定所述大豆锈菌的一存在及/或数量。
86.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种在一农业基质中控制由一病原体生物引起的一疾病的一存在及/或进展的方法，其特征在于，所述方法包括使用如本文在各个实施例中的任一个中描述的方法来确定所述基质中及/或所述基质上的所述病原体生物的一存在、数量及/或类型，并且基于所述确定，使用能够控制所述病原体生物的一族群的一杀虫剂来处理一基质，所述基质经鉴定为已被所述病原体生物感染。
87.原体生物是一锈菌，以及所述杀虫剂是一杀真菌剂，所述杀真菌剂可用于控制所述基质中的所述锈菌的一族群。
88.根据本文所述的任何实施例中的一些，所述锈菌是大豆锈菌。
89.根据本文所述的任何实施例中的一些，根据本文在相应实施例中的任一个及其任何组合来确定所述大豆锈菌的一存在及/或数量及/或类型。
90.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有选自本文作为seq id nos：1至18及32至36呈现的所述数个序列的一核苷酸序列。
91.根据本发明的一些实施例的一方面，提供了对如本文所述的一大豆锈菌具有选择性的一适体，所述适体为如本文在任何相应实施例及其任何组合中所述。
92.除非另有定义，本文使用的所有技术及/或科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法及材料相似或等效的方法及材料，但下文描述了示例性方法及/或材料。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法及实施例仅是说明性的，并不旨在进行必要的限制。
93.本发明实施例的所述方法及/或系统的实现可以涉及手动地、自动地或以其一组合来执行或完成数个选择的任务。此外，根据本发明的所述方法及/或系统的实施例的实际仪器及设备，几个选择的任务可以通过硬件、软件或固件或其一组合使用一操作系统来实现。
94.例如，根据本发明的数个实施例用于执行数个选择任务的硬件可以实现为一芯片或一电路。作为软件，根据本发明的实施例的数个选择任务可以被实现为由使用任何合适操作系统的一计算机执行的多个软件指令。在本发明的一示例性实施例中，根据如本文所述的方法及/或系统的数个示例性实施例的一或多个任务是由一数据处理器执行的，例如用于执行多个指令的一计算平台。可选地，所述数据处理器包括用于存储数个指令及/或数据的一易失性存储器及/或用于存储数个指令及/或数据的非易失性存储器(例如一磁性硬盘及/或可移动介质)。可选地，还提供一网络连接。也可选地，提供一显示器及/或诸如一键盘或一鼠标之类的一用户输入设备。
附图说明
95.本发明的一些实施例在此仅通过范例并参考数个附图来描述。现在具体详细地参考数个附图，强调所显示的细节是通过范例的方式并且出于对本发明的数个实施例的说明性讨论的目的。在这点上，结合数个附图的叙述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施例。
96.图1呈现用于实施如本文所述的一方法的一示例性电化学感测系统组件的一照片。
97.图2a至图2b显示出一示例性的、自制的、带有硅管的便携式空气采样器(图2a)，用于在所述空气泵送期间的空气收集及所述数个电极的固定(图2b)。
98.图3显示出悬浮在具有一天然氧化层(《100》，n型砷，355μm至395μm，15mω/cm至7mω/cm)的一硅晶片上的数个大豆锈菌样品的数个光学显微镜图像。将数个大豆锈病样品悬浮在1:1去离子水及异丙醇的一混合物中。
99.图4显示出在20kv、10mm距离及高真空模式下沉积4nm金/钯后的一大豆锈菌样品的数个sem二次电子图像。
100.图5a至图5b显示出在沉积4nm金/钯之后以20kv、10mm距离及高真空模式所拍摄的
数个大豆锈尖峰的数个二次电子(图5a)及数个背散射电子(图5b)图像。
101.图6a至图6b显示出数个光学显微镜图像：在x400放大倍数下拍摄的一微碳纤维电极(0.18mm厚，类型spectracarb 2050a-1050)的明场(图6a)及暗场(图6b)分析。
102.图7显示出微碳纤维电极(0.18mm厚，spectracarb 2050a-1050型)的数个扫描电子显微镜图像(数个二次电子图像)。所述数个图像是在20kv、10mm距离及高真空模式下以各种放大倍率所拍摄的。
103.图8显示出数个光学显微镜图像：所述微碳纤维电极在不同放大倍数下的明场及暗场图像，其是在使用上述自制空气采样系统对大豆锈样品周围进行采样3分钟后以10升/分钟的速度进行的。
104.图9a至图9c显示出大豆锈菌在所述微碳纤维电极上的数个扫描电子显微镜图像(二次电子图像)，其为在对大豆锈菌样品周围进行采样3分钟后、使用图2a至图2b所示的自制空气采样系统、以10升/分钟的一速度、在两个放大倍数下(图9a及9b)以及相对于背散射电子的相应图像(图9c)的所述数个二次电子图像。在拍摄所述数个图像之前，已在所述数个样品上进行了4nm金/钯的一沉积。所述数个图像是在20kv、10mm距离及高真空模式下拍摄的。
105.图10(背景领域)显示出在以下所述中的所述酶浓度上的来自牛肠的碱性磷酸酶的所述特异性活性(α)的所述依赖，(1)硼酸盐缓冲液、(2)hepes、(3)甘氨酸缓冲液、(4)碳酸盐缓冲液及(5)tris；ph 8.5，取自l.f.atyaksheva等人，russian journal of physical chemistry a，2008年，第82卷，第11期，第1947至1951页。
106.图11显示出在上述碳酸盐缓冲液中的所述碱性磷酸酶基质(对硝基苯磷酸酯)在所述修饰的微碳纤维电极(具有所述碱性磷酸酶，所述碱性磷酸酶接附于所述适体上，所述适体结合所述数个孢子，所述数个孢子吸附到所述电极的表面上)上获得的所述数个循环伏安图。在0ppm至500ppm之间的基质浓度范围内获得一浓度依赖性信号，以及所述数个电流峰值在0.350v及-0.950v处接收。
107.图12显示出10个循环的循环伏安法测量(扫描1至扫描10)。所述背景溶液是基于如上文所述的一碳酸盐缓冲液(ph＝9.5)，并添加了500ppm对硝基苯基磷酸酯(所述基质)。在开始所述数个测量之前，所述微碳纤维电极吸附了10个单位的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶对所述微碳纤维电极的所述酶活性如图12所示，表示出所述信号随时间而增加，这是由于对硝基苯磷酸酯向对硝基苯酚的所述酶促转化。正如预期的那样，所述数个峰值是可逆的(0.065v及-0.165v)。
108.图13显示出在碳电极存在下吸附10个碱性磷酸酶单位的所述碱性磷酸酶基质的数个循环伏安图，表示出所述碳酸盐缓冲液(蓝色)、500ppm碱性磷酸酶基质(对硝基苯磷酸盐；绿色)、以及在所述碳电极存在下吸附10个碱性磷酸酶单位的500ppm碱性磷酸酶基质(红色)的所述电化学背景。
109.图14a至图14b显示出碱性磷酸酶修饰的数个微碳纤维电极与所述缓冲碳酸盐(ph＝9.5)中的500ppm对硝基苯基磷酸酯(所述基质)的所述酶促反应之前(图14a)及之后(图14b)的一示例性电化学装置。
110.图15a显示出在所述测试的碳酸盐缓冲液中使用循环伏安法分析的对硝基苯酚的所述侦测极限。仅显示出每个循环伏安法测量的所述第二次扫描。图14中所示的所述电化
学装置中的所述侦测极限为0.5ppm(所述红线)。
111.图15b显示出在如本文所述的一碳酸盐缓冲液中使用循环伏安法分析的对硝基苯酚的所述校准曲线。
112.图15c至图15d显示出在-0.070v对于对硝基苯酚浓度(图15c)处的所述数个阴极峰及在0.070v对于对硝基苯酚浓度(图15d)处的所述数个阳极峰。
113.图16显示出用数个生物素化二氧化硅珠进行的所述循环伏安法的所述第二次扫描。所述橙色图代表所述背景测量，所述红色图代表数个硅胶珠的所述侦测。
114.图17(背景领域)是根据所述selex方法描述数个适体的所述选择的一示意图，取自song等人，anal.chem.，2008年。
115.图18a至图18b是数个柱状图，显示出在数个fam-锚定-候选物(a)的所述培育及所述数个结合部分(b)的所述洗脱与豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)(pp)数个孢子(图18a)及所述数个阴性对照孢子(图18b)一起的荧光强度。cdt＝候选物[cdt00＝sp000＝sp00＝seq.id no:8；cdt01＝sp001＝sp01＝seq id no:9；cdt02＝sp002＝sp02＝seq id no:10；cdt03＝sp003＝sp03＝seq id no:11；cdt04＝sp004＝sp04＝seq id no:12；cdt05＝sp005＝sp05＝seq id no:13；cdt06＝sp006＝sp06＝seq id no:14；cdt13＝sp013＝sp13＝seq id no:15；cdt14＝sp014＝sp14＝seq id no:16；cdt15＝sp015＝sp15＝seq id no:17；cdt18＝sp018＝sp18＝seq id no:18]。
[0116]
图19是作为一四链体的所述候选sp000(sp00；seq id no：8)的t(50)-t(66)区域的一建议二级结构排列的一示意图。
[0117]
图20a至图20b显示出在数个mfold二级结构研究中获得的数个适体sp02(seq id no：10；图20a)及sp13(seq id no：15；图20b)的所述数个预测二级结构。所述数个g块以黄色突出显示，所述数个引物区域以粉红色突出显示。所述数个截断位点以绿色表示。
[0118]
图21是一条形图，其显示出通过荧光测量(λexc：585nm；λem：635nm)评估的与豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)(pp)夏孢子(urediniospores)相关的数个适体变体的所述分数。
[0119]
图22显示出根据本实施例的一示例性碳电极的所述循环伏安法的所述第二次扫描，所述碳电极具有带有seq id no:17的生物素化适体及具有与其共轭、接附于其的亲和素的一碱性磷酸酶，在泵送空气实验室空气1分钟后(背景；蓝线)，将含有数个锈病孢子的一样品空气泵送1分钟(锈病，红线)，并将含有白粉病孢子的一样品空气泵送1分钟(对照；绿线)。在接附所述适体及所述碱性磷酸酶之前进行空气泵送。参考电极-ag/agcl。
[0120]
图23是根据本发明的一些实施例的用于侦测一基质中及/或一基质上的所述病原体生物的所述存在、数量及/或类型的一示例性系统的一简化示意图。
[0121]
图24是呈现根据一些当前实施例的一示例性方法的一简化流程图。
[0122]
图25是根据一些本发明实施例的一示例性电化学电池的一简化示意图。
具体实施方式
[0123]
本发明在其一些实施例中涉及电化学感测，更具体地但不排他地涉及用于电化学侦测数个基质(例如农业基质)中的一病原体生物(例如病原体微生物)的存在、数量及/或类型的一方法及系统，其可用于确定与所述基质中的所述病原体生物相关的一疾病的一存
在及/类型。在一些实施例中，本发明涉及农业，并且更具体地但不排他地涉及用于电化学侦测数个病原体微生物(例如数个植物中的锈菌)的一存在、数量及/或类型的一方法及系统，其可用于确定与所述基质中的所述病原体微生物相关的一疾病的一存在及/类型。
[0124]
在详细解释本发明的至少一实施例之前，应当理解，本发明在其应用方面不一定限于以下说明及/或在所述数个附图绘示及/或所述数个范例中阐述的所述数个组件及/或数个方法的构造及配置的所述细节。本发明能够有数个其他实施例或能够以各种方式实践或实施。
[0125]
简单、直接、快速且具有成本效益的可重复使用的感测设备的所述开发在农业领域至关重要，且对于数个植物病原体生物(如锈菌病原体)的现场快速实时超灵敏侦测的数个改良方法中存在一广泛认识的需要。
[0126]
数个本发明人设计并成功实践了一种新颖方法，所述新颖方法能够对数个病原体生物或其数个部分(例如，数个病原体微生物，如锈菌)进行一简单的电化学感测，具有超高灵敏度、高选择性、快速侦测周转及成本效益特性。
[0127]
所述方法优选地利用具有高表面积的数个电极来收集，例如通过吸附及预浓缩来自数个样品(例如数个空气样品)的所述数个病原体物种，其中选择性地结合到所述数个病原体物种的一适体接附于所述样品。然后通过产生数个电化学可侦测试剂的一系列相互作用，以电化学方式确定所述适体的所述存在，从而指示出所述病原体生物物种的所述存在及任选地并且优选地所述类型。
[0128]
数个本发明人组装了如图1及图2a至图2b及图14a至图14b所示的自制空气采样器及电化学组件，并证明这些简单的数个自制装置在实践如本文所述的方法中成功地执行。
[0129]
数个本发明人进一步研究了大豆锈菌对各种电极的所述吸附，并通过如图3至图9b所示的数个显微测量显示了一成功的吸附及表征。
[0130]
图10至图13及图15a图至图15d显示出数个循环伏安法测量，示出碱性磷酸酶的电化学侦测为其一基质的所述存在。
[0131]
图16显示出数个循环伏安法测量结果，示出数个生物素化材料的一成功电化学侦测。
[0132]
图17至图21显示出利用selex方法，以鉴定对大豆锈菌(例如，豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)具有选择性的数个寡核苷酸适体。
[0133]
图22显示出数个循环伏安法测量结果，示出使用本文所述的方法的大豆锈菌的一成功的选择性电化学侦测。
[0134]
可用于实施本文所述的所述方法的一系统及方法的数个示意图，显示于图23至图25中。
[0135]
本发明的数个实施例涉及侦测一基质中的一病原体生物的一存在、数量及/或类型的一方法。
[0136]
根据所述数个本实施例，所述方法包括：
[0137]
将怀疑含有病原体生物或其一部分的一样品与一电极接触，从而使所述电极与选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分的一适体接触，从而将所述电极与参与一电化学可侦测反应的一试剂接触，从而在使用所述电极的同时进行所述电化学反应。所述反应产生的所述电信号指示出所述病原体生物或其所述部分的一存在及/或数量，如本文所定
义。
[0138]
本发明的数个实施例还涉及可用于实施所述方法的一感测系统及数个试剂盒，以及用于确定用于减少一基质中的一病原体生物(例如，病原体微生物)的一负载的一合适试剂的所述方法的用途。
[0139]
方法：
[0140]
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种侦测一样品及/或一基质中的一病原体生物的一存在、数量及/或类型的方法。
[0141]
根据一些实施例，本文所述的方法是侦测一样品中的一病原体生物的一存在。
[0142]
根据一些实施例，本文所述的方法是侦测一样品中的一病原体生物的一存在及类型。
[0143]
根据一些实施例，本文所述的方法是侦测一样品中的一特定类型病原体生物的一存在。
[0144]
根据一些实施例，所述方法确定一样品中是否存在一病原体生物的一某种类型。
[0145]
根据这些实施例中的一些实施例，所述方法进一步确定一样品中的所述病原体生物(例如，一生物的一某种类型)的一数量。
[0146]
根据这些实施例中的一些实施例，所述方法指示出在来自所述样品的一基质中的所述病原体生物的一存在及/或类型及/或数量，如下文进一步详细描述的。
[0147]
如本文所述的所述方法可用于侦测一样品中的一某种病原体生物(本文称为待侦测的所述病原体生物)的一存在及/或数量(水平)，并且可以根据需要进行操作以使其可用于通过选择一合适的适体来侦测任何病原体生物，如下文进一步详细描述。
[0148]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法通常包括：
[0149]
使怀疑含有病原体生物或其一部分的一样品(如本文中任何相应实施例中所述)与一电极(本文中也表示为电极100)(如本文中任何相应实施例中所述)接触，如果所述病原体生物或其所述部分存在于所述样品中，从而将所述病原体生物或其所述部分吸附到所述电极的一表面的至少一部分，从而获得具有所述病原体生物的至少一部分的一电极，所述病原体生物的至少一部分吸附到其一表面(本文中也表示为电极102)；
[0150]
在与所述样品接触之后，使所述电极(电极102)与一适体(本文也称为适体104)接触，所述适体选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分；
[0151]
在与所述适体接触之后，将所述电极(在本文中也称为电极110)与一试剂(在本文中也称为试剂112)接触，所述试剂参与一电化学可侦测反应；及
[0152]
在与所述试剂112接触之后，在所述电极(本文也称为电极120)的存在下进行所述电化学反应，其中由所述反应产生的一电信号指示出参与一电化学可侦测反应的所述试剂的一存在及/或数量(试剂112)，并且从而指示出所述样品中的所述病原体生物或其所述部分的一存在及/或数量。
[0153]
现在请参照图24，其显示出根据本发明的一些实施例的一示例性方法，所述方法开始于将所述电极100(如本文在任何相应实施例中描述的)与如本文在任何相应实施例中描述的一样品接触。
[0154]
可以与一液态、固态或气态的一样品进行所述接触。
[0155]
当所述样品为液体时，所述液体可能是所述病原体生物或其一部分在一载体中的
一悬浮液或分散体，且所述接触的步骤包括例如将所述电极浸入所述液体样品中，或将所述液体样品滴在所述电极上，或任何其他能够使所述液体样品与所述电极接触的程序。
[0156]
当所述样品是固体或气体时，所述接触的步骤可以通过泵送(例如，空气泵送)所述样品来进行，这可以通过例如一空气泵来进行，包括数个手持式、便携式或非便携式气泵，如下文所述。
[0157]
如以下范例部分所述，数个本发明人已经证明，在一些相应实施例中，通过空气泵将含有一病原体微生物的一样品与如本文所述的一碳电极接触，导致了所述微生物被所述电极吸附，并且具有展示了几种成像技术，所述几种成像技术在所述微生物被吸附到所述电极上时可以侦测及识别所述微生物。
