CE-SDS方法优化及其在抗体纯度检测中的应用与流程

ce-sds方法优化及其在抗体纯度检测中的应用
技术领域
1.本方法涉及生物技术领域，具体涉及一种优化的ce-sds纯度检测方法及其在单克隆抗体纯度检测中的应用。


背景技术：

2.抗体纯度是抗体生产过程中的重要指标，sec-hplc(分子筛排阻层析高效液相色谱)和ce-sds(十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳)是目前最常用于纯度检测的两种方法。其中，sec-hplc是检测抗体在非还原非变性条件下的纯度，具有高通量、重复性好等优点；考虑到抗体本身是由两条重链和两条轻链组成的异源四聚体，只凭借sec-hplc的方法无法对抗体结构的完整性作出准确判断，因此，ce-sds在近几年也被广泛应用于抗体纯度的检测。
3.ce-sds是一种在变性条件下检测抗体纯度的方法，方法原理与sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)类似，但与sds-page相比，ce-sds利用毛细管电泳进行样品的分离，并通过将荧光染料加入样品中进行分析检测，因此具有上样量小、通量大、分辨率高、可精确定量等优点。
4.目前市面上商业化的ce-sds试剂盒和芯片主要针对普通蛋白质进行的开发，其试剂浓度和处理方法并不能完全适用于单克隆抗体的检测，因此优化ce-sds检测方法使之更加适用于单克隆抗体的检测具有重要的意义，是单克隆抗体制备和分析重要的辅助手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种优化的ce-sds纯度检测方法，使之能够普遍应用于单克隆抗体纯度检测。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
7.一种优化的ce-sds纯度检测方法，包括如下步骤：
8.步骤1.样品处理液的配置：分别配置非还原样品处理液(a1)和还原样品处理液(a2)；所述非还原样品处理液(a1)为：20μl样品缓冲液与2μl iam储液和1μl sds储液混合；所述还原样品处理液(a2)为：20μl样品缓冲液与1.2μl dtt储液混合；所述样品缓冲液为ht protein express sample buffer，perkinelmer
‑‑
cls920003。
9.较佳的，所述iam储液浓度为0.5m，储存体积为每管50-100μl，储存温度为-40℃，保质期3个月。
10.较佳的，所述sds储液浓度为10％(w/v)，储存体积为每管50-100μl，储存温度为室温25℃，保质期3个月。
11.较佳的，所述dtt储液浓度为1m，储存体积为每管50-100μl，储存温度为-40℃，保质期3个月。
12.较佳的，上述iam、sds和dtt储液均使用去离子水进行溶解和配置，并使用0.22μm滤膜进行过滤处理；
13.较佳的，上述分装的iam、sds和dtt储液每次检测各取用一管，每管仅使用一次，不
得重复使用。
14.步骤2.将样品处理液与样品混合，具体包括以下步骤：
15.1).混合成非还原样品(b1)：将21μl非还原处理液(a1)与3μl抗体溶液混合；
16.2).混合成还原样品(b2)：将21μl还原处理液(a2)与3μl抗体溶液混合。
17.较佳的，上述抗体可为任意单克隆抗体，包括单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、纳米抗体和抗体融合蛋白中的一种或多种。
18.较佳的，上述抗体溶液浓度为1mg/ml～2mg/ml。
19.较佳的，上述抗体溶液溶剂可为任意常见抗体溶液溶剂；优选所述溶剂为磷酸缓冲液pbs。
20.较佳的，上述抗体溶液浓度高于2mg/ml，使用pbs进行样品稀释到1mg/ml～2mg/ml。
21.步骤3.加热处理混合样品b1和b2；优选75℃金属浴或水浴锅加热处理混合样品，加热处理时间为10分钟或15分钟。
22.(c1)非还原样品：75℃金属浴或水浴锅加热处理；
23.(c2)还原样品：75℃金属浴或水浴锅加热处理。
24.步骤4.加热样品的稀释：将步骤3中加热处理过的混合样品b1和b2中分别加入去离子水，优选24μl加热处理过的混合样品中加入45μl去离子水。
25.(d1)非还原样品：24μl样品混合液(c1)中加入45μl去离子水；
26.(d2)还原样品：24μl样品混合液(c2)中加入45μl去离子水。
27.进一步的，本发明最终提供了ce-sds检测中各试剂工作浓度，具体如下所示：：
28.1.iam工作浓度为步骤2中非还原样品(b1)中浓度，具体浓度为38mm；
29.2.sds工作浓度为步骤2中非还原样品(b1)中浓度，具体浓度为0.76％；
30.3.dtt工作浓度为步骤2中还原样品(b2)中浓度，具体浓度为49mm；
31.4.sds工作浓度为步骤2中还原样品(b2)中浓度，具体浓度为0.41％。