[0158]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法进一步包括，在使所述电极(电极100)与所述样品接触之后，采用一成像技术从而在所述电极的一表面上确定一病原体生物或其所述部分的一存在或不存在。
[0159]
根据一些实施例，所述成像技术包括光学显微术及/或扫描电极显微术，例如在随后的所述范例部分中的范例1中所描述的。
[0160]
在将所述电极与所述样品接触后，获得电极102。如果一病原体生物或其一部分存在于一样品中，则电极102将被视为电极100，电极100具有一病原体生物或其所述部分，所述病原体生物或其所述部分被吸附到所述电极的表面的至少一部分。所述病原体生物或其一部分可以是待通过所述方法侦测的所述病原体生物、或所述样品中存在的任何其他生物(病原体及/或非病原体)。如果所述样品不包含一病原体生物或任何其他生物，则电极102可以与电极100相同(因为其表面不具有吸附任何物质)，或者可以将存在于所述样本中的数个非有生命物体或物种吸附到其表面。在任何情况下，除了所述待侦测的病原体生物(如果存在于所述样品中)之外，电极102还可以包括由于所述接触而被吸附到其上的有生命的及非有生命的物种。
[0161]
一旦在接触所述样品时产生电极102，所述电极则与一适体(例如适体104)接触，如本文在任何相应实施例及其任何组合中所述。在本文所述的任何实施例中的一些中，适体104具有与其共轭的一第一官能团(其在本文中也称为官能团106)，如图24所示。
[0162]
如下文进一步详细描述的，适体104设计成选择性地结合至所述待侦测的病原体生物的至少一部分。
[0163]
一旦电极102接触所述适体(适体104)，则获得了电极110。
[0164]
如果电极102具有吸附于其表面的待侦测的病原体生物或其一部分，则电极110具有与所述病原体生物或其一部分相关联的适体104。然而，如果电极102不具有吸附于其表面的所述待侦测的病原体生物或其一部分，而是具有吸附于其表面的数个其他病原体或非病原体生物或其数个部分及/或数个非有生命物体或物种，则在接触适体104时形成的电极110与电极102基本上相同，因为适体104不与待侦测的病原体生物以外的物种缔合或结合。
[0165]
然后使电极110与参与一电化学反应的一试剂(本文也称为试剂112)接触，如本文在任何相应实施例及其任何组合中所述，以提供电极120。
[0166]
试剂112及适体104经选择以使得试剂112选择性地与适体104相互作用。
[0167]
在本文所述的任何实施例中的一些中，适体104具有与其共轭的一第一官能团(官能团116)以及试剂112包含一第二官能团(其在本文中也称为官能团118，未绘示于图24
中)。如果所述第一官能团(官能团116)存在于所述电极110中(即，如果适体104存在于所述电极110中)，则所述第二官能团(官能团118)与所述第一官能团(官能团116)化学相容，并与其相互作用，即，与所述第一官能团缔合。
[0168]“化学相容”(chemically compatible)是指所述所述第一及第二官能团能够通过氢键相互作用、芳族相互作用、静电相互作用、有机金属相互作用、硬脂相互作用及共价键中的一者或多者彼此发生化学相互作用。在一些实施例中，所述数个官能团可以在它们之间相互作用以形成一或多个键结，例如数个氢键、数个离子键及/或数个共价键。
[0169]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述第二官能团(官能团118)与所述第一官能团(官能团116)选择性地相互作用(例如，通过本文所述的所述数个任何化学相互作用)，使得所述第二官能团(官能团118)(如本文所述)选择性地与所述第一官能团(官能团116)相互作用，而不与可能是电极110的一部分的任何其他化学基团相互作用。
[0170]“选择性地相互作用”(selectively interacts)是指所述第二官能团(官能团118)与所述第一官能团(官能团116)以相较于其他甚至结构或功能相似的数个化学基团或数个种类的一高得多的水平来相互作用。
[0171]
在一些实施例中，所述第一及第二官能团之间的一选择性相互作用意味着所述第一及第二官能团之间的一解离常数低至少一数量级，任选地低两个或三个数量级，然后在所述第二官能团及可以是电极110的一部分(例如存在于其所述表面上)的任何其他化学基团或种类。
[0172]
在一些实施例中，所述第二官能团与所述第一官能团具有一结合亲和力，其特征在于，一解离常数kd或kd不超过1mm，或不超过100nm，或不超过10nm，或不超过1nm，或不超过10-10
m，或不超过10-12
m，且甚至更低，例如低至10-15
m。
[0173]
在本文及本领域中，一解离常数kd表示为：[a]x[b]/[ab]，其中a是一对的一第一成员(例如，如本文所述的一第一官能团)，以及b是成对的第二成员(例如，如本文所述的一第二官能团)。在一低解离常数下，所述数个游离组分[a]及[b]的所述数个浓度远低于其所述对[ab]的所述浓度。
[0174]
所述第一及第二官能团(或所述适体104及试剂112)之间的所述相互作用可以是可逆的或不可逆的。
[0175]
在本文所述的任何实施例中的一些中，所述第一及第二官能团形成如本文所定义的一亲和对。
[0176]
在一些实施例中，所述第一及第二官能团形成一亲和对，其特征在于，如本文所述的一解离常数kd。
[0177]
数个示例性亲和对包括但不限于一酶-基质对、一多肽-多肽对(例如，一激素及一受体、一配体及一受体、一抗体及一抗原、一多聚体蛋白的两条链)、一多肽-小分子对(例如，亲和素或链亲和素与生物素、酶-基质)、一多核苷酸及其同源多核苷酸，例如形成一双链的两个多核苷酸(例如，dna-dna、dna-rna、rna-dna)、一多肽-多核苷酸对(例如，由一多肽及一dna或rna形成的一复合物，例如适体或互补肽核酸及寡核苷酸)、一多肽-金属对(例如，一蛋白质螯合剂及一金属离子)、一多肽及一碳水化合物(瘦素-碳水化合物)等。
[0178]
在数个本实施例的所述上下文中，一亲和对的一成员是一第一官能团(官能团116)而所述另一者是所述第二官能团(官能团118)。
[0179]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述亲和对是一亲和素-生物素对或一链亲和素-生物素对，使得所述第一及第二官能团中的一者是亲和素或链亲和素，以及所述另一者是生物素。
[0180]
在这些实施例的一些中，所述第一官能团(官能团116)是生物素，使得适体104具有与其共轭的生物素，以及所述第二官能团(官能团118)是亲和素或链亲和素，使得所述试剂112具有与其共轭的亲和素或链亲和素。
[0181]
因此，如果所述待侦测的病原体微生物吸附到电极102中的所述电极的表面，且因此适体104与所述病原体微生物相关联并存在于电极110中，则电极120具有与适体104的一选择性化学相互作用的试剂112。如果电极110不具有与其相关联的适体104(因为所述病原体生物或其一部分不存在于所述样品中，且因此不存在于电极102中)，则电极110不具有所述第一官能团116，以及试剂112(即使它与电极110结合)也容易地从其解离并且不存在于电极120中。
[0182]
电极120现在可用于电化学侦测试剂112的所述存在及/或数量，如下文进一步详细描述的，指示出适体104的所述存在及/或数量，并因此指示出所述待侦测的病原体生物的所述存在及/或数量。
[0183]
根据本文所述的任何实施例中的一些，使所述电极(电极100)与所述适体(适体104)接触的步骤包括使所述电极(电极102)与所述适体本身接触，或与包含所述适体的一溶液(例如，一水溶液)接触。
[0184]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述水溶液是一缓冲溶液，并且在一些实施例中，所述缓冲溶液基本上相同于(例如，具有至少90％相同的一化学组成物)在选择所述适体时使用的所述缓冲溶液。
[0185]
在本文所述的任何实施例中的一些中，所述水溶液是一缓冲溶液，并且在一些实施例中，它是一碳酸盐缓冲溶液，以一碱性ph为特征，例如至少8ph、例如8ph至14ph、优选地从8ph至12ph、优选地从8ph至11ph、优选地从8ph至10ph、例如约9ph或约9.5ph的一ph。
[0186]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述水溶液是特征为一碱性ph的一碳酸盐缓冲溶液，如下文在相应实施例中的任一者及其任何组合中所描述的。
[0187]
一般而言，所述水溶液被选择为不干扰所述适体与所述病原体生物或其所述部分的所述结合及/或不干扰所述病原体生物或其所述部分吸附于所述电极的表面。
[0188]
在本文在包含所述适体的一水溶液的所述上下文中描述的任何实施例中的一些中，在一水溶液中的所述适体的一浓度可为约1nm至约100mm、或约100nm至约100mm、或约100nm至约10mm、或约100nm至约1mm、或约100nm至约600nm、或约1nm至约1mm、包括任何中间值及其间的数个子范围。
[0189]
根据本文所述的任何实施例中的一些，使所述电极(电极110)与参与所述电化学可侦测反应的一试剂(试剂112)接触的步骤包括使所述电极(电极110)与含有所述试剂(试剂112)的一溶液接触。
[0190]
在这些实施例的一些中，所述溶液是一水溶液，并且在一些实施例中，它是稳定试剂112的一溶液。
[0191]
在这些实施例的一些中，所述溶液是一碳酸盐缓冲溶液，并且在一些实施例中，它是特征为一碱性ph的一碳酸盐缓冲溶液，如本文在相应实施例中的任何一者中所述。
[0192]
通常，所述水溶液经选择以不干扰试剂112与所述适体的所述结合及/或所述适体与所述病原体生物或其所述部分的所述结合及/或不干扰所述病原体生物或其所述部分吸附到所述电极的表面。
[0193]
在本文在包含试剂112的一水溶液的所述上下文中描述的任何实施例中的一些中，一水溶液中的试剂112的一浓度可以在约10nm至约1m的范围内，包括任何中间值及其间的数个子范围。
[0194]
在本文在包含试剂112的一水溶液的所述上下文中描述的任何实施例中的一些中，一水溶液中的试剂112的一浓度可以在从约10ng/ml至约100mg/ml的范围内，或从约20ng/ml至约20mg/ml，或约100ng/ml至约100mg/ml，或约100ng/ml至约50mg/ml，或约1mg/ml至约50mg/ml，包括任何中间值及其间的数个子范围。
[0195]
在一些实施例中，当适体104与电极102接触时所使用的所述缓冲液相同于当试剂112与电极110接触时所使用的所述缓冲液。
[0196]
根据本文所述的任何实施例中的一些，在接触所述样品之后、及/或在接触所述适体之后、及/或在接触所述试剂112之后，洗涤了所述电极。
[0197]
在一些实施例中，在接触适体104或包含所述适体的一溶液之后、及在接触试剂112或包含其的一溶液之前，洗涤了电极110。在这些实施例的一些中，使用本文所述的用于包含适体104的相同溶液来洗涤电极110。
[0198]
此一洗涤是合乎需要的，以在所述待侦测的病原体生物或其一部分不存在于电极102中的情况下确保适体104不会保留在电极110上。
[0199]
在一些实施例中，在与试剂112或包含所述适体的一溶液接触之后、并且在其经受一电化学反应之前，洗涤了电极120。在这些实施例的一些中，使用本文所述的用于包含试剂112的相同溶液来洗涤电极120。
[0200]
此一洗涤是合乎需要的，以在适体104不存在于电极110中的情况下确保试剂112(即使其与电极120(而非适体104)中的数个基团或种类相互作用)也不会保留在电极120上，从而在所述待侦测的病原体生物或其一部分不存在于所述电极中的情况下确保试剂112不会保留在电极120上。
[0201]
因此，当电极120进行一电化学反应时，由所述反应产生的一电信号意味着电极120具有与其相关联的试剂112，这意味着电极120也具有与其相关联的适体104，这意味着电极120也具有与其相关联的所述待侦测的病原体生物体或其一部分，即这意味着含有所述待侦测的病原体生物或其一部分的所述样品。
[0202]
如果不产生电信号，则说明所述样品不含所述病原体生物或其一部分。
[0203]
如本文在任何相应实施例中描述的电极120在本文中也被称为“感测电极”，其可经受电化学测量/侦测/感测，优选地当集成在如本文中以任何方式描述的一电化学电池或一系统中时各个实施例。
[0204]
一旦产生电极120(在与试剂112或含有其的一溶液接触之后，并且例如如本文所述而任选地被洗涤)，电极120则经受如本文所述的一电化学可侦测反应。在这些实施例中的一些中，电极120可以与一电化学可侦测试剂122(未示出)接触，如本文在任何相应实施例及其任何组合中所述，优选与包含试剂122的一溶液接触，并且进行电化学测量。
[0205]“电化学反应”是指涉及参与所述反应的一或多种物质的所述电子状态的一改变
的一化学反应，即响应于电位施加而发生的数个电子的接受或捐赠。
[0206]“电化学测量”是指向将一电位到施加所述电极，并测量响应于所述电位施加的一电参数。如果响应于电位施加而发生所述电参数的一改变，则所述电化学测量指示出一电化学反应的一存在，从而指示出一电化学反应性物质的一存在。
[0207]“电化学可侦测反应”是指可以通过电化学测量所侦测到的一反应，即可以通过响应于电位施加的一电参数的一改变所侦测到的一反应，即产生及/或消耗如本文所述的一电化学反应性物质的一反应。
[0208]“电化学反应性物质”是指响应于电位施加产生(提供)数个电子或接受(消耗)数个电子的一物质。
[0209]
一电化学反应性物质通常是一氧化还原反应性物质，其响应于低于5伏、或低于3伏、或低于2伏的一电位施加而经历还原或氧化。
[0210]“电化学可侦测试剂”是指如本文所述的一电化学反应性物质或产生或消耗一电化学反应性物质的一物质。
[0211]
下文提供了关于一电化学可侦测反应及一电化学可侦测试剂的数个实施例的进一步描述。
[0212]
在一些实施例中，所述电化学反应或侦测通过以下方式实现:将如本文在各个实施例中的任何一者中描述的一感测电极(电极120)与包含一电化学可侦测试剂122的一溶液接触，并向所述感测电极施加一电位。
[0213]
在一些实施例中，所述电化学反应或侦测进一步通过以下方式实现:在向所述感测电极(电极120)施加一电位时测量一电化学参数，并且在一些实施例中，所述电化学参数是所述感测电极处产生的一电流或所述感应电极处的所述电流中的一改变。如本文所述，所述电化学参数的一存在及/或水平或所述电化学参数的所述改变指示出在所述样品中的所述病原体生物或其一部分的一存在及/或水平。
[0214]
在一些实施例中，所述感测电极形成如本文在任何相应实施例中描述的一电化学电池的一部分，或如本文以任何相应参数描述的一感测系统的一部分，以及将所述感测电极(电极120)与试剂122接触的步骤通过以下方式实现:将所述电极引入至如本文所述的一电化学电池或系统，所述电化学电池或系统在如本文所述的一溶液中包含试剂122(例如，使用包含试剂122的一电解质溶液)。
[0215]
在一些实施例中，在所述感测电极与试剂122或包含其的一溶液(例如，与包含试剂122的一电解质溶液)接触之后立即对所述感测电极施加一电位。
[0216]
在一些实施例中，所述感测电极形成如本文所述的一电化学电池的一部分并且通过在所述感测电极及一参考电极之间施加一电压来执行施加所述电位。
[0217]
在一些实施例中，所述电位是一改变的电位。
[0218]
在一些实施例中，通过伏安法来测量一电化学参数。数个伏安法测量在本领域中也称为恒电位电化学分析。
[0219]
如本领域中已知的，数个伏安法实验用于通过测量一产生的电流或响应于施加一改变的电位的所述电流的一改变来获得一分析物的信息(例如，存在、身份及/或水平)。
[0220]
为了通过恒电位电化学分析获得一分析物(例如，由所述电化学可侦测反应所产生或消耗的一氧化还原反应物质)的一定量测量，应监测用于所述分析物的所述还原/氧化
的所述电子数量。在热力学平衡中，所述电极的所述表面的所述氧化还原反应性物质的所述比率可以通过nernst方程获得：
[0221][0222]
其中co是所述氧化形式的所述浓度，cr是所述还原形式的所述浓度，e是电极电位，e0是标准电极电位，r是所述气体常数(8.314j/kmol)，t是所述温度(开尔文标度)，n是参与所述氧化还原反应的所述电子数量，以及f是所述法拉第常数(96,487库仑)。
[0223]
所述整个测量电流是由数个法拉第电流及非法拉第充电背景电流所组成。所述电化学反应得到的所述法拉第电流是根据法拉第低来表现，这意味着1摩尔的氧化还原活性物质将涉及n
×
96,487库仑的一电荷改变。
[0224]
获得了以其最简单的形式的通过伏安法实验检索到的所述信息，以作为i＝f(e)的一伏安图。
[0225]
一伏安图是一电流与电位曲线，用于描述所述分析物的所述电化学反应，所述分析物的所述电化学反应在所述电极处由于所述施加的电位及其衍生电流而发生。根据所述化学反应的所述复杂程度，它可能具有一复杂的多台阶形状。
[0226]
在一些实施例中，并且取决于所使用的伏安法的所述类型，所述电位连续地或逐步地或以脉冲方式改变。
[0227]
可施加到如本文所述的一感测电极的数个示例性电位通常在0伏至约-2伏的范围内。
[0228]
数个伏安法实验可分为线性扫描伏安法及循环伏安法。
[0229]
循环伏安法是电化学分析的所述过程，其中所述施加的电压为一多三角形或单三角形的形状。产生的所述工作电极的电流与线性三角电位扫描图称为循环伏安图，而所述工作电极的电流与所述线性电位扫描图称为线性扫描伏安图。循环伏安法通常是所述初步过程，所述初步过程用于确定一分析物的所述还原电位、所述介质的影响及所述电化学反应的所述热力学以及所述动力学。
[0230]
响应所述三角形电位，最初仅包含所述数个氧化物质的所述电化学电池的所述测量电流逐渐增加到e
p[red]
处的一尖峰，然后当所述电极表面附近的大多数物质减少时电流减小。当反转所述电位的方向时，所述相反方向的电流的一逐渐增加结束于e
p[ox]
处的一尖峰，在那里所述化学反应朝着所述氧化形式的所述相反方向进行。当与所述电极表面相邻的大多数物质被氧化时，所述电流会降低，直到电位反转，依此类推。
[0231]
由于一电化学反应位于所述工作电极及所述电解质溶液之间的所述界面处，导致所述伏安图的所述尖峰的所述数个还原及氧化物质集中到与所述电极相邻的一狭窄扩散层中。因此，所述曲线的尖峰的所述形状取决于所述扩散速率。所述尖峰的倾斜相关于所述电极表面上的数个电活性颗粒的所述浓度，而所述急剧下降仅取决于时间，并且由于有限扩散而导致所述表面附近不存在数个电活性颗粒。
[0232]
为了提高数个伏安测量的所述灵敏度，可以以牺牲所述非法拉第背景电流为代价来增加所述获得的伏安图中的所述法拉第电流的所述份额。通过在称为“脉冲伏安法”的一技术中施加一系列短持续时间的数个电位阶跃(每个持续几毫秒)，可以实现此数个改变。
在每个电位阶跃结束时，会获得两种不同的电流衰减率：急剧指数衰减至一可忽略的水平是所述充电电流的特征，而较慢的衰减则是所述法拉第电流的典型特征。通过在后期记录所述电流的信号，更多的所述信号归因于所述法拉第电流，而所述充电电流的所述贡献可以忽略不计。所述差分脉冲伏安图是从所述脉冲关闭后获得的所述电流中减去所述预脉冲电流获得的，绘制在所述施加的电位上。所述相应的灵敏度由此增加。所述数个差分脉冲伏安法技术因所述施加的电位波形的所述形状及所述电流采样技术而不同。
[0233]
除了提高的灵敏度之外，差分脉冲伏安法还可以通过根据参与其氧化还原反应的所述电子数量分析所述尖峰的宽度来侦测具有数个相似氧化还原电位的两种不同分析物。用于数个差分伏安法测量的数个示例性数值为25mv至50mv的电流脉冲幅度及5mv/秒的扫描速率，同时也考虑数个更陡峭的幅度及数个更快的扫描速率。
[0234]
在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，所述电位是一差分脉冲改变电位。
[0235]
在本文所述的任何实施例中的一些中，在如本文所述的一方法中测量的一电化学参数是与所述施加的电位的一导数相比的电流的一改变，但考虑任何其他伏安图。
[0236]
在本文所述的任何实施例中的一些中，所述测量的电化学参数由一信号处理器处理，如本文在相应实施例中的任何一者中所述，从而在所述样品中确定所述待侦测的病原体生物的一存在及/或水平(数量)。
[0237]
在本文所述的任何实施例中的一些中，所述方法进一步包括，在所述感测电极与试剂122或包含其的一溶液(例如，电解质)接触之前，当与试剂122或包含其的一溶液接触时测量一电化学参数(如本文所述的电极100)，或测量一电化学参数(如本文所述的电极120)且其中所述电化学参数产生于使电极100与不含一病原体生物的一样品接触时。优选地，电极100经历产生电极102的所述数个步骤，例如接触与一液体样品相同但不具有一病原体生物的液体，或接触与一固体或气体样品相同但不具有一病原体生物的空气，以及随后电极102经历数个相同的顺序步骤以提供电极120。对于以上选项中的每一个，所述数个电化学参数测量的所述测量一背景或控制信号，其由不具有吸附于其的所述病原体生物或其所述部分的电极所提供。在一些实施例中，在测量由接触感测电极120及所述样品产生的所述电化学参数时，从所述测量的电化学参数中减去所述背景信号。
[0238]
在本文所述的任何实施例中的一些实施例中，所述方法还包括在测量所述电化学参数之后，向所述感测电极施加一相反的电位，从而再生所述电极。
[0239]
在经历所述电化学反应后，电极120可被洗涤并再次与试剂122或包含其的一溶液(例如，与包含试剂122的一电解质溶液)接触。
[0240]
如果所述电化学反应导致不具有迹象指示出所述待侦测的病原体生物的一存在，则所述电极可以重新用作电极100，并反复接触一不同的样品，直到获得对所述病原体生物的一阳性侦测。
[0241]
电极:
[0242]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极(例如，如本文所述的电极100)是一气体透性电极，例如一气体透性电极。
[0243]
根据本文所述的任何实施例中的一些，使所述电极(例如，如本文所述的电极100)与所述样品接触的步骤是通过对如本文所述的所述样品或一基质周围的一环境抽气。
[0244]
根据在此描述的任何实施例中的一些，所述电极(例如，如在此描述的电极100)是
一空气体透性电极电极，以及所述电极与所述样品接触的步骤是通过对本文所述的所述样品或一基质周围的一环境抽气。
[0245]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极以一高表面积为特征。在一些实施例中，所述电极是一多孔电极。
[0246]
在一些实施例中，所述电极包括一高表面积导电或半导电基质(包括例如数个碳多孔基质及数个金属3d多孔基质)。
[0247]
在一些实施例中，所述导电(或半导电)基质与数个纳米结构(例如，数个纳米线、数个纳米颗粒及/或数个纳米管)相关联，以形成数个超大面积导电复合电极。
[0248]
在一些实施例中，所述导电(或半导电)基质包含可充当一化学受体/吸附层的生物分子或聚合物种类，以增加所述感测电极的所述数个吸附特性，并增加所述病原体生物体及其所述部分从所述测试样品吸附到所述电极。
[0249]
在一些实施例中，所述电极包括一碳纳米多孔3d基质。在一些实施例中，所述电极具有与其连接的数个功能部分，所述数个功能部分可以提高所述电极的所述吸附能力。例如，带有数个正电荷基团(如数个胺)的数个部分接附到所述电极上。
[0250]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极以数个官能团为特征，所述数个官能团能够与如本文定义的所述病原体生物或其所述部分相互作用。
[0251]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述数个官能团是带正电荷的数个基团，例如数个胺基团。此数个胺基团可以与所述病原体生物或其所述部分的一表面上存在的带负电荷的数个基团发生化学相互作用。
[0252]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述数个官能团共价地接附到所述电极的所述表面的至少一部分。
[0253]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电极是一可商购的电极或一客制的电极。在任何情况下，所述电极本身可使用或可在用于本文所述的所述数个方法之前进行预处理。
[0254]
此一预处理可以包括例如通过使用一有机及/或水性溶剂洗涤所述电极的方式来清洁所述电极，使所述电极经受等离子体处理及/或化学修饰所述电极以在其表面上形成数个官能团，例如本文所述的用于促进或改善与所述病原体生物或其所述部分的相互作用的数个官能团。
[0255]
根据本发明的任何实施例中的一些，所述电极以至少一纳米级或微米级尺寸为特征。
[0256]“微米级尺寸”是指电极的至少一尺寸小于1mm，或在0.1微米至900微米的范围内。
[0257]“纳米级尺寸”是指电极的至少一尺寸小于1微米，或在0.1纳米至900纳米的范围内。
[0258]
所述纳米级或微米级尺寸取决于所述电极的所述形状。如果一电极通常成形为一圆柱体，则至少一维度可以是所述电极的一长度及一直径的一者或两者。如果所述电极通常成形为一矩形，则至少一维度可以是所述电极的一长度及一宽度中的一者或多者。
[0259]
以一或多个微米级或纳米级尺寸为特征的数个电极在本文及本领域中也称为数个微电极。
[0260]
根据本发明的一些实施例，所述电极是一碳电极。
by exponential enrichment，selex)的一体外工艺所人工地产生的；参见图17。
[0280]
与依赖于一动物免疫系统诱导的数个抗体的所述制备不同，所述selex工艺能够为非免疫原性及数个毒性靶标制造数个适体，否则所述免疫系统无法获得这些靶标。此外，还可以针对数个靶标的数个特定区域产生数个适体，这对于数个抗体而言有时是困难的，因为所述动物免疫系统固有地包含数个靶分子上的数个表位。
[0281]
数个适体可分为数个寡核苷酸适体及数个肽适体。所述数个寡核苷酸适体包括dna或rna或xna适体，通常由短链寡核苷酸组成；所述数个肽适体，通常由一个(或多个)短可变肽域组成，两端连接到一蛋白质支架上。
[0282]
数个适体通常对其目标表现出高选择性及亲和力。数个适体与其数个分子靶标之间的所述数个相互作用通常为非常特异性的，以至于即使所述靶分子中的数个微小改变也可能破坏数个适体结合能力。除了这种高选择性之外，数个适体还可以高亲和力结合其数个靶标，尤其是数个大分子(例如数个蛋白质)，这些大分子通常具有从皮摩尔(picomolar)到纳摩尔(nanomolar)的非常低的解离常数(kd)。
[0283]
目前可用的数个适体对一广泛范围的数个靶标具有高亲和力，包括数个金属离子(例如k

、hg
2
及pb
2
)、数个有机小分子(例如数个氨基酸、atp、数个抗生素、数个维生素及可卡因)、数个有机染料、数个胜肽及数个蛋白质(例如凝血酶、数个生长因子及数个hiv相关肽)及数个全细胞或数个微生物(例如细菌)。
[0284]
在本实施例的感测方法中使用数个适体具有以下优点：
[0285]
对于任何给定的靶标，从数个小分子到数个大蛋白质及数个细胞，原则上可以在体外选择具有高特异性及亲和力的数个适体，从而使开发一广泛范围的基于适体的数个感测分子成为可能；
[0286]
数个适体一旦被选中，就可以从商业来源以高重现性及纯度合成，并且通常具有化学稳定性；及
[0287]
数个适体在结合靶标时通常会发生显着的数个构象改变(conformational changes)，这有助于提高侦测灵敏度及选择性。
[0288]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法进一步包括选择及/或鉴定一适体(适体104)，所述适体(适体104)选择性地结合到所述待侦测的病原体生物。根据这些实施例中的一些，这可以使用本领域已知的所述selex方法来完成，并且如背景技术图17中示意性呈现的，以及由使用所述待侦测的病原体生物的以下所述数个范例部分的范例7中举例说明。或者，适体104可以是已知选择性地结合到所述待侦测的病原体生物的一可商购适体，或者可以是一合成或以其他方式制备的适体，基于关于其化学组成(例如，数个氨基酸或核苷酸序列)的可取得信息。
[0289]
在任何情况下，在执行或设计侦测一选择的病原体生物的一方法之前，进行选择性地结合到所选生物的一合适适体的鉴定。
[0290]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述适体(适体104)可以是一胜肽、一蛋白质、一寡核苷酸或一多核苷酸。
[0291]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述适体(适体104)是一寡核苷酸或一多核苷酸。
[0292]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述适体(适体104)是包含10个至400个、或
10个至200个、或10个至100个核苷酸的数个寡核苷酸，包括其间的任何中间值及其间的数个子范围。
[0293]
一旦选择了一适体，所述方法优选地进一步包括以下步骤:与其共轭，或在其中产生如本文在任何相应实施例中所述的一第一官能团(官能团116)。这可以通过数个简单的化学合成途径来完成，取决于所选择的所述官能团116。
[0294]
在一些实施例中，所述第一官能团是生物素并且所述生物素与一寡核苷酸适体的共轭通过将所述生物素藕接至所述适体的5'或3'末端(优选所述5'末端)来进行。
[0295]
如以下所述数个范例部分所述，所述selex方法成功地用于揭示可用于确定一大豆锈菌(特别是本文所述的phakopsora夏孢子)的一存在及/或数量的一方法中的数个适体。
[0296]
根据本发明的一些实施例，提供了一种适体，所述适体选择性地结合到或能够选择性地结合到如本文在任何相应实施例中描述的一大豆锈菌(例如，phakopsora夏孢子)。当如本文所述的方法用于确定如本文在任何相应实施例中所述的一大豆锈菌的一存在及/或数量时，此一适体可用作如本文在任何相应实施例中所述的一适体104。
[0297]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体包含至少一富含g的区域，即其中超过50％、或超过60％、或超过70％、或超过80％的所述数个核碱基是鸟嘌呤(g)核碱基的至少一区域。
[0298]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体以一g-四链体二级结构为特征。
[0299]
一g-四链体二级结构通常在富含g的数个寡核苷酸中形成。所述寡核苷酸或其富含g的区域呈螺旋状，包含可形成一条或多条链的数个鸟嘌呤四分体。一示例性g-四链体结构示于图19。
[0300]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体在其富含g的区域中包含如表3中所示的一核苷酸序列，所述核苷酸序列是选自seq id no:21至31的一序列。
[0301]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体包含或具有选自表1、2及4中呈现的那些的一核苷酸/核碱基序列，即，选自seq id nos:1至7、8至18及32至37。
[0302]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体包含或具有选自表2及4中呈现的那些的一核苷酸/核碱基序列，即，选自seq id nos:8至18及32至37。
[0303]
根据本文在所述适体的上下文中描述的任何实施例中的一些，所述适体包含或具有如seq id no：17中所示的一核苷酸/核碱基序列。
[0304]
根据这些实施例中的一些实施例，所述适体进一步包含如seq id no：37所示的一核苷酸/核碱基序列。
[0305]
根据本文针对选择性地结合到或能够选择性地结合到一大豆锈菌的一适体的一些实施例中的一些，所述适体进一步包含如本文所述的一第一官能团(官能团116)，以及所述官能团接附到其5'或3'端，优选接附到其5'端。
[0306]
在这些实施例的一些中，所述第一官能团(官能团116)是生物素或亲和素或链亲
和素，并且在这些实施例的一些中，它是生物素。
[0307]
电化学可侦测反应及数个试剂：
[0308]
如上所述，感测电极120包括参与一电化学可侦测反应的一试剂112。
[0309]“参与一电化学可侦测反应的试剂”是指参与以电化学方式侦测的一反应的一试剂，即通过测量一电参数来侦测，或一电参数的一改变是响应于电位施加，其中所述电参数是涉及数个电子的一化学反应的一结果(例如，一化学物质的还原及/或氧化)。
[0310]
试剂112以这样一种方式参与一电化学可侦测反应，即所述测量的电参数或所述电参数的改变指示出试剂112的所述存在及/或数量。试剂112可以是所述电化学反应中的一反应物，或者可以是在所述电化学反应中产生一反应物的一反应中的反应物。
[0311]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学可侦测反应产生一电化学可侦测物质。
[0312]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学可侦测反应中的一反应物是一电化学可侦测物质，即，所述电化学可侦测反应消耗了一电化学可侦测物质。
[0313]
因此，所述电化学可侦测反应可以产生可电化学侦测的一物质(反应产物)及/或使用可电化学侦测的一反应物。监测所述反应的步骤可以通过监测对应于所述产生的产物及/或所述消耗的反应物的一电信号来实现。
[0314]
所述根据本文所述的任何实施例中的一些，参与所述电化学可侦测反应的所述试剂是促进反应的一试剂，使得在不存在所述试剂的情况下，所述反应不发生或以一低速率或产率发生。根据这些实施例中的一些，使电极120进行所述反应的步骤包括使所述电极120与包含参与所述电化学可侦测反应的一反应物的一电解质溶液接触，并且任选地向所述电极施加电位。
[0315]
根据本文所述的任何实施例中的一些，参与所述电化学可侦测反应的所述试剂(试剂112)是催化或激活所述反应的一试剂，使得在不存在所述试剂的情况下，所述反应不可能发生。
[0316]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学可侦测反应是一酶催化反应以及所述电化学可侦测试剂是所述反应的一基质及/或所述反应的一产物。根据这些实施例中的一些，参与所述电化学可侦测反应的所述试剂(试剂112)是催化一反应的一酶，所述反应产生及/或生成一电化学反应性物质。
[0317]
考虑了选择性催化一反应的任何酶，如本文所定义的用作一基质的一电化学反应基质(例如一氧化还原反应性物质或化合物)，及/或如本文所定义的产生作为一产物的一电化学反应性物质(例如，一氧化还原反应性物质或化合物)。
[0318]
数个示例性氧化还原反应性物质或数个化合物是具有一或多个硝基(可以还原成胺)的数个化合物、具有一或多个胺基(可以氧化成硝基)的数个化合物、具有一或多个羟基及/或醛基(可氧化为数个羧酸盐)的数个化合物、具有一或多个过氧化物基团的数个化合物(可还原或分解为含羟基的数个化合物)等。
[0319]
根据与试剂112有关的一些本发明实施例的数个合适酶，因此可以包括使用一氧化还原反应性物质作为数个基质及/或在所述酶促反应中产生一或多种这样的氧化还原反应性物质的数个酶。
[0320]
在数个示例性实施例中，所述酶催化了一反应，所述反应中产生一含硝基化合物
及/或所述反应中的一含硝基化合物是所述基质。一含硝基化合物是包含一或多个硝基的一化合物。
[0321]
在数个示例性实施例中，所述酶催化了一反应，所述反应中产生一含过氧化物化合物及/或所述反应中的一含过氧化物化合物是所述基质。一含过氧化物化合物是包含一或多个含过氧化物(-o-o-)的数个部分或数个基团的一化合物。