32.进一步的，本发明最终提供了ce-sds检测中单克隆抗体工作浓度，具体如下所示：
33.1.单克隆抗体处理浓度为步骤2中(b1)和(b2)样品中浓度，具体浓度为0.125mg/ml～0.25mg/ml；
34.2.单克隆抗体检测浓度为步骤4中(d1)和(d2)样品中浓度，具体浓度为0.043mg/ml～0.086mg/ml。
35.本发明方法中iam作用是封闭抗体分子中未配对成功的半胱氨酸，防止加热或其他操作过程中未配对成功的半胱氨酸形成分子间二硫键，进而影响检测结果。
36.本发明方法中sds的作用是使抗体分子变性，使抗体在电泳分离过程中不受自身携带电荷和形状的影响，按照分子量大小进行分离。
37.本发明方法中dtt的作用破坏抗体分子中的二硫键，使抗体分子重链与重链之间、重链与轻链之间的二硫键打开，达到还原状态下同时检测到抗体分子重链和轻链的目的。
38.本发明的优点是：
39.1.本发明方法对单克隆抗体纯度的检测具有重复性好、准确度高，操作方便等优点，其中非还原状态下单克隆抗体峰型稳定，重复性好，适合进行抗体分子纯度的定量分析。
40.2.在非还原状态下单克隆抗体不存在大分子量的杂峰，说明加入iam有效地封闭了未正常配对的二硫键，避免了加热或其他操作产生二硫键等副产物的影响。
41.3.抗体分子还原状态下不存在非还原的杂峰，说明抗体分子中的二硫键已经完全打开，重链和轻链峰型稳定，纯度定量结果更准确；综上，本发明方法适配于单克隆抗体的纯度检测，对于单克隆抗体生产和制备过程的分析和质量控制具有重要意义。
附图说明
42.图1为ce-sds商业化方法单克隆抗体mab1的荧光检测图谱，如图所示，a图为非还原条件下单克隆抗体的荧光检测图谱，可见样品峰不对称，存在明显肩峰和其他大分子量杂峰，说明抗体分子未变性完全。b图为还原条件下单克隆抗体的荧光检测图谱，可见未还原完全的杂峰出现在32-33秒之间。
43.图2为ce-sds优化方法针对单克隆抗体mab1的荧光检测图谱；如图所示，a图为非还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱，可见样品峰型稳定对称，大分子量杂峰消除。b图为还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱，可见图1中杂峰已消除。
44.图3为ce-sds优化方法检测糖基化抗体mab1和非糖基化抗体mab2荧光图谱；如图所示，a图为非还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱，黑色实线为糖基化抗体，灰色实线为非糖基化抗体。b图为还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱黑色实线为糖基化抗体，灰色实线为非糖基化抗体。
具体实施方式
45.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
46.本发明中使用的ce-sds商业化试剂盒为ht protein express reagent kit，货号为perkinelmer-760499；本发明中使用的ce-sds检测芯片为ht protein express labchip system，货号为perkinelmer-cls96000；本发明使用样品板为hard-shell pcr plate-96，货号为perkinelmer-6008870；本发明使用封板膜为clearseal film，货号为hampton research-hr4-521；本发明ce-sds检测仪器为labchip gx ii touch ht(perkinelmer)；iam试剂购买自sigma公司，货号为i6125；sds试剂购买自sigma公司，货号为l3771；dtt试剂购买自sigma公司，货号为d0632；pbs试剂购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为g701ka6101。
47.实施例1、ce-sds商业化方法和本发明方法对单克隆抗体mab1的纯度检测
48.一、iam、sds和dtt储液配置
49.1、iam储液配置：称取1.85g iam粉末于50ml离心管中，加入去离子水溶解后定容至20ml，终浓度为0.5m，使用0.22μm滤膜过滤，分装50μl每管于1.5ml离心管中，保存在-40℃冰箱中；
50.2、sds储液配置：称取2g sds粉末于50ml离心管中，加入去离子水溶解后定容至20ml，终浓度为10％(w/v)，使用0.22μm滤膜过滤，分装50μl每管于1.5ml离心管中，保存在室温25℃；
51.3、dtt储液配置：称取3.085g dtt粉末加入去离子水溶解后定容至20ml，终浓度为1m，使用0.22μm滤膜过滤，分装50μl每管于1.5ml离心管中，保存在-40℃冰箱中。
52.二、ce-sds优化方法单克隆抗体非还原样品和还原样品配置