[0322]
数个示例性酶包括但不限于数个磷酸酶，其能够水解含磷酸盐的数个化合物。在数个示例性实施例中，所述磷酸酶能够催化一磷酸酯的水解至一相应的醇，从而使所述磷酸酯及所述相应的醇具有一或多个如本文所述的数个氧化还原反应性基团，例如一或多个硝基。在这种情况下，所述酶促反应的所述基质及所述产物都是电化学可侦测的。
[0323]
根据本文所述的任何实施例中的一些，试剂112是一磷酸酶。
[0324]
根据这些实施例中的一些，试剂122是所述磷酸酶的一基质，例如一含硝基磷酸盐，例如但不限于一含硝基苯基磷酸盐，例如对硝基苯基磷酸盐。此一试剂122本身为可电化学侦测的，并且在一合适的磷酸酶存在下也产生一含硝基化合物，例如对硝基苯酚，其也为可电化学侦测的。
[0325]
所述磷酸酶可以是所述ec 3.1.3(磷酸单酯水解酶)、ec 3.1.4(磷酸二酯水解酶)及ec 3.1.4(磷酸三酯水解酶)中的任何磷酸酶，以及对于这些类别中的每一个，它可以是一碱性磷酸酶(例如ec 3.1.3.1类别)或一酸性磷酸酶(例如ec 3.1.3.2类别)。
[0326]
在数个示例性实施例中，所述磷酸酶是一碱性磷酸酶，其能够在碱性条件下催化磷酸盐的水解，例如ec 3.1.3.1类别。
[0327]
在数个示例性实施例中，所述磷酸酶是喔酸性磷酸酶，其能够在酸性条件下催化磷酸盐的水解，例如ec 3.1.3.2类别。
[0328]
在数个示例性实施例中，试剂112是一碱性磷酸酶或一酸性磷酸酶，以及试剂122是一含硝基磷酸盐，例如磷酸硝基苯酯(例如对硝基苯(pnp)磷酸酯)。在这样的实施例中，试剂122是所述磷酸酶的一基质，例如一含硝基磷酸盐。
[0329]
根据这些实施例的所述电化学可侦测反应是所述磷酸酶对所述磷酸盐的一催化水解，以及所述电化学可侦测试剂122是所述磷酸酶的所述基质及/或所述水解的所述产物。
[0330]
数个示例性酶包括但不限于数个半乳糖苷酶，其能够水解在一半乳糖及一有机部分之间形成的一糖苷键。在数个示例性实施例中，所述半乳糖苷酶能够催化一基质的水解以提供一半乳糖及一相应的醇，从而使所述半乳糖及/或所述相应的醇具有一或多个如本文所述的数个氧化还原反应性基团，例如，一或多个硝基。
[0331]
根据本文所述的任何实施例中的一些，试剂112是一半乳糖苷酶。
[0332]
根据这些实施例中的一些，试剂122是所述半乳糖苷酶的一基质，例如一含硝基糖苷，例如但不限于一含硝基苯基的糖苷，例如含对硝基苯基(pnp)的糖苷。
[0333]
此一试剂122本身为可电化学侦测的，并且在一合适的半乳糖苷酶存在下也产生一含硝基醇(例如对硝基苯酚)，其也为可电化学侦测的。
[0334]
所述半乳糖苷酶可以是所述ec 3.2.1.23类别的一β-半乳糖苷酶的所述ec 3.2.1.22类别的一α-半乳糖苷酶。
[0335]
根据数个示例性实施例，试剂112是如本文所述的一β-半乳糖苷酶，以及试剂122
是所述β-半乳糖苷酶的一基质，其具有一或多个氧化还原反应性基团，例如一或多个硝基。一示例性此类基质是含硝基的吡喃葡萄糖苷(例如，pnp-β-d-吡喃葡萄糖苷)。
[0336]
类似地，所述酶可以是所述ec 3.2.1类别的任何其他葡糖苷酶，只要它能够催化产生如本文所述的一氧化还原反应性物质的一反应。
[0337]
在数个示例性实施例中，试剂112是一β-葡糖苷酶以及试剂122是一含硝基吡喃葡萄糖苷(例如，pnp-β-d-吡喃葡萄糖苷)。
[0338]
根据这些实施例的所述电化学可侦测反应是所述β-葡糖苷酶对所述吡喃葡萄糖苷的一催化水解，并且所述电化学可侦测试剂122是所述β-葡糖苷酶的所述基质及/或所述水解的所述产物。
[0339]
可分别用作试剂112及122的另外的数个示例性酶-基质对包括但不限于分别为几丁质酶及pnp-n-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖；及纤维二糖水解酶及pnp-β-d-纤维二糖苷。
[0340]
根据本文提供的指导，可以考虑使用一电化学反应性基质及/或产生一电化学反应性催化产物的任何其他酶。
[0341]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电化学反应(例如，一酶催化反应)产生一氧化还原反应性物质，作为一电化学可检测物质。
[0342]
示例性方法：
[0343]
下面描述根据本实施例中的一些的一示例性方法。
[0344]
根据这些示例性实施例的所述方法用于确定如本文在任何相应实施例中所述的一大豆锈菌的一存在及/或数量。
[0345]
在一示例性方法中，电极100是一碳电极，优选为一空气体透性电极碳纤维电极，例如一碳纤维微电极，例如一碳纸微电极，如本文在相应实施例中的任一个中所述。
[0346]
电极100与怀疑含有一大豆锈菌的一样品接触，如本文在任何相应实施例中所述。接触的步骤是通过对所述样品(例如怀疑被一大豆锈菌感染的一基质的一环境)抽气来进行的，从而提供所述相应的电极102。
[0347]
然后将电极102与一适体(适体104)接触，所述适体是一富含g的寡核苷酸，优选地具有一g-四链体二级结构，以提供电极110。
[0348]
在数个示例性实施例中，适体104具有如seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、32、33、34、35或36所示的一核苷酸序列。
[0349]
在数个示例性实施例中，适体104具有如seq id no:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、32、33、34、35或36中所示的一核苷酸序列。
[0350]
在数个示例性实施例中，适体104包含如seq id no:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31中所示的一核苷酸序列。
[0351]
在数个示例性实施例中，适体104具有如seq id no:17中所示的一核碱基序列。
[0352]
使电极102与适体104接触的步骤可以通过使电极102与根据这些实施例中的任一个的适体104的一溶液接触来进行，例如在一碱性碳酸盐缓冲液中，如本文在各个实施例中的任一个中所述。
[0353]
任选地，在所述接触的步骤之后，使用一溶液(例如本文所述的一碱性碳酸盐缓冲液或任何其他水溶液)来洗涤电极110。
[0354]
电极110此后与一碱性磷酸酶接触，如本文在任何相应实施例中所述，作为试剂
112，从而提供所述相应的电极120。
[0355]
任选地，在所述接触的步骤之后，使用一溶液(例如本文所述的一碱性碳酸盐缓冲液或任何其他水溶液)来洗涤电极120。
[0356]
电极120然后通过与包含所述碱性磷酸酶的一基质的一溶液(例如，如本文在任何相应实施例中所述的一电解质)接触而经受电化学反应，所述碱性磷酸酶的所述基质包含一氧化还原反应性基团，作为试剂122。在一实施例中，试剂122是一对硝基磷酸盐(para-nitro phosphate)。
[0357]
所述电化学反应优选在组装电极120时进行并且包含试剂122的所述电解质溶液是本文所述的一电化学电池或一系统，将电压施加到电极120并且测量一电化学参数(例如，电流)并优选地与如本文所述的一背景测量进行比较。一电流的所述产生指示出所述样品中的所述大豆锈菌的所述存在。在数个示例性实施例中，所述电化学参数通过如本文在各个实施例中的任一个中描述的伏安法进行测量。
[0358]
根据所述示例性方法的任何实施例中的一些，包含试剂122的所述电解质溶液包括一碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液以如本文在相应实施例中的任一个中所述的一碱性ph(例如，从8ph到10ph，或从9ph到10ph，例如9ph或9.5ph)为特征。
[0359]
根据这些实施例中的一些，所述碳酸盐缓冲溶液如下文及随后的所述数个范例部分中进一步详细描述。
[0360]
根据这些实施例中的一些，所述碳酸盐缓冲溶液也用于包含适体104或试剂112的所述数个溶液中，并且用于在接触这些溶液时及在所述电化学反应之后洗涤所述电极。
[0361]
电化学电池及系统：
[0362]
在本文所述的任何实施例的一些中，本文所述的感测电极(电极120)可用于在将所述电极集成到一电化学电池中时确定一样品中的一病原体生物的一存在及/或水平。
[0363]
在本发明的一些实施例中，提供了一种电化学电池，所述电化学电池包括如本文在各个实施例中的任一个及其任何组合中所描述的一感测电极。所述感测电极用作一工作电极，并且在本文中也称为工作电极。
[0364]
在本发明的一些实施例中，提供了一种感测系统，所述感测系统包括如本文在相应实施例中的任一个及其任何组合中所描述的一电化学电池。
[0365]
下面描述本发明的一电化学电池的一些实施例。
[0366]
在一些实施例中，所述感测电极可电连接至一电源，如本文所述，并且所述电池配置成使得当其运行时其至少一部分与包含如任何相应的实施例中所述的试剂122的一溶液(一电解质溶液)接触。
[0367]
在本发明的一些实施例中，所述电化学电池还包括一参考电极。任何可商购的或通常设计的参考电极都被考虑在内。在一些实施例中，所述参考电极是一水性参考电极。示例性可用参考电极包括但不限于银/氯化银电极(例如，ag/agcl/饱和kcl电极，例如由metrohm销售)、一标准甘汞(例如饱和甘汞)电极(sce)、一标准氢电极(she)、一普通氢电极(nhe)、一可逆氢电极(rhe)、一硫酸铜铜(ii)电极(cse)；一ph电极；一钯-氢电极、一动态氢电极(dhe)及一汞-硫酸汞电极(mse)。
[0368]
所述参考电极也可电连接到一电源，并且所述电池配置成使得当其运行时在所述感测电极及所述参考电极之间施加一电位差(电压)。
[0369]
在一些实施例中，电化学电池遵循一三电极设计并且还包括一辅助电极。优选但非必须地，所述辅助电极是一铂电极。任何其他可商购的或通常设计的辅助电极都被考虑在内。数个非限制性范例包括数个金电极、数个碳电极及数个碳/金电极。
[0370]
在一些实施例中，所述辅助电极可电连接至所述感测电极，例如数个导电线连接所述数个电极。
[0371]
在一些实施例中，所述电化学电池还包括测量在所述感测电极处产生的一电流的一装置，所述电流是在所述感测电极的一表面处或附近发生的数个氧化还原反应的一结果。在一些实施例中，所述装置(例如，一电流计、一皮表)可电连接到所述辅助电极及所述感测电极。
[0372]
根据本发明的一些实施例的一双电极电化学电池10的一示例性组件的一示意图示于图25中。
[0373]
电化学电池10包括一感测电极120，所述感测电极120如本文所述的用作一工作电极。当所述电池运行时，电极120应与包含试剂122的一电解质18接触。感测电极120是电化学电池10的一半。一参考电极22是电池10的所述另一半。一电源20是通过数个电线24电可连接或连接到感测电极120及参考电极22。一电源20配置成在感测电极120及参考电极22之间施加电压。可选地但不是必须的，电池10还包括一辅助电极(未绘示)及一电流测量装置28，并且装置28可电连接或连接到感测电极120及辅助电极26。
[0374]
为了使一电化学电池(例如，电池10)运行，至少所述感测电极(电极120)应与一电解质(如图25所示的一电解质18)接触。所述电化学电池(例如，电池10)可以包括一电解质(例如，电解质18，如图25中举例说明)，或者可以包括数个装置(例如，一入口；未绘示于图25中)，用于将所述电解质引入至所述电池，以至少接触所述感测电极(例如，感测电极120)。
[0375]
根据本实施例的电化学电池可以遵循本领域已知的任何设计，并且可以包括一或多个感测电极，以及可以包括一参考电极及/或一辅助电极的一者或多者。数个范例性设计包括但不限于旋转数个圆盘环电极、数个超微电极或数个丝网印刷电极。
[0376]
如图25所示的电化学电池10的所述数个组件的所述配置仅用于说明目的，不应被视为以任何方式进行限制。
[0377]
电化学电池10可以是例如一覆盖玻璃(或其他惰性材料如特氟隆或石英)烧杯的一形式，包含了所述三个电极浸入其中的所述样品溶液。在一些实施例中，电化学电池10是一微电池或一薄层电池。
[0378]
电化学电池10还可包括用于混合/搅拌电解质18及试剂122的数个装置(图25中未示出)。
[0379]
电化学电池10还可包括用于监测及/或控制所述电池内部温度的数个装置(图25中未示出)。
[0380]
如本文及本领域所使用的，一电解质是一导电材料或介质。一电解质可以是固体或流体，并且可以本身使用或当溶解在一极性溶剂中时使用，例如水。当溶解是一溶剂时，它被称为一电解质溶液。在数个电化学电池的上下文中，一电解质也称为一背景溶液。
[0381]
在本文全文中，术语“电解质”还包括一“电解质溶液”。
[0382]
在如本文所述的一电化学电池(例如，电池10，图25)中，当所述电池运行时，至少
所述感测电极(例如，感测电极120)与所述电解质(例如，电解质18)接触。在一些实施例中，当所述电池运行时，所有电极都与一电解质(例如，电解质18)接触。在一些实施例中，所有电极都与相同的电解质接触，如图25所举例说明，并且在一些实施例中，一或多个电极与一电解质接触，所述电解质不同于与感测电极接触的所述电解质，并且一薄膜插入在所述数个不同的电解质之间。
[0383]
根据本文所述的任何实施例中的一些，选择了所述电解质溶液(例如，电解质18)以不干扰试剂112与所述适体(适体104)及/或所述适体(适体104)的所述接附到所述生物或其所述部分及/或所述生物或其所述部分到所述电极。
[0384]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电解质溶液包含适合于进行所述电化学可侦测反应的一缓冲液。例如，如果试剂122是一酶，则所述电解质溶液包括一缓冲液或任何其他溶液，其特征在于能够进行酶催化的一ph值。类似地，所述电解质溶液不与试剂122反应或影响试剂122的所述稳定性。
[0385]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电解质溶液包含以一碱性ph为特征的一缓冲液。
[0386]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述电解质溶液包含一碳酸盐缓冲剂，并且在一些实施例中包含以一碱性ph为特征的一碳酸盐缓冲剂。可以考虑为所述电化学反应提供一合适的ph值的任何其他缓冲溶液。提供如本文所述的一所需ph的数个缓冲溶液是本领域技术人员公知的。
[0387]
根据本文所述的任何实施例中的一些，试剂112是一碱性磷酸酶并且所述电解质溶液包含一碳酸盐缓冲液，并且在一些实施例中包含如本文所述的以碱性ph为特征的一碳酸盐缓冲液。
[0388]
根据数个示例性实施例，电解质18包括碳酸氢钠及碳酸钠、氯化钠及/或氯化钾及氯化镁的一混合物(例如，作为一六水合物)，并且可以进一步任选地包括一表面活性剂(例如，一表面活性剂)。
[0389]
所述碳酸钠及所述碳酸氢钠可以具有一摩尔比，所述摩尔比从10:1至1:10、或从5:1至1:5、或从2:1至1:2、或约1:1，取决于所述期望的ph，并且各自可以处于0.01mol/l至0.5mol/l范围内的一浓度，例如0.1mol/l。
[0390]
所述数个离子盐(例如钠及/或钾及/或镁的数个氯化物盐)的每一个的一浓度可以在0.001mol/l至0.05mol/l的范围内。优选地选择了所述数个离子盐的所述浓度，使得这些离子不干扰试剂112及适体104及/或适体104与病原体生物或其部分，及/或后者与电极之间的相互作用，不干扰电化学反应，但提供适合电化学反应的离子强度。在数个示例性实施例中，一氯化钠/氯化钾及氯化镁的一摩尔比在从5:1至1:5的范围内并且例如为约2:1。
[0391]
在随后的所述数个范例部分中描述了可用作一电解质18的一示例性碳酸盐缓冲液。
[0392]
在本文所述的任何实施例中的一些中，一电化学电池或包含如本文所述的电化学电池的一感测系统可通过以下步骤来运行:组装至少如本文所述的一感测电极及如本文所述的包含试剂122的一电解质以及用于将所述感测电极电连接到一电源的数个电装置；将所述感应电极与含有试剂122的所述电解质溶液接触；通过如本文所述的一电源向所述感测电极施加一电位；并且测量一电化学信号，所述电化学信号指示出试剂112所参与的一电
化学反应。在一些实施例中，所述电化学信号是在所述感测电极处产生的响应于所述电位的一电流，并且测量所述信号是通过一电流测量装置实现的。所述测量的电流指示出电极120中的试剂122的一存在及/或水平(例如，数量、浓度)，其指示出电极120中的适体104的一存在及/或水平，其指示出所述病原体生物或其一部分的一存在及/或水平。
[0393]
在一些实施例中，所述电化学电池包括一参考电极，以及施加一电位的步骤通过在所述感测电极及所述参考电极之间施加电压来实现。
[0394]
在与所述感测方法相关的数个实施例中，如下文中进一步详细描述的，所述电源配置成为根据任何已知的伏安法向感测电极施加电位。
[0395]
在一些实施例中，所述电源配置成为向所述感测电极施加一改变的电位，如本文在相应实施例中的任一个中所描述的。
[0396]
在一些实施例中，所述系统或电化学电池配置成为确定响应于所述改变的电位产生的一电流，并且在一些实施例中，所述系统或电化学电池配置成为确定响应于所述改变的电位的所述感测电极处产生的所述电流的一改变。
[0397]
在本文所述的任何实施例中的一些中，所述系统或电化学电池配置成当电极100与不含所述待侦测的病原体生物的一样品接触时，响应于所述改变的电位与一电流或所述感测电极处产生的所述电流的一改变相比来确定一电流或一电流的一改变。这种数据在本文中也被称为“背景电流”或“背景测量”，并且在一些实施例中，所述系统配置成为从所述确定的电流或电流改变中减去所述背景电流或测量。
[0398]
通常，但不一定，所述系统或电化学电池配置成为提供一伏安图，所述伏安图呈现与所使用的伏安法方法一致的数个数值。
[0399]
根据各个实施例中的任一个，确定所述电流的一改变的步骤可以通过配置成为处理接收到的数个信号(例如，所述施加的改变电位的所述模式及相应的产生的电流数据)的一装置来执行，以根据需要提供一数值或一组数值(例如，与所述施加电位或任何其他伏安图的一导数相对的电流的一改变)。此一装置在本文中也被称为一信号处理器。
[0400]
在一些实施例中，所述信号处理器是一数据处理器，例如配置成用于接收及分析信号的一计算机。所述信号处理器从每个产生的信号或信号组中提取一参数(例如一伏安图)，所述参数指示出所述电化学反应，并因此指示出试剂112的一存在及/或水平，并因此指示出在此处的所述病原体生物的一存在及/或水平。
[0401]
在本发明的一些实施例中，所述信号处理器配置成为构建试剂112的一指迹，例如，在将包含试剂122的一电解质18与电极120接触并施加一改变电位的一特定模式(例如，一差分脉冲电位)后获得的一伏安图。
[0402]
在本发明的任何实施例中的一些实施例中，所述信号处理器配置成为通过访问及/或处理相关数据来确定电极120中的一已识别的试剂112的一水平。这样的数据可以包括，例如一校准曲线，例如数个伏安图或在数个伏安测量中获得的数个特定数值(例如，一还原峰)的一校准曲线，针对数个不同浓度的试剂112获得并存储在一计算机可读介质上。例如，所述信号处理器可以访问所述校准曲线，搜索在操作所述系统获得的所述数值相匹配的一数值(例如，一浓度)，并识别与所述数值相匹配的所述已识别的试剂112的一浓度。替代地或另外地，所述数据包括存储在一计算机可读介质上的一查找表，所述查找表可以搜索数个数值，所述数个数值与所述测量数值匹配并且指示出一识别的试剂112的一水平。
进一步替代地或另外地，所述数据包括所述测量的数值及所述识别的试剂112的一水平之间的一预确定关系。例如，如果此一预确定关系包括一线性关系，则所述信号处理器可以基于所述预确定关系的外推法来确定一识别的试剂112的所述水平。
[0403]
进一步替代地或另外地，所述数据包括存储在一计算机可读介质上的一查找表，其可以搜索数个数值，所述数个数值与所述测量的数值匹配并且指示出适体104的一水平。另外替代地或另外地，所述数据包括所述测量的数值与接附于适体104的所述病原体生物或其一部分的一水平之间的一预确定关系。
[0404]
一旦获得了试剂112的所述存在及/或数量、或所述样品中的所述病原体生物的所述存在及/或数量，就可以将其传输到一远程位置。还考虑将所述反应产生的所述电信号传输到一远程位置的数个实施例，在所述远程位置处可以对其进行分析以确定所述病原体生物的所述存在及/或数量。所述电信号可以作为一原始信号传输，也可以在所述传输之前进行处理。例如，在一些实施例中，所述信号在发送之前被数位化以提供一数位信号，其中所述传输的信号是所述数位信号。
[0405]
适用于侦测一基质中及/或一基质上的所述病原体生物的所述存在、数量及/或类型的一系统130示意性地绘示于图123中。系统130通常包括一侦测系统180，所述侦测系统180配置成准备所述感测电极120以用于如本文所述的电化学反应，然后执行所述电化学反应并获得所述信号。例如，侦测系统180可以包括准备用于如本文在相应实施例中的任一个中所描述的所述反应的所述感测电极120的一准备系统148以及执行所述电化学反应并获得所述信号的一电化学系统146。
[0406]
制备系统148可以自动地将所述样品与电极100接触。例如，系统148可以包括一空气采样器(未示出；参见例如图2a至图2b)，其产生包含所述样品或一基质周围的一环境的所述样品的一空气流，如本文所述在所述电极(电极100)的所述方向上。系统148可以另外包括容纳所述适体的一容器(如本文在任何相应实施例中所述的适体104)及用于容纳试剂112的一容器，如本文在任何相应实施例中所述。可以手动或自动方式，例如使用一机械臂(未示出)使所述电极100与所述适体及试剂112接触。一旦所述病原体生物或其所述部分、适体104及试剂112装载在所述电极上(例如，吸附到所述电极的所述表面)，所获得的电极120就被手动或自动(例如，通过一机器手臂的方式)传送到所述电化学系统146，以进行所述电化学反应。电化学系统146可包括一电化学电池(未示出，参见图1、14及25)，其具有一电解质溶液18及两个或更多个电极，其中一个电极是如本文在所述数个相应实施例的任一者中描述的所述感测电极120。所述电化学电池任选地并且优选地是一三电极电池。
[0407]
在本发明的一些实施例中，系统130包括一硬件处理器132，其通常包括一输入/输出(i/o)电路134、一硬件中央处理单元(cpu)136(例如，硬件微处理器)及一硬件存储器138，所述硬件存储器138通常包括易失性存储器及非易失性存储器。cpu 136与i/o电路134及存储器138通信。系统130优选地包括与处理器132通信的一图形用户界面(gui)142。i/o电路134优选地以一适当结构化的形式向及从gui传送信息142。
[0408]
硬件处理器132相对于系统180可以是位于当地的或者位于一远程位置。
[0409]
系统146产生的所述信号可以传送到硬件处理器132进行处理。通常，硬件处理器132通过所述i/o电路134接收所述信号。所述处理的步骤可以包括分析所述信号以确定所述病原体生物的所述存在及/或数量。所述处理的步骤可以附加地或替代地包括所述信号
的数位化。
[0410]
也如图23所示为一服务器计算机150，其可以类似地包括一硬件处理器152、一i/o电路154、一硬件cpu 156、一硬件存储器158。系统130及服务器计算机150的i/o电路134及154可以作为数个收发器操作，所述数个收发器通过一有线或无线通信相互传递信息。例如，系统130及服务器150可以通过一网络140进行通信，例如一局域网(lan)、一广域网(wan)、一wi-fi网络、gsm或因特网。在一些实施例中，服务器计算机150可以是通过网络140与系统130通信的一云计算设施的一云计算资源的一部分。
[0411]
gui 142及处理器132可以一起集成在同一壳体内，或者它们可以是相互通信的数个独立单元。类似地，系统180或处理器132可以集成在同一壳体内，或者它们可以是相互通信的数个独立单元。替代地或附加地，系统180可以包括用于连接到处理器132或另一计算机的一硬件连接器182(例如，usb、lan等)。连接器182可用于将系统146生成的所述信号直接传输到所述处理器及/或用于直接下载数个数据报告及用于数个固件软件更新。
[0412]
gui 142可以可选地并且优选地是包括一专用cpu及数个i/o电路(未示出)的一系统的一部分，以允许gui 142与处理器132通信。处理器132可以向gui 142发出cpu 136生成的图形及文本输出。处理器132还从gui 142接收数个信号，以有关于控制由响应于用户输入的gui 142生成的数个命令。gui 142可以是本领域已知的任何类型，例如但不限于一键盘及一显示器、一触摸屏等。在数个优选实施例中，gui 142是诸如一智能电话、一平板电脑、一智能手表等的一移动装置的一gui。
[0413]
客户端130及服务器150计算机还可以分别包括一或多个计算机可读存储介质144、164。介质144及164优选地是存储数个计算机代码指令的非暂时性存储介质，并且处理器132及152执行这些代码指令。所述数个代码指令可以通过将所述数个各自代码指令加载到所述数个各自处理器132及152的所述数个各自执行存储器138及158中来运行。
[0414]
处理器132接收的所述信号可以自动地或根据需要通过网络140传输到服务器150。所述信号可以是所述原始信号或一过程信号(例如，数位化信号)。或者，当处理器132分析所述信号以确定所述病原体生物的所述存在及/或数量时，它可以将所述分析的所述数个结果传输到服务器150。所述数据(信号、处理信号及/或数个结果)可以自动传输，允许服务器150在一段时间内监测所述基质中及/或所述基质上的所述病原体生物的所述存在及/或数量。
[0415]
可以在多个位置部署多个系统130。在这些实施例中，两个或多个系统130可以将数据传输到服务器150，从而允许服务器150在一领域、一地区或一国家绘制被所述病原体生物感染的数个位置，并且可选地并且优选地还监测所述病原体生物从一位置到另一位置的扩散。
[0416]
可以分析由服务器150接收到的所述数据，并且可以将所述分析的所述数个结果(例如，所述病原体生物的所述存在及/或数量)从服务器150传输到一或多个个体或设施，例如但不限于负责监测疾病传播的一农民或一政府机构。这允许在识别出所述病原体生物所述存在时采取所述适当的行动，例如用以减轻传播。
[0417]
网络140还可以被服务器150用来向系统130传输软件及/或固件更新。
[0418]
所述操作员可以使用gui 142来校准系统130的所述灵敏度阈值，例如通过改变处理器132采用的所述侦测阈值或所述结果的所述强度水平。或者，所述用户可以通过一专用
的用户-服务器接口(未示出)远程地校准系统130的所述灵敏度阈值，例如通过服务器150。
[0419]
如本文在任何相应实施例及其任何组合中描述的一系统可用于本文所述的任何方法，包括确定一病原体生物的一存在/数量/类型的一方法及控制疾病的存在及进展以及处理一基质的一方法，如本文在所述数个任何相应实施例及其任何组合中所述。
[0420]
病原体生物：
[0421]
在本文全文中，短语“病原体生物”用于描述可在一高等生物中引起一疾病或一感染的任何生物，所述高等生物例如为商业或娱乐目的而生长的植物、动物、鱼类、家禽、昆虫(例如，蜜蜂)及哺乳动物。在一些实施例中，所述病原体生物在数个植物中引起一疾病及/或一不利影响，并且在本文中也称为一植物感染生物。在一些实施例中，所述病原体生物是一植物感染生物并且在一些实施例中它是一土壤传播的植物感染微生物。
[0422]
如本文所用，术语“植物”包括数个完整植物、一嫁接植物、所述数个植物的祖先及后代以及数个植物部分，包括数个种子、数个枝条、数个茎、数个根(包括数个块茎)、数个砧木、数个接穗、数个叶。
[0423]
植物包括例如藻类、苔藓植物、气管植物及被子植物。被子植物包括例如开花植物、苏铁、银杏及针叶树。植物包括幼苗、成熟植物、树木及草皮。植物组织可包括例如根、叶、茎、花、种子及果实。
[0424]
根据所述数个本实施例特别有用的数个植物包括属于植物总科的所有植物，特别是单子叶及双子叶植物，包括选自以下的一饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树木或灌木:金合欢属物种(acaciaspp.)、槭树属物种(acer spp.)、称猴桃属物种(actinidia spp.)、七叶树属物种(aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(agathis australis)、albiziaamara、alsophila tricolor、须芒草属物种(andropogon spp.)、落花生属物种(arachis spp.)、模榔(areca catechu)、astelia fragrans、astragaluscicer、baikiaea pluri juga、样木属(betula spp.)、芸苔属(brassica spp.)、木揽(bruguiera gymnorrhiza)、burkea africana、紫铆(butea frondosa)、cadaba farinosa、朱纟婴花属物种(calliandra spp.)、大叶茶(camelliasinensis)、美人蕉(canna indica)、辣椒属物种(capsicum spp
·
)、决明属物种(cassia spp
·
)、距豌豆(centroema pubescens)、木瓜属物种(chaenomeles spp
·
)、肉桂(cinnamomum cassia)、小果咖啡(coffeaarabica)colophospermum mopane、coronillia varia、cotoneaster serotina、山楂属物种(crataegus spp.)、香瓜属物种(cucumis spp.)、柏木属物种(cupressus spp.)、cyathea dealbata、媪梓(cydonia oblonga)、日本柳杉(cryptomeria japonica)、香茅属物种(cymbopogon spp.)、cyntheadealbata、媪梓(cydonia oblonga)、dalbergia monetaria、大叶骨碎补(davallia divaricata)、山马蟥属物种(desmodium spp.)、粗糖虫丰贝厳(dicksonia squarosa)、diheteropogon amplectens、dioclea spp、德扁豆属物种(dolichos spp.)、dorycnium rectum、echinochloa pyramidalis、ehrartia spp
·
、穆子(eleusine coracana)、幽眉草属物种(eragrestis spp
·
)、剌桐属物种(erythrina spp
·
)、按属物种(eucalyptus spp
·
)、eucleaschimperi、eulalia villosa、养麦属物种(fagopyrum spp.)、费约果(feijoasellowiana)、草莓属物种(fragaria spp.)、千斤拔属物种(flemingia spp)、freycinetia banksii、geranium th unbergii、银杏(ginkgo biloba)、glycinejavanica、gliricidia spp、陆地棉(gossypium hirsutum)、银禅属物种
(grevillea spp.)、guibourtia coleosperma、岩黄甚属物种(hedysarumspp.)、牛鞭草(hemarthia altissima)、扭黄茅(heteropogon contortus)、大麦(hordeum vulgare)、hyparrhenia rufa、小连翅(hypericum erectum)、hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(indigo incarnata)、鸾尾属物种(iris spp
·
)、leptarrhena pyrolifolia、古月枝子属物种(lespediza spp.)、lettuca spp.、leucaena leucocephala、loudetia simplex、罗顿豆(lotonus bainesii)、百脉根属物种(lotus spp.)、macrotyloma axillare、苹果属物种(malusspp.)、manihot esculenta、紫苜猜(medicago sativa)、水杉(metasequoiaglyptostroboides)、粉色蕉(musa sapientum)、烟草属物种(nicotianumspp.)、驴食豆属物种(onobrychis spp.)、ornithopus spp
·
、稻属物种(oryzaspp.)λpeltophorum africanum、狼尾草属物种(pennisetum spp
·
)、perseagratissimaλ碧冬煎属物种(petunia spp.)、菜豆属物种(phaseolus spp.)、模榔竹(phoenix canariensis)、phormium cookianum、石楠属物种(photiniaspp.)、白云杉(picea glauca)、松属物种(pinus spp
·
)、豌豆(pisumsativum)、新西兰罗汉松(podocarpus totara)、pogonarthria fleckii、pogonarthria squarrosa、杨属物种(populus spp
·
)、牧豆树(prosopiscineraria)、花方萁松(pseudotsuga menziesii)、pterolobium stellatum、西洋梨(pyrus communis)、栎属物种(quercus spp
·
)、rhaphiolepsisumbellata、美味棒花掠(rhopalostylis sapida)、rhus natalensis、欧洲醋栗(ribes grossularia)、荼荐子属物种(ribes spp
·
)、洋槐(robiniapseudoacacia)、蔷薇属物种(rosa spp.)、悬钩子属物种(rubus spp.)、柳属物种(salix spp.)、schyzachyrium sanguineum、金松(sciadopitysverticillata)、北美红杉(sequoia sempervirens)、巨杉(sequoiadendrongiganteum)、两色蜀黍(sorghum bicolor)、菠菜属物种(spinacia spp.)、sporobolus fimbriatusλstiburus alopecuroides、stylosanthos humilis、葫芦荼属物种(tadehagi spp
·
)、落羽松(taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(themeda triandra)、车轴草属物种(trifolium spp
·
)、小麦属物种(triticum spp.)、异叶铁杉(tsuga heterophylla)、越桔属物种(vacciniumspp.)、野豌豆属物种(vicia spp.)、葡萄(vitis vinifera)、维穗沃森花(watsonia pyramidata)、马蹄莲(zantedeschia aethiopica)、玉米(zeamays)、觅属植物、朝鲜蓟、芦异、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿叶植物、亚麻、无头甘蓝、小扁豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、荼叶和树木，等等。或者，藻类及其他非植物绿藻可用于本发明的一些实施例的方法。
[0425]
根据一些实施例，植物是大豆。
[0426]
根据一些实施例，植物是小麦。