53.1、非还原样品处理液配置：20μl样品缓冲液(ht protein express sample buffer，perkinelmer
‑‑
cls920003)与2μl 0.5m iam储液和1μl 10％sds储液混合；
54.2、还原样品处理液配置：20μl样品缓冲液(ht protein express sample buffer，perkinelmer
‑‑
cls920003)与1.2μl 1m dtt储液混合；
55.3、非还原样品配置：21μl步骤1所得非还原样品处理液与3μl浓度为1mg/ml的单克隆抗体混合于1.5ml离心管；
56.4、还原样品配置：21μl步骤2所得还原样品处理液与3μl浓度为1mg/ml的单克隆抗体mab1混合于1.5ml离心管；
57.5、步骤3和4两管样品置于75℃金属浴中加热处理15分钟；
58.6、步骤5加热后样品12000rpm离心3分钟使样品均匀集中于离心管底部；
59.7、步骤6处理样品中分别加入45μl去离子水，振荡器振荡混匀10秒。
60.三、商业化ce-sds方法单克隆抗体非还原样品和还原样品配置
61.按照供应商提供的说明书进行非还原样品和还原样品的配置。
62.四、ladder和sample wash buffer准备
63.1、按照供应商提供的说明书进行ladder的配置；
64.2、按照供应商提供的说明书进行sample wash buffer准备。
65.五、labchip芯片压胶
66.1、使用去离子水清洗芯片三遍，并将芯片置于仪器中，点击“wash”进行芯片清洗；
67.2、按照供应商提供的说明书配置destain solution和gel-dye solution，并加入到芯片中；
68.3、将芯片放入仪器中，点击“prime”进行压胶操作。
69.六、上样
70.1、步骤三制备的样品，进行12000rpm高速离心3分钟，以去除样品中残留的气泡或不溶杂质；
71.2、取40μl步骤1制备样品分别加入样品板中；
72.3、所有样品加入后使用clearseal film封板，3000rpm离心5分钟，使样品均匀铺满样品板底部，并去除加样时产生的气泡；
73.4、揭去封板膜，将步骤四-1配置ladder和样品板放入仪器对应位置；
74.5、点击“run”进行样品检测。
75.七、数据分析
76.使用仪器自带软件(labchip gx reviewer，v5.5.2313.0)进行单克隆抗体非还原状态和还原状态下的纯度分析。
77.商业化ce-sds方法对单克隆抗体纯度分析的结果如图1所示，其中a图为非还原条件下单克隆抗体的荧光检测图谱，可见样品峰不对称，存在明显肩峰现象，说明样品在非还原条件下可能存在变性不完全问题；b图为还原条件下该抗体的荧光检测图谱，可见未还原完全的杂峰出现在32-33秒之间，比例为0.08％，说明样品在还原条件下可能未能实现完全
还原，造成抗体分子内部二硫键没有全部还原。
78.图2为ce-sds优化方法针对同一单克隆抗体的荧光检测图谱；如图所示，a图为非还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱，可见样品峰型稳定对称，不存在肩峰现象，说明样品在非还原条件下变性完全且稳定存在；b图为还原条件下单克隆抗体分子荧光图谱，可见图1中32-33秒之间的杂峰已消除，说明本专利的优化条件可改善样品未完全还原的问题。
79.实施例2、应用本发明优化的ce-sds检测方法对单克隆抗体mab1分子进行重复纯度检测
80.参照实施例1详细阐述的优化方法针对单克隆抗体mab1分子分别在不同时间进行了10次重复检测；
81.结果如表1所示，检测样品在非还原状态和还原状态下纯度分析的标准方差均≤1.0，结果一致性好，可见本发明的优化检测方法稳定性高、重复性好，可以高效高质地应用于单克隆抗体分子的检测。
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表1
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实施例3、糖基化抗体mab1和非糖基化抗体mab2纯度检测
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参照实施例1的优化方法，针对糖基化的单克隆抗体和非糖基化的单克隆抗体同时进行了处理和检测；
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结果如图3所示，糖基化抗体相较非糖基化抗体非还原状态下出峰时间晚约1秒，还原状态下糖基化重链较非糖基化重链出峰时间晚0.5-0.6秒；理论上糖基化抗体和非糖基化抗体非还原状态下分子量差别在6～10kda，还原状态下分子量差别在3～5kda，可见本发明优化的ce-sds检测方法可以对分子量差别在3～5kda左右的单克隆抗体分子进行有效分离鉴定，说明本发明方法具备分辨率高、准确度高等优点。