[0427]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述病原体生物是一病原体微生物。
[0428]
所述病原体微生物可以属于任何生物家族，例如但不限于原核生物、真细菌、古细菌、真核生物、酵母、真菌、藻类、原生动物及其他寄生虫。
[0429]
在一些实施例中，所述微生物是一真菌，并且在一些实施例中，它是一植物感染真菌。
[0430]
感染植物的微生物的数个实例包括植物病原体真菌、植物病原细菌、木材腐烂真菌及植物病原体线虫。土传病原体真菌包括但不限于，柱胞属(cylindrocarpom spp.)、镰
刀菌属(fusarium spp.)、腐霉属(phoma spp.)、疫霉属(phytophthoraspp.)、腐霉属(pythium spp.)、丝核菌属(rhizoctonia spp.)、核盘菌属(sclerotinia spp)、轮枝菌属(verticillium spp.)、及巨噬菌属(macrophomina spp.)。土传植物病原体菌包括但不限于假单胞菌属(pseudomonas spp.)、黄单胞菌属(xanthomonas spp.)、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)、棒状杆菌属(corynebacterium spp.)、及链霉菌属(streptomyces spp.)。植物病原体线虫包括但不限于根结线虫属(meloidogyne spp.)、剑线虫属(pratylenchus spp.)、pratylenchus spp.、longidorus spp.、副线虫属(paratylenchus spp.)、rotylenchulus spp.、helicotylenchus spp.、hoplolaimus spp.、paratrichodorus spp.、radopholus spp.、anguina spp.、aphelenchoides spp.、bursapehlenchus spp.、ditylenchus spp.、trichchodorus spp.、globodera spp.、hemicycliophora spp.、heterodera spp.、dolichodorus spp.及柑桔半穿刺线虫(tylenchulus semipenetrans)。
[0431]
在一些实施例中，所述微生物是在一植物中引起一锈病的所述微生物。
[0432]
在一些实施例中，所述微生物是在一植物中引起锈病的一真菌，其在本文中也称为锈菌。在这些实施例的一些中，所述植物是大豆。在大豆中引起锈病的示例性真菌包括phakopsora类型的真菌，例如豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)及山马蝗层锈菌(phakopsora meibomiae)。在这些实施例的一些中，所述植物是小麦。在小麦中引起锈病的示例性真菌包括puccinia类型的真菌，例如分别为puccinia triticina(以前称为puccinia recondite f.sp.tritici)、puccinia striiformis f.sp.tritici及puccinia graminis f.sp.tritici。
[0433]
数个其他示例性病原体生物包括但不限于白粉病、咖啡叶锈病、赤霉病、马铃薯晚疫病、苹果黑星病、绿化(细菌或昆虫载体)、褐飞虱、水稻螟虫、毛虫/鳞翅目害虫、及例如害虫。
[0434]
样品：
[0435]
根据所述数个本实施例，含有或怀疑含有一病原体生物的一样品可以含有所述生物本身(例如，一病原体微生物)或其一部分。
[0436]“其部分”是指所述生物体的数个卵、数个孢子、一器官、一组织(例如表皮)或数个细胞，或源自所述生物体的此类部分。
[0437]
在一些实施例中，当所述病原体生物不是一病原体微生物时，本文定义的所述微生物的一部分与所述电极接触。
[0438]
根据本实施例的所述方法可用于例如侦测一样品(例如，取自一植物环境的一样品)中的数个大豆锈病，例如用于侦测其早期的夏孢子相关病害。
[0439]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述样品属于(源自)怀疑被本文所述病原体生物(例如，病原体微生物)感染的一基质的一部分或所述基质周围的一环境的一部分。
[0440]
所述基质可以是有一生命的或无生命的基质。
[0441]
一无生命的基质可以是能够支持、藏匿或促进病一原体生物的所述生长的任何表面、结构、产品或材料。数个非限制性范例包括数个储存容器、数个仓库、数个建筑物、数个隔间或数个运输车辆、数个木质基质、数个岩石、染料、油漆、水、水或其他流体储存或数个运输容器、数个建筑材料以及数个公共封闭或部分封闭空间(如数个公共厕所、数个公共交
通工具及数个车站、码头)等的数个内/外壁。
[0442]
一有生命的基质包括任何有生命的基质或其一部分，包括动物及植物。
[0443]
在本文所述的任何实施例的一些中，所述基质是一农业基质。所述农业基质包括任何农产品或作物，例如木材、纤维、水果、蔬菜、花卉、提取物、园艺作物及任何其他加工或未加工的农产品或作物，它们由数个有机来源(例如数个活的植物或数个动物)生产。一农业基质也可以是在所述农业基质的所述生产过程中使用的任何装置，例如数个灌溉装置、数个卫生装置等。一农业基质也可以是土壤或一土壤容器。
[0444]
根据一些实施例，所述农业基质是一植物、一土壤、一种子、一灌溉装置、一灌溉源(例如，一水源)。
[0445]
根据一些实施例，所述农业基质是一植物或供所述植物生长的一土壤，所述样品是所述植物周围及/或供所述植物种植的所述土壤的一环境的一空气样品。
[0446]
根据数个示例性实施例，所述病原体生物或微生物是一锈菌，并且样品是怀疑被所述锈菌感染的一植物(或相应的油)周围的一环境的一空气样品。数个示例性植物列于下表a中。
[0447]
数个应用：
[0448]
如本文所述的方法可用于确定源自所述样品的一基质是否被一病原体生物(例如，一病原体微生物)感染。
[0449]
如本文所述的方法可进一步用于鉴定所述感染的病原体生物并确定应使用哪种抗微生物剂来减少所述基质中的所述生物的所述负载。
[0450]
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了一种减少一基质中及/或一基质上的一病原体生物(例如，一病原体微生物)的一负载的方法，所述方法包括以下步骤:确定使用如本文在各个实施例中的任一个中描述的方法的所述基质中及/或所述基质上的一存在、数量及/或类型，并且基于所述确定的步骤，将鉴定为被所述病原体微生物感染或藏匿病所述原体微生物的一基质与能够所述减少病原体微生物的一族群的一抗微生物剂接触。
[0451]
术语“减少所述负载”是指与一未经处理的基质相比的(数个)活生物体数量的一减少，或它们的生长速度的一减少，或两者兼有，从而总体减少所述生物的所述族群，含有生物体的基质。当所述基质是一有生命的基质或一农业基质时，如本文所述，减少受一感染基质中的一病原体生物的所述负载可被视为处理所述基质及/或作为控制所述基质的所述生长及/或作为控制由所述基质中的所述病原体生物引起的一疾病的一进展，如下文进一步解释的。
[0452]
例如，所述方法可用于通过鉴定所述植物中的一病原体生物的所述存在及类型来控制一植物的一生长，并相应地通过确定是否及哪种杀虫剂或其他一培养处理应该用于所述植物或其环境，以对所述植物解除感染并增加其生长产数量及/或防止或减少所述病原体生物对其的感染。
[0453]
所述方法可用于控制或监测一农业基质中由一病原体生物引起的一疾病的一存在及/或进展。
[0454]
所述方法可通过如本文所述的例如早期鉴定由一病原体生物引起的一疾病并治疗所述疾病，用于增加数个农业基质(例如数个植物，如本文在任何所述数个相应实施例中所述)的所述生长产量。
[0455]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述方法用于确定所述基质中及/或所述基质上的一锈菌(例如一大豆锈菌)的一存在及/或数量及/或类型，并使用如本文在所述数个任何相应实施例中描述的方法来实现，并且基于所述确定的步骤，使用一杀真菌剂及/或可用于减少所述相应锈菌的一族群的其他处理来处理所述基质。
[0456]
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种控制由一农业基质中的一病原体生物引起的一疾病的一存在及/或进展的方法。所述方法包括使用如本文在任何相应实施例中描述的方法，通过从所述农业基质或其环境收集一样品，确定如本文所述在任何相应实施例中的所述基质中及/或所述基质上的一病原体生物的一存在、数量及/或类型。一旦确定了一病原体生物的一存在并确定了其类型，所述方法就继续用能够减少及/或控制所鉴定的病原体生物的一族群的一杀虫剂来处理所述基质。
[0457]“控制由一病原体生物引起的一疾病的一存在及/或进展”是指确定一农业基质是否被所述病原体生物感染，即所述农业基质是否含有所述病原体生物，因此所述基质是否患有由所述微生物引起的一疾病。其还意味着如果由于尚未观察到疾病的数个症状而在所述基质中或所述基质上存在一病原体生物，通过例如防止一疾病的一发展来控制所述疾病的所述进展，或者降低一疾病的一发展速度，例如降低在所述基质中的所述病原体生物的所述分布或所述分布速率。这也意味着治疗所述疾病。它还意味着监测响应于一杀虫剂或任何其他处理的疾病进展。因此，所述方法可替代地或另外地在处理被所述病原体生物感染或怀疑被所述病原体生物感染的一农业基质之后进行，以评估例如控制所述基质中的所述病原体微生物的所述处理是否有效。
[0458]“控制一病原体生物的一族群”在本文中是指减少所述基质中的数个活生物的所述数量(例如，杀死所述生物及/或阻止它们的繁殖)，及/或干扰所述生物的所述生长。干扰所述生物体的所述生长的步骤包括降低所述生物体的所述生长速率及/或干扰所述生物体的所述生长及/或繁殖的所述数个发育阶段。
[0459]
根据这些方面中描述的任何实施例中的一些，所述病原体生物是一锈菌，并且所述杀虫剂是可用于减少一负载或控制如本文所述的锈菌的一族群的一杀真菌剂。
[0460]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述锈菌是大豆锈菌。
[0461]
根据本文所述的任何实施例中的一些，确定所述大豆锈菌的一存在及/或数量及/或类型的步骤是如本文在所述数个相应实施例中的任一个及其任何组合中所描述的。
[0462]
虽然最常见的易受一大豆锈菌影响的农业基质(植物)是大豆，但已知其他农业基质受本文所述的大豆锈菌影响呈现于下表a中。
[0463]
表a
[0464]
[0465][0466]
(表a；连续的)
[0467]
可用于处理大豆锈菌的数个杀真菌剂包括但不限于氯腈(例如百菌清)、嗜球果伞素(qoi杀真菌剂)、三唑、琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhi)及其组合。数个杀菌剂可以与数个文化控制措施结合使用或替代。
[0468]
在一些实施例中，可用于控制锈病或由锈菌例如大豆锈菌引起的疾病的杀真菌剂，如本文所述，包括但不限于铜基杀真菌剂，包括例如，如氯氧化铜、硫酸铜、氢氧化铜及三碱式硫酸铜(波尔多液)；元素硫；二硫代氨基甲酸酯类杀真菌剂包括，例如，阿米巴胺、阿
索美特、阿奇霉素、卡巴吗啉、氯呋喃、铜溴灵、双硫仑、费巴姆、美坦、纳巴姆、替考仑、福美双、尿嘧啶、齐拉姆、达唑美、依坦、米尔尼布、曼铜、三甲氧嘧啶、聚甲氧芐啶、propineb及zineb；邻苯二甲酰亚胺类杀真菌剂，包括例，folpet、captan及captafol；百菌清；康唑类杀真菌剂包括，例如克霉唑、克霉唑、抑霉唑、氧唑菌、丙氯灵、丙氯灵-锰、三氟咪唑、阿扎康唑、比特醇、溴康唑、环丙康唑、双氯唑菌、苯醚甲环唑、地康唑、地康唑-m、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟硅唑、氟菌唑、呋喃康唑、呋康唑-顺式、己康唑、咪康唑、益康唑、甲康唑、菌菌灵、戊康唑、丙环唑、丙硫菌唑、喹康唑、西康唑、戊唑醇、戊康唑、三唑酮、三唑醇、非康唑；醌外抑制剂包括例如非那酮、法莫沙酮；嘧菌酯杀真菌剂包括例如嘧菌酯、曼地菌素、香菌素酯、依诺嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、烯菌酯、氟嘧菌酯、甲菌胺酯、甲菌胺酯、稻嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯、嘧菌酯琥珀酸脱氢酶抑制剂，包括例如苯达尼、氟菌胺、甲萘威、氟吡菌酰胺、芬呋喃、羧菌素、羟羧菌素、噻菌胺、联苯吡菌胺、氟啶虫胺、呋喃甲胺、异吡唑啉、戊苯菌灵、吡噻菌胺、sedaxane及bosdale；(v)它们的组合；及苯丙啶，以及它们的任何混合物。
[0469]
根据一种控制由一锈真(例如大豆锈菌)引起的一锈病的一存在及/或进展的方法的上下文中的如本文所述的所述数个任何实施例中的一些，所述方法包括使用如本文所述的一或多种杀真菌剂来处理一农业基质的步骤，所述农业基质被鉴定为被一锈菌感染。在这些实施例的一些中，所述杀真菌剂包含苯丙啶、fluxapyroxad、嘧菌酯、嘧菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑、氟菌灵、克菌丹、代森锰锌中的一者或多者或上述两者或多者的任何混合物。
[0470]
数个中间电极及数个试剂盒：
[0471]
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种电极，具有吸附于其的如本文定义的一病原体生物或其一部分，以及如本文所述的选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分的一适体，如所述数个相应实施例的任一个所述，所述适体接附到所述病原体生物或其所述部分，如本文针对电极110所述般。所述电极(电极110)可通过将本文在所述数个各个相应实施例中的任一个中描述的一电极与一样品接触来获得，所述样品包含所述病原体生物或其所述部分、或包含藏匿所述病原体生物的一基质或所述基质周围的一环境，然后使所述电极与包含所述适体的一溶液接触。
[0472]
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种感测电极，所述感测电极具有吸附于其的如本文所定义的一病原体生物或其一部分，以及所述感测电极具有选择性地结合到所述病原体生物或其所述部分的一适体，接附于所述病原体生物的其所述部分，以及所述感测电极具有参与连接到所述适体的一电化学可侦测反应的一试剂(试剂112)，如本文中所述数个任何相应实施例中所述。
[0473]
根据这些实施例中的一些实施例中的一些，在所述电极上的所述病原体生物或其所述部分的一数量，优选地每mm2的如本文所定义的所述生物体或其所述部分(例如，一孢子、一卵或一整个微生物)的至少5个、或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少30个。在一些实施例中，所述数量在所述电极的每mm2的一生物体或其一部分的1个至1000个的范围内，包括其间的任何中间值及数个子范围。
[0474]
根据这些实施例中的任一些，所述病原体生物是一大豆锈菌，如本文所述，并且所述适体对所述大豆锈菌具有选择性，如本文所述数个相应实施例中的任一个及其任何组合中所述。
[0475]
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括一电极(电极100)及一溶液，所述溶液包含一适体，所述适体选择性地结合到一病原体生物或其一部分，所述电极及所述溶液单独包装在所述试剂盒中。
[0476]
所述电极可以是如本文在所述数个相应实施例中的任一个中所描述的。所述电极应优选能够将如本文定义的所述病原体生物或其所述部分吸附到其一表面的至少一部分。
[0477]
根据一些实施例，所述试剂盒还包括使所述电极与怀疑含有所述病原体生物或其所述部分的一样品接触的数个指示，如本文在所述数个相应实施例中的任一个中所述，并随后使所述电极与所述溶液接触。
[0478]
根据一些实施例，所述试剂盒进一步包括含有能够结合所述适体并参与一电化学可侦测反应的一试剂(如本文在所述数个相应实施例的任一个中描述的试剂112)的一溶液，并且在一些实施例中，每个所述的溶液中单独地包装在所述试剂盒中。
[0479]
根据一些实施例，所述试剂盒还包括数个指示，以将所述电极与怀疑含有所述病原体生物或其所述部分的一样品接触，随后将所述电极与包含所述适体的所述溶液接触，随后将所述电极与包含所述试剂112的所述溶液接触。
[0480]
根据一些实施例，所述试剂盒进一步包括一电解质溶液及任选的所述电化学可侦测反应的一反应物(例如本文在所述数个相应实施例的任一个中描述的试剂122)，及/或数个指示以一旦制备了包含所述电解质及试剂122的一溶液而接触电极120。
[0481]
根据一些实施例，所述试剂盒还包括与所述试剂盒单独包装的试剂122，以及还包括通过使试剂122与所述电解质接触来制备所述溶液的数个指示。
[0482]
根据一些实施例，所述试剂盒还包括试剂122、及每一者都单独包装在所述试剂盒中所述电解质、以及通过使试剂122与所述电解质接触来制备所述溶液的数个指示。
[0483]
根据本文针对一试剂盒描述的任何所述数个实施例中的一些，所述试剂盒还包括数个指示，以使用能够控制所述病原体生物的一族群的一杀虫剂来处理被鉴定为藏匿或含有所述病原体生物或被所述病原体生物感染的一基质。
[0484]
根据本文所述的任何所述数个实施例中的一些，所述试剂盒还包括能够控制所述病原体生物的一族群的一杀虫剂，优选地单独包装在所述试剂盒内。
[0485]
根据本文针对一试剂盒描述的任何所述数个实施例中的一些，所述病原体生物是如本文所述的一大豆锈菌，以及所述适体对所述大豆锈菌具有选择性，并且为如本文所述数个相应实施例中的任一个及任何其组合所描述的。
[0486]
根据这些实施例中的一些，所述试剂盒还包括数个指示，以使用能够控制所述锈菌的一族群的一杀真菌剂来处理被鉴定为藏匿或含有所述锈菌或被所述锈真感染或受一锈病折磨的一农业基质，如本文在任何所述数个相应实施例中所描述。
[0487]
根据本文所述的任何实施例中的一些，所述试剂盒进一步包含一杀真菌剂，所述杀真菌剂能够控制所述锈菌的一族群，如本文在任何所述数个相应实施例中所述，优选地所述杀真菌剂单独包装在所述试剂盒内。
[0488]
根据数个示例性实施例，所述试剂盒还包含苯丙啶、fluxapyroxad、嘧菌酯、嘧菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑、氟哌啶醇、克菌丹、代森锰锌或上述两种或更多种的数个混合物。本文通篇提及的”病原体生物”指示出其也包含如本文所定义的其一部分、及/或一病原体微生物。
[0489]
预计在从本技术成熟的一专利的所述有效期内，将开发许多相关的感测电极，术语“电极”、“感测电极”及“感测系统”的所述范围旨在包括所有此类先验的新技术。
[0490]
预计在从本技术成熟的一专利的所述有效期内，将开发出许多相关的适体，以及适体一词的所述范围旨在包括所有此类先验的新技术。
[0491]
如本文所用，术语“约”是指
±
10％或
±
5％。
[0492]
术语“包含”、“具有”及数个其共轭意思是“包括但不限于”。
[0493]
术语“由
……
组成”是指“包括并限于”。
[0494]
术语“基本上由
……
组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括数个额外的成分、步骤及/或部分，但前提是所述数个额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求保护的所述组合物、方法或结构的所述基本及新颖特征。
[0495]
如本文所用，单数形式“一”及“所述”包括复数参考，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可以包括多种化合物，包括其数个混合物。
[0496]
在本技术中，可以一范围格式呈现本发明的各种实施例。应当理解，范围格式中的说明仅仅是为了方便及简洁，不应理解为对本发明的所述范围的一不灵活的限制。因此，应所述认为对所述范围的所述说明已经具体公开了所有可能的所述数个子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对诸如从1个到6个的一范围的说明应被认为具有具体公开的数个子范围，例如从1个到3个、从1个到4个、从1个到5个、从2个到4个、从2个到6个、从3个到6个等，以及所述范围内的单个数字，例如1个、2个、3个、4个、5个及6个。无论所述范围的所述广度如何，此皆适用。
[0497]
无论何时在本文中指示出一数字范围，都意味着包括在所述指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“范围/范围在
…
之间”第一指示出数字及第二指示出数字之间及“范围/范围从”第一指示出数字“到”第二指示出数字在本文中可互换使用并且意在包括第一及第二指示出数字以及它们之间的所有小数及整数。
[0498]
如本文所用，术语“方法”是指用于完成一给定任务的数个方式、数个手段、数个技术及数个程序，包括但不限于那些已知的数个方式、数个手段、数个技术及数个程序或所述化学、药理学、生物、生物化学及医学领域的从业者的已完成开发的数个方式、数个手段、数个技术及数个程序。
[0499]
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转一病症的所述进展，基本上改善一病症的数个临床或美学症状或基本上防止一病症的数个临床或美学症状的所述出现。
[0500]
当提及数个特定序列表时，此类提及应理解为还包括与其互补序列基本对应的数个序列，包括数个微小的序列变异，所述数个微小的序列变异例如由数个测序错误、数个克隆错误或导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加的数个其他改变所导致的，前提是此类变异的所述频率小于50个核苷酸中的1个，或者，小于100个核苷酸中的1个，或者，小于200个核苷酸中的1个，或者，小于500个核苷酸中的1个，或者，小于1000个核苷酸中的1个，或者，小于5,000个核苷酸中的1个，或者，小于10,000个核苷酸中的1个。
[0501]
应理解，本技术中公开的任何序列标识号(seq id no)可以指一dna序列或一rna序列，这取决于提及所述seq id no的上下文，即使所述seq id no仅以一dna序列形式或一rna序列形式表达。例如，seq id no:1以一dna序列形式表达(例如，胸腺嘧啶用t表示)，但
它可以指对应于一rna分子核酸序列的一rna序列的任一dna序列。在任何情况下，都可以设想具有公开的所述数个序列的数个dna及rna分子以及任何替代物。
[0502]
应当理解，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，为了简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他描述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的数个基本特征，除非所述实施例在不具有这些元件的情况下是不可操作的。
[0503]
上述说明及下述的所要求保护的所述数个权利部分的本发明的各种实施例及方面在以下所述数个范例中得到实验性的支持。
[0504]
数个范例
[0505]
现在参考以下所述数个范例，所述数个范例与以上说明一起以一非限制性方式阐述了本发明的一些实施例。
[0506]
数个材料及数个实验性方法
[0507]
数个材料及数个化合物
[0508]
以下材料购自以色列sigma-aldrich：六水氯化镁(m0250≥99.0％)、碳酸氢钠(s5761粉末，bioreagent，用于分子生物学，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养)、钠碳酸盐(bioultra，无水，≥99.5％)、磷酸酶、来自牛肠粘膜的碱性物质(p0114 bioultra，缓冲的甘油水溶液，≥6,500dea单位/mg蛋白质)、磷酸酶基质(对硝基苯磷酸盐)(p4744粉末)、钠氯化物(71376bioultra，用于分子生物学，≥99.5％)及4-硝基苯酚(对硝基苯酚)(241326≥99％)。
[0509]
以下材料购自美国engineered fiber technology：微碳纤维纸(0.18毫米厚)，型号spectracarb 2050a-1050。
[0510]
所述数个材料购自以色列alex red：parafilm pm996。
[0511]
所有实验均使用millipore mill-q水(去离子水，18mega-ohm)。
[0512]
数个供应商或数个其他材料的其他详细信息如下所示。
[0513]
感测注册：
[0514]
emstat3 (palmsens bv，荷兰)用于数个线性扫描伏安法及循环伏安法测量。emstat3 系统是一款具有数个研究级功能的一紧凑型且低成本恒电位仪。其具有八个电流范围，从1na到100ma满量程度，一最小分辨率为1pa。其提供了最适用的数个电分析测量技术。
[0515]
所述电化学电池的构造：
[0516]
构建了一传统的三电极电池(体积3ml)，其中：铂(pt)电极(0.4cm2)用作所述对电极，及使用3m氯化钾的一银-氯化银(ag-agcl)用作具有一双结盐桥(metrohm)的所述参考电极，以及一使用氧等离子体处理的微碳纤维电极(0.35cm2，直径0.18mm)作为所述工作电极。
[0517]
所述工作电极由微碳纤维纸(0.18x20x5mm)制成，镍箔(0.2x25x5mm)用作一集电器(电接触)；所述微碳纤维电极与所述镍箔之间的所述数个连接及所述绝缘由parafilm完成。将所述电极及集电器在室温下以约2kg/cm2压30秒。用乙醇小心洗涤所述电极，用蒸馏水冲洗并在室温下干燥。
[0518]
图1显示了一示例性电化学感测系统组件的一照片：所述红色鳄鱼夹连接到所述工作电极(微碳纤维电极)，所述蓝色鳄鱼夹连接到所述参考电极(银-氯化银电极)，以及所述黑色鳄鱼夹连接到所述对电极(铂电极)。为了混合，使用数个塑料巴斯德吸管。所述电化学电池的所述盖子由一特氟龙模具(白色)制成。
[0519]
微碳纤维电极预处理：
[0520]
在进行电化学测量之前，先用约10毫升异丙醇清洗微碳纤维电极，然后再用约10毫升去离子水清洗。
[0521]
扫描电子显微镜(sem)分析：
[0522]
采用quanta 200feg环境扫描电子显微镜对所述微碳纤维电极及所述大豆锈病进行分析。所述数个图像指示出所述大豆锈病的所述形态(参见图4及图5a至图5b)及所述微碳纤维电极表面特征(参见图7)。所述在分析之前，使用一溅射镀膜机系统(emitech sc7640 sputter coater，polaron)为数个样品镀上4nm的金/钯。
[0523]
光学显微镜表征：
[0524]
奥林巴斯光学显微镜配备日本制造的用于明场及暗场分析的u-pmtvc相机适配器，以用于大豆锈病及所述微碳纤维电极的形态分析。
[0525]
空气采样器设置：
[0526]
一便携式自制空气采样器带有硅胶管，用于在所述抽气过程中收集空气及固定所述数个电极，并如图2a至图2b所示。所述空气采样器连接到硅胶管，用于固定电极及控制所述空气采样周围。所述空气采样系统的主要目的是对所述电极表面的所述数个大豆锈病夏孢子进行采集。重要的是，所述电极是完全透气的，这使其具有空气过滤能力。
[0527]
以每分钟10升的速度泵送的所述设备由重量为1公斤的数个可充电电池供电。可所述数个充电电池及其轻巧的重量(1kg)使所述空气采样器为高度地可便携的。
[0528]
数个适体：
[0529]
如下文范例7中所述，使用所述selex方法鉴定并提供了对phakopsora夏孢子具有选择性并以共价接附于其上的一生物素部分为特征的数个适体。
[0530]
范例1
[0531]
数个大豆锈病样品的形态分析
[0532]
这些分析的目的是开发一种快速可靠的方法，根据它们的形态来验证一基质中/上的数个大豆锈病夏孢子的所述存在。
[0533]
所述方法用作侦测所述电极表面的大豆锈病的所述存在的一快速分析方法。
[0534]
光学显微镜表征：
[0535]
光学显微镜分析是一众所周知的快速、可靠且最重要的非破坏性方法。
[0536]
图3显示了悬浮在具有一天然氧化层(《100》，n型砷，355μm至395μm，15mω/cm至7mω/cm)的一硅晶片上的数个大豆锈菌样品的数个光学显微镜图像。将数个大豆锈病样品悬浮在1:1去离子水及异丙醇的一混合物中。
[0537]
环境扫描电子显微镜表征：
[0538]
为了验证所述数个光学显微镜测量结果，使用了扫描电子显微镜(sem)。如本领域所述，数个大豆锈病夏孢子几乎是无柄的、倒卵球形至具有带刺表面的宽椭圆形，尺寸为18-34μm x 15-24μm(参见例如ono等人，mycal.res.96(10):825-850，1992年)。
[0539]
图4显示出在20kv、10mm距离及高真空模式下沉积4nm金/钯后的一大豆锈菌样品的sem二次电子图像。如图所示，所述数个得到的图像与所述文献中描述的所述数个大豆锈病夏孢子的所述形态一致。
[0540]
为了进行高级形态分析及验证，拍摄了数个大豆锈病尖峰的一高分辨率图像。进行了二次电子图像及背散射电子图像之间的一比较。
[0541]
图5a至图5b显示出在沉积4nm金/钯之后以20kv、10mm距离及高真空模式拍摄的数个大豆锈尖峰的数个二次电子(图5a)及数个背散射电子(图5b)图像。
[0542]
范例2
[0543]
微碳纤维电极的形态分析
[0544]
进行数个分析的目的是开发一种快速可靠的方法，以验证所述微碳纤维电极的所述表面上的数个大豆锈病夏孢子的所述存在。因此，对微碳纤维电极表面进行了一表征。使用一光学显微镜及扫描电子显微镜对所述微碳纤维电极进行表征。
[0545]
光学显微镜表征：
[0546]
图6a至图6b显示出数个光学显微镜图像：在x400放大倍数下拍摄的一微碳纤维电极(0.18mm厚，spectracarb 2050a-1050型)的明场(图6a)及暗场(图6b)分析。
[0547]
环境扫描电子显微镜表征：
[0548]
进行了扫描电子显微镜分析，以验证所述数个光学显微镜测量结果并对所述微碳纤维电极进行一详细的表面研究。
[0549]
图7显示出微碳纤维电极(0.18mm厚，spectracarb 2050a-1050型)的数个扫描电子显微镜图像(数个二次电子图像)。所述数个图像是在20kv、10mm距离及高真空模式下以各种放大倍率拍摄的。
[0550]
范例3
[0551]
空气采样感测
[0552]
一用于大豆侦测的自制空气采样装置(如图2b所示)，通过收集来自所述大豆锈病样品周围的空气(距所述样品约10cm)来使从所述样品(所述50ml试管内的所述棕色包装)中预浓缩所述数个大豆锈病夏孢子，所述样品位于所述微碳纤维电极(置于所述硅管内的一黑色片)的所述表面上。
[0553]
光学显微镜表征：
[0554]
图8显示出数个光学显微镜图像：使用以10升/分钟的速度的上述自制空气采样系统对大豆锈病样品的所述周围进行采样3分钟后，以进行了不同放大倍数下的所述微碳纤维电极在数个明场及暗场图像。
[0555]
环境扫描电子显微镜表征：
[0556]
图9a及图9b显示出使用上述自制空气采样系统以速度为10升/分钟对大豆锈菌样品周围采样3分钟后，大豆锈菌在所述微碳纤维电极上的扫描电子显微镜图像(二次电子图像)。在拍摄所述数个图像之前，已在所述数个样品上进行了4nm金/钯的一沉积。所述数个图像是在20kv、10mm距离及高真空模式下拍摄的。
[0557]
图9c为使用上述自制空气采样系统以速度为10升/分钟在大豆锈菌样品周围取样3分钟后，大豆锈菌在所述微碳纤维电极上的数个扫描电子显微镜图像(二次电子)(左)及数个背散射电子(右)图像。在拍摄所述数个图像之前，已在所述数个样品上进行了4nm金/
physical chemistry a，2008年，第82卷，第11期，第1947至1951页。
[0574]
根据碱性磷酸酶(ap)共轭抗体目录，用于碱性磷酸酶共轭抗体的最推荐缓冲液包含100mm二乙醇胺、100mm nacl、5mm mgcl2，ph 9.5(编号r932-35、r942-25、r952-25,r962-25)。在设计包含以下材料的一基于碳酸盐的缓冲溶液时已考虑到这一点，以下材料为：
[0575][0576][0577]
使用碳酸氢钠(0.100mol/l)及碳酸钠(0.100mol/l)的一混合物制备1升ph＝9.5的0.100mol/l碳酸盐缓冲液。然后，添加氯化钠及氯化镁(六水合物)以获得浓度为0.01[mol/l]的氯化钠及0.005[mol/l]的氯化镁(六水合物)。
[0578]
根据pstrace 5.3软件的以下输入参数进行数个循环伏安测量：平衡时间0秒，e begin＝0.0v，e vertex1＝-1.5v，e vertex2＝1.0v，e step＝0.005v，扫描速率为0.1v/s及1次扫描。
[0579]
图11显示出在上文所示的一碳酸盐缓冲液中的所述碱性磷酸酶基质(磷酸对硝基苯酯)在所述修饰的微碳纤维电极(具有所述碱性磷酸酶，所述碱性磷酸连接附到所述适体上，所述适体结合到所述数个孢子，所述数个孢子吸附到所述电极的表面上)上获得的所述数个循环伏安图。在0ppm至500ppm的基质的数个浓度范围内获得一浓度依赖性信号，且所述电流峰值在0.350v及-0.950v处接收。
[0580]
图12显示出10个循环的循环伏安法测量(扫描1至扫描10)。所述背景溶液基于如上文所述的一碳酸盐缓冲液(ph＝9.5)，并添加了500ppm的对硝基苯基磷酸酯(所述基质)。在开始所述数个测量之前，所述微碳纤维电极吸附了10个单位的碱性磷酸酶。如图1 2所示的所述微碳纤维电极上的碱性磷酸酶的所述酶活性显示出所述信号随时间增加，这是由于对硝基苯磷酸酯向对硝基苯酚的所述酶促转化。正如预期的那样，所述数个峰值是可逆的(0.065v及-0.165v)。
[0581]
图13显示出在碳电极存在下吸附10个碱性磷酸酶单位的所述碱性磷酸酶基质的数个循环伏安图，表示出所述碳酸盐缓冲液(蓝色)、所述500ppm碱性磷酸酶基质(对硝基苯磷酸盐；绿色)的所述电化学背景，以及在碳电极存在下吸附10个碱性磷酸酶单位的所述500ppm碱性磷酸酶基质(红色)。
[0582]
图14a至图14b显示出数个碱性磷酸酶修饰的微碳纤维电极与缓冲碳酸盐(ph＝9.5)中的500ppm对硝基苯基磷酸酯(所述基质)的酶促反应之前(图14a)及之后(图14b)的所述电化学设置。
[0583]
图15a显示出在所述测试的碳酸盐缓冲液中使用循环伏安法分析的对硝基苯酚的所述侦测极限。仅显示每个循环伏安法测量的所述第二次扫描。图14所示的所述电化学装置中的所述侦测极限为0.5ppm(所述红线)。
[0584]
图15b显示出在如本文所述的一碳酸盐缓冲液中使用循环伏安法分析的对硝基苯酚的所述校准曲线。
[0585]
图15c及图15d显示出在-0.070v对于硝基苯酚浓度(图15c)处的所述数个阴极峰及在0.070v对于对硝基苯酚浓度处的所述数个阳极峰(图15d)。使用微碳纤维电极获得的循环伏安法氧化/还原峰来侦测碱性磷酸酶酶促反应的所述基质及产物，已被成功地应用。对硝基苯酚的所述侦测在中等ph条件下(ph＝9.5)成功进行。碱性磷酸酶酶活性的所述产物(对硝基苯酚)在-0.070v及0.070v处具有两个可逆峰，而在相同条件下，所述碱性磷酸酶的所述基质(对硝基苯磷酸)在0.350v及-0.950v处出现不可逆峰。
[0586]
这些研究表明，所提出的电化学方法可以侦测所述酶的基质的所述浓度的所述降低以及所述产物的所述形成，使得这种分析方法为非常可靠的。当仅使用循环伏安法时，所述方法对于对硝基苯酚的所述侦测极限为0.5ppm。重要的是，所述酶产物的所述上升及可逆峰能够简单地侦测所述碱性磷酸酶活性并随着时间监测的信号放大。
[0587]
范例6
[0588]
以数个生物素化硅珠的侦测作为一模型系统
[0589]
数个材料：
[0590]
从nanocs(货号si50u-bn-1)获得每等分试样50μm至10μl的数个生物素化二氧化硅珠(1～5％的水溶液悬浮液)。
[0591]
碱性磷酸酶(ap)-链亲和素(sigma-aldrich)-25等份，在0.1m碳酸盐缓冲液ph 9.5中，含有0.005m mgcl2、0.01m nacl。
[0592]
碱性磷酸酶(ap)基质-4-硝基苯磷酸二钠六水合物(sigma aldrich)-每份200μl，4mg。diw中20毫克/毫升。
[0593]
数个方法：
[0594]
电解质背景溶液是在4ml电化学池中使用不含吐温的一碳酸盐缓冲液制备的，ph＝8.5 25μl ap基质。
[0595]
如以上范例1中所述，一碳纸电极以蒸馏水洗涤并干燥。
[0596]
将2μl ap-链亲和素酶置于所述电极的每一侧。
[0597]
将所述电极浸入所述洗涤缓冲液(不含tween ph 8.5的缓冲碳酸盐)中5秒。
[0598]
数个循环伏安测量使用emstat3系统进行，e
开始
＝-0.5，evertex＝-1.4cv，以记录所述背景电流。
[0599]
然后用蒸馏水洗涤所述电极并干燥。
[0600]
将2μl二氧化硅珠-生物素置于所述电极的每一侧，并将所述电极浸入所述洗涤缓冲液(不含tween ph 8.5的缓冲碳酸盐)中5秒，然后进行干燥。
[0601]
将2μl的所述ap-链亲和素酶置于所述电极的每一侧，并将所述电极浸入所述洗涤缓冲液(不含tween ph 8.5的缓冲碳酸盐)中5秒。
[0602]
数个循环伏安测量使用emstat3系统进行，e
开始
＝-0.5，evertex＝-1.4cv。
[0603]
图16显示出在每次测量中进行的所述循环伏安法的所述第二次扫描。所述橙色图
表示所述背景测量。所述红色曲线代表数个硅胶珠的所述侦测。
[0604]
这些数据证明了所述数个生物素化二氧化硅珠的所述成功侦测，并由此证明了使用所述碱性磷酸酶相关电化学侦测生物素化物质如本文所述吸附到所述电极上的一生物素化适体的所述能力。
[0605]
范例7
[0606]
适体选择
[0607]
使用所述selex方法进行适体选择，其总体呈现在图17中并在上文中进一步详细讨论。在此，所述数个选择周期也被称为“数个轮次”。
[0608]
适体被选择以用于大豆锈菌，更具体地说，用于豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)。
[0609]
在这些研究中使用豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)夏孢子(urediniospores)、黄锈孢子(puccinia striiformis)及棕锈孢子(puccinia triticina,syn.p.recondita)。后两者用于阴性选择(阴性对照)。
[0610]
将这3种类型的孢子悬浮在含有91mm碳酸氢钠、9mm碳酸钠、40mm氯化钾、5mm氯化镁及0.1％的一选择碳酸氢盐缓冲液(cbt1x)ph 9.0中，并在-80℃下储存c在单独的等分试样中，以避免重复冷冻/解冻。在这个阶段，有20份豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)夏孢子(每份约1,255.106个孢子)及32份黄色及棕色锈病孢子的一混合物(每份约1,5.105个孢子)。
[0611]
使用所述选定的寡核苷酸文库针对豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)夏孢子(数个pp孢子)进行所述数个第一轮选择循环。
[0612]
用于所述选择的所述寡核苷酸文库是所述化学合成的nov-aa40n dna文库，其中每个候选者都有一个具有40个核苷酸长的随机区域，每个候选者的5'及3'侧翼有两个相同的区域，分别为24nt及23nt长，对应于所述数个引物(nov-ap5及nov-p3p)的所述数个结合位点。
[0613]
所述数个pp孢子与所述寡核苷酸文库混合。所述样品经过滤并使用所述碳酸氢盐选择缓冲液(cbt 1x)洗涤。
[0614]
数个候选物与所述数个孢子混合，在0.45微米硝化纤维滤器上过滤。通过用选择缓冲液cbt 1x洗涤来去除数个非特异性候选物。
[0615]
通过在数个0.45微米硝酸纤维素滤膜上离心/过滤，并通过离子及温度跳跃(在80℃x650rpm的水中3分钟)洗脱，来收集与pp孢子相关的数个候选物。将含有所述数个感兴趣候选物的所述回收上清液直接进行pcr扩增，从而产生一富集的候选物库。
[0616]
通过琼脂糖凝胶电泳分析所述数个扩增产物。所述电泳图谱显示出(i)所述扩增材料的所述质量(孔中不存在与所述pcr阴性对照相对应的材料)及(ii)所述预期尺寸的一单一条带的所述存在。
[0617]
使用nov-nuc方法从所述数个pcr产物中获得感兴趣的数个单链。通过在一denovix分光光度计上测量260nm处的吸光度来对所述数个单链候选物进行量化。
[0618]
第一轮是用1000皮摩尔的数个候选物进行的，这意味着6x10
14
个不同序列。为了防止数个候选物通过数个静电相互作用与数个孢子发生非特异性结合，在所述选择的步骤中将500皮摩尔的酵母trna添加到每个样品中。进行了八轮选择。驱动进化的所述严格性受目
标数量(从1,255.106到第6轮到6.105个孢子-在第7轮及第8轮)及候选数量(从1000到80皮摩尔)以及洗涤次数(从2到4)与选择缓冲区。在所述数个连续的选择轮次中获得了令人满意的扩增产率：单链数量范围从118皮摩尔(第5轮)到385皮摩尔(第2轮)，其中一部分用于下一轮。
[0619]
对于第7轮及第8轮，在针对数个pp孢子的阳性选择之前，进行了一反选择(cs)步骤以消除与褐锈病或黄锈病孢子(数个byr孢子)结合的数个候选物。所述数个byr孢子与所述选择缓冲液中的所述数个候选物混合。过滤后，含有未被所述数个孢子保留的数个候选物的所述滤液用于针对数个pp孢子的所述正选择步骤。
[0620]
第9轮至第13轮实施的所述程序与第7轮及第8轮所述的程序相似。简而言之，两个选择与(分支a)及不具有(分支b)反选择并行运行。通过将所述数个候选物与所述选择缓冲液中的所述棕色及黄色锈病(byr)孢子混合来进行反选择。过滤后，将含有未被所述数个byr孢子保留的数个候选物的所述滤液用于针对豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)(pp)孢子的所述于阳性选择步骤。对于所述阳性选择候选物，与所述数个pp孔混合并在0.45微米硝酸纤维素过滤器上过滤。通过用cbt 1x选择缓冲液洗涤来消除数个非特异性候选物。通过在0.45微米硝酸纤维素滤膜上离心/过滤收集与数个pp孢子相关的数个候选物，并通过离子及温度跳跃(在80℃x650rpm的水中3分钟)洗脱。
[0621]
在每一轮选择结束时，通过琼脂糖凝胶电泳来所述数个分析扩增产物。
[0622]
在通过所述nov-nuc方法产生数个感兴趣的单链后，将在一给定选择轮次中获得的所述数个pcr产物用于下一轮次。
[0623]
通过在一denovix分光光度计上测量260nm处的吸光度来对所述数个单链候选物进行量化。单链数量从21皮摩尔(第11轮，条件a)到228皮摩尔(第9轮，条件a)不等，其中一部分用于下一轮次。
[0624]
然后，进行了高通量测序(ngs)。对分支a或b的第6轮到第13轮的11个池进行了大规模测序，并与所述原始的nov-aa40n库进行了比较。为此，使用nov-forward引物及用于测序的数个特设接头(nov索引20至33)对数个样品进行pcr扩增。根据供应商的建议，在一miseq standard v2仪器上对第6轮、第7轮至第10a轮及第10b轮、第11terb轮及第13b轮的数个池进行ngs测序。
[0625]
从第6轮到第9轮，收到了从320,000个(r09b)到481,000个(r08b)的数个序列。超过90％的所述数个序列显示出所述预期的长度，包括从第6轮到第8轮(a及b)。但全长产物在第9轮仅占65％至70％，仅占第11轮的几个百分比。所述生物信息学分析仅限于数个池r6到r10(a及b)，总共产生大约340万个独特序列。
[0626]
一池中的一序列显着存在的所述阈值固定为0.01％。在所述阈值范围内侦测到大约2,900个序列，并以一编辑距离为8(一给定簇的2个序列之间的所述差异应小于8nt超过40nt)来将其分组在簇中。在分支a及分支b中观察到类似的演变，并且在某些位置也观察到一明显的富集(数据未显示)。
[0627]
在第10轮时，一些簇约占总池的5％。这些簇中的一些表现出许多g残基，并假定采用一四链体结构，如下文进一步讨论的。
[0628]
下面的表1显示出第10a轮及第10b轮(从左到右的5'到3')中数个最丰富的簇的所述数个序列，以及它们的序列识别号(seq id nos)。
[0629]
表1
[0630][0631]
下面的表2列出了基于所述数个ngs结果的生物信息学分析(第11轮的频率及分支a及分支b的进化因子)所确定的11个序列，这是对于所述数个选择的候选者，包括5'及3'固定区域：
[0632]
分别为
[0633]5’
agcctgttgtgagcctcctgtcgaa(seq id no:19)；及
[0634]3’
ttgagcgtttattcttgtctccc(seq id no:20)。
[0635]
表2
[0636]
[0637][0638]
(表2；连续)
[0639]
表2中显示的所述数个序列是全长合成的，包括所述数个侧翼固定区域，并在反相柱上纯化。它们由聚丙烯酰胺凝胶上的电泳控制，其中迁移为一单一条带(数据未显示)。
[0640]
然后通过荧光来监测豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)夏孢子(urediniospores)与这些候选物的结合。合成了与所述5'固定区互补的一18聚体寡脱氧核苷酸，其3'末端带有一荧光素残基。所述5'ggaggctcacaacaggct-fam锚定物(seq id no:37)显示出与每个候选物形成一稳定的双链体。
[0641]
所述数个pp孢子(105个颗粒)与所述数个候选物(1μm)及所述锚定物(500nm)在所述选择cbt 1x缓冲液(ph 9.0)中混合。在0.45微米硝化纤维滤膜上过滤后，测量了所述滤液的荧光，其中所述滤液含有未被所述数个孢子保留的锚定物及数个候选物。然后在一离子及温度跳跃(在80℃x650rpm的水中3分钟)并在0.45微米硝酸纤维素过滤器上过滤后，收集了与数个pp孢子相关的数个候选物。所述第一分数对应于不被所述数个孢子保留的所述数个锚定候选物复合物，而所述第二分数包含在洗脱前与所述数个pp孢子结合的所述数个候选物。所述数个结果表示于图18a中。可以看出，单独的所述锚定物不与所述数个孢子结合。对于所有候选物，在所述洗脱级分数中侦测到一显着的荧光信号。
[0642]
使用用于负选择的数个孢子(“bt06 m215”及“战士”孢子的混合物)进行了类似的实验。所述数个结果表示于图18b中，并且表示出不具有侦测到任何所述候选物的显着结合，指示出与豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)夏孢子(urediniospores)的所述相互作用是特异性的。
[0643]
mfold预测的所述二级结构显示出几乎所有这些候选物的一大型富g环(数据未显示)。这些g残基的所述分布(4个2g至5g块由一小段核苷酸隔开，通常是一单一t)强烈表示出所述区域采用一四链体结构。图19显示出这种四链体结构的一示意图，如果由所述候选sp00的所述区域t(50)-t(66)形成(seq id no：8)。
[0644]
表2中呈现的所述数个适体的所述富含g区域的所述序列显示在下面的表3中。指
示出了g分数。所述“区域”列中的所述数个数字是指所述全长适体(参见表2)。几个候选者显示出相同的序列5'g4tg3tg3tg2，在表3中划线。所有这些寡核苷酸的特点是一高g4分数。
[0645]
表3
[0646][0647][0648]
sp02(seq id no:10)被选择以作为这些适体的一代表，以进行进一步评估，连同其中所述环连接残基是cs而不是ts的sp13(seq id no:15)(参见表3中突出显示的数个序列)。
[0649]
这些适体的所述预测mfold二级结构显示在图20a及图20b中。
[0650]
基于所述数个预测的双链区域及数个内部环，产生了sp02(seq id no:10)的4个截短变体及sp13(seq id no:11)的一个截短变体，均保留了所述富含g的部分。这些寡核苷酸的序列列于表4中。所述编号是指所述亲本适体(seq id no：10或15)中的所述截断位点。
[0651]
表4
[0652][0653]
所述数个寡核苷酸通过反相hplc合成及纯化，并通过一聚丙烯酰胺凝胶上的电泳进行控制。除了包含一较短污染物的sp02 19至46(数据未显示)之外，所有低聚物在所述给定其尺寸(20nt至59nt)的所述预期位置作为一单一条带迁移。
[0654]
通过荧光来测试5个适体变体与豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)(pp)的所述结合。所述数个pp孢子(105个颗粒)与所述德克萨斯红(tr)共轭的数个寡核苷酸(1μm)在所述选择缓冲液cbt 1x(ph 9.0)中混合。在数个硝化纤维滤器上过滤后，测量了含有未被所述数个孢子保留的数个候选物的所述滤液的荧光。然后在离子及温度跳跃(在80℃x650rpm的水中3分钟)后释放与数个pp孢子相关的数个候选物，并在过滤后测量溶液的荧光。
[0655]
图21显示出通过荧光测量(λexc：585nm；λem：635nm)评估的与数个pp孢子相关的数个适体变体的所述分数。在所使用的条件下，5％到8％的所述不同低聚物与所述数个pp孢子相关联。这些数据表示出，连续缺失一个或两个内部环并不会阻止所述适体与所述孢子的所述结合，并且表示出所述数个选择的适体与数个pp孢子的所述结合位点位于所述富含g的区域，并且所述四链体基序5'gaa-ggg-gtg-ggt-ggg-tgg-ac(sp0223-42；seq id:35)足以建立所述关联。
[0656]
范例8
[0657]
铁锈孢子与白粉病的顺序感应
[0658]
使用如以上范例7中鉴定的一适体，在含有数个锈孢子(phakopsora pachyrhizi)
夏孢子(urediniospores)上采用以上范例4中描述的所述方法，与用作对照的含有白粉病的一空气样品(其不应结合所述选择性适体)相比。
[0659]
使用具有seq is no:17(参见表2，sp015)的所述适体。
[0660]
使用4ml上文所述的选择缓冲液(不含ph＝9.0)以及25μl碱性磷酸酶-酶基质的一溶液，在0.1m碳酸盐缓冲液(ph 9.5及并具有0.005m氯化镁、0.01m氯化钠)中，以作为所述电化学侦测的一背景溶液。
[0661]
所述碱性磷酸酶-酶基质是对硝基苯基磷酸酯。
[0662]
数个测量在一4ml电化学电池中进行，其中所述4ml电化学电池具有ag/agcl参考电极。
[0663]
使用一干净的层压碳纸电极(0.35cm2，直径0.18mm)作为所述工作电极，用双离子水(diw)清洗并晾干。
[0664]
使用例如图2a至2b中所示的一便携式泵，抽吸带有或不带有所述数个孢子的数个空气样品。所述空气采样器能够每分钟抽取10升空气。所述空气采样装置由数个可充电电池(重量为1.5kg)供电。抽气进行一分钟。
[0665]
不具有数个孢子的空气样品作为所述背景，其中实验室空气在相同条件下被抽吸。
[0666]
将所述选择适体的一400μm溶液(总数量为100nmole，88个碱基，hplc，5'生物素标记，在0.1m碳酸盐缓冲液(ph 9.5，含有0.005m mgcl2及0.01m nacl)中的2μl，放在一电极的一侧(所述吸附侧)1分钟，然后将所述电极浸入上述碳酸盐缓冲液中5秒钟。
[0667]
然后，将一碱性磷酸酶-链亲和素酶在一0.1m碳酸盐缓冲液(ph 9.5的含0.005m mgcl2及0.01m nacl)中的一1mg/ml溶液中的2μl放置在所述电极的所述同一侧，所述适体沉积在所述电极上。
[0668]
然后将所述电极在上述洗涤缓冲液中浸渍5秒钟，然后将其组装在带有一ag/agcl参考电极及一电解质溶液中的一电化学电池中，所述电解质溶液含有在diw中的4ml 0.1m碳酸盐缓冲液(ph 9.5，含有0.005m mgcl2、0.01m nacl)中的所述述碱性磷酸酶基质的一20mg/mol溶液中的25μl。
[0669]
然后进行数个循环伏安测量(ebegin＝-0.0，evertex1＝-0.8，evertex2＝0.5，扫描速率为0.1v/s，3个周期)。
[0670]
此后用去离子水清洗所述电极，使其干燥，并再次用于抽气一选择的样品，以防所述样品不含所述锈菌。在所述第二个循环中获得的所述数据呈现在图22中，并清楚地显示出所述数个锈孢子的一连续及选择性侦测。
[0671]
尽管已经结合其数个特定实施例描述了本发明，但很明显，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改及改变将是显而易见的。因此，其意图包括落入所附权利要求的所述精神及广泛范围内的所有此类替代、修改及改变。
[0672]
本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请案均通过引用整体并入本说明书中，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请案被具体地及单独地指示出为通过引用并入本文中一样。此外，本技术中对任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。就使用数个章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。此外，本技术的任何优先权文件通过引用以其整体并入本文。
[0673]
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