呈现长期稳定性的褪黑素注射剂的持久制剂

1.本发明包括在医学和药学领域，并且涉及稳定性较高的、可注射的褪黑素组合物。本发明还涉及 将所述组合物用作药品并且涉及其在各种病症，比如败血症的治疗中的用途。


背景技术：

2.褪黑素(n-乙酰基-5-甲氧基色胺)是由松果腺(松果体)通过生理作用产生的内源性神经激素。 其分泌速率遵循与亮-暗周期有关联的昼夜节律，并且其在诱导睡眠中起到基本作用。此外，已经发 现褪黑素在炎症反应调节中起到基本作用，因为其用作如下期间产生的氧自由基的有效清除剂：例如， 在败血症和全身炎症反应综合征(sirs)的后续发展以及后续的多器官功能障碍综合征(mods， 也称为多器官功能衰竭)期间；在心肌梗塞期间；在线粒体损伤中；在腹部手术过程中；在肺水肿中； 和在肾或肝衰竭中。
3.已知除了其它功能以外，激活抗氧化酶途径(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽 还原酶)(reiter et al.1995.j pineal res 18:1-11)能调节线粒体稳态(et al.2011. curr top med chem 11:221-240)，降低循环的多形核白细胞的总量和血清丙二醛的水平(gitto et al., 2004.j pediatr surg 39:184)，调节单核细胞、nk和细胞因子的产生，以及抑制细胞凋亡(mundigleret al.,2002.crit care med 30:536-40；carrillo-vico et al.2005.j pineal res 39:400-408)，并且能降 低杜氏肌萎缩症(duchenne muscular dystrophy)患者的促炎细胞因子水平和氧化损伤(chahbouni etal.2010,j pineal res 48:282-289)。还已经发现，在败血症危重患者中褪黑素的昼夜节律被扰乱， 而未患败血症的患者保持褪黑素的内源性分泌。
4.已经在不同的病理学中证明了其治疗用途(s
á
nchez-barcel
ó
et al.2010,curr med chem17:2070-2095)，其中一般规则显示在给药后缺乏毒性(et al.2014.cell mol lifesci doi:10.1007/s00018-014-1579-2)。因此，通常作为睡眠-觉醒周期的调节剂(mohan andbrunner,2005.acta anaesthesiol scand 49:1397)，它已成功地用于治疗癫痫(molina-carballo et al., 1997.j pineal res 23:97-105)，以及用于进入重症监护病房的患者(mohan and brunner,2005.actaanaesthesiol scand 49:1397)。其在患有败血症的新生儿中的静脉内使用导致死亡率的显着下降而没 有副作用(gitto et al.,2004.j pediatrsurg 39:184)。在这种情况下，使用乙醇：水组合物(1:50)通 过静脉内施用褪黑素。还已经证明在急性心肌梗塞后具有心脏保护作用(k
ücü
kakin et al.,2008.jpineal res 44:426-31)。已经证明了其降低手术期间由侵入性手术诱导的炎症反应和氧化应激的能力 以及当通过静脉内施用不同剂量时，其安全性、功效和副作用的缺乏(k
ücü
kakin et al.,2009.j surgres 152:338-347；naguib et al.,2001.british j anaesth 90:504-507)。在最后的参考文献中，服用 褪黑素所用的载体是水、丙二醇(ppg)和1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)的2:1:1混合物。然而，在 这种情况下，广泛使用的溶剂40nmp对于使水不溶性褪黑素溶解似乎是必需的。然而，现在，使用 nmp作为药物载体因其
生殖毒性而引起问题。
5.因此，考虑到褪黑素给药的效果、功效和安全性的结果和科学证据，需要产生呈现长期稳定性并 因此允许储存的改进的褪黑素组合物。
6.在这方面，国际专利申请wo2012/156565公开了包含10mg/ml丙二醇的“稳定的”水性褪黑 素组合物。该水性组合物在制备后3个月内是稳定的，但是在制备后6个月，观察到以下特性：
[0007]-高压灭菌的和未高压灭菌的处于室温的制剂都具有浅黄色外观，这可能是褪黑素氧化的结果。
[0008]-高压灭菌的和未高压灭菌的处于4℃的制剂都结晶，并且在室温下不完全重悬。
[0009]-高压灭菌的和未高压灭菌的处于-20℃的制剂都是混浊的，并且当将制剂置于室温时，没有成功 地消除该混浊。
[0010]
因此，鉴于专利申请wo2012/156565中描述的在所有储存条件下缺乏长期稳定性，这种制剂不 允许超过3个月的储存期。为此，仍然需要生产呈现长期稳定性并因此允许储存超过3个月的改进 的褪黑素组合物。


技术实现要素：

[0011]
发明人已经开发了一种呈现惊人的长期稳定性并允许高浓度的所述水不溶性活性成分的水性褪 黑素组合物。所述组合物的性质使其可用作注射剂，例如用于静脉内给药。
[0012]
因此，本发明的第一方面涉及包含丙二醇、聚乙二醇、和褪黑素或其衍生物、盐、前药或溶剂化 物的组合物，聚乙二醇也称为聚(氧-1,2-乙炔二基)、α-氢-ω-羟基、peg、碳蜡(carbowax)、聚 (环氧乙烷)、聚氧化乙烯、聚环氧乙烷或聚乙二醇(macrogol)。这类组合物适于制备可用于例如 静脉内给药的可注射的褪黑素组合物。在本发明第一方面的优选实施例中，这类组合物被冻干。
[0013]
可以使用适于可通过肌内、皮下或静脉内注射的制剂的任何聚乙二醇(下文中称为peg)实施 本发明。peg的分子量优选为200至600原子质量单位(amu)，并且更优选400amu(peg 400)。 peg(聚乙二醇)是工业上广泛使用的聚醚，并且用以下通式表示：
[0014]
ho-(ch2-ch2-o-)n-h.
[0015]
其也被称为“macrogol”，因此peg400也可以被描述为macrogol 400，并且在制药工业中作 为滴剂、可注射溶液、人造泪液、明胶胶囊等的组分。
[0016]
不同类型的peg之间的分子量差异意味着除了给该聚乙二醇类型提供“姓”之外，它们对水具 有不同的表现和亲和力。例如，peg400是吸湿性接近pg的高吸湿性的无色粘性液体，而peg 6000 是具有蜡质外观和低吸湿性的固体物质。
[0017]
它们都具有低毒性，例如peg400ld 50为约30g/kg(对大鼠口服给药)。如果将结果外推， 对于体重为70kg的人，毒性剂量为2100g。这些特性使得peg或聚乙二醇可理想地用作本发明的 溶液的基础材料。
[0018]
本发明的第二方面涉及包含水或盐水溶液、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、盐、前药或 溶剂化物的组合物。
[0019]
本发明的第三方面涉及本发明的第一或第二方面中任一方面所述的组合物在药
品的制备中的用 途。
[0020]
本发明的第四方面涉及本发明的第一或第二方面中任一方面描述的组合物用作药品或用于治疗。
[0021]
本发明的第五方面涉及本发明的第一或第二方面中任一方面所述的组合物在药品的制备中的用 途，所述药品用于人类受试者的昼夜节律调节的治疗、炎症反应调节、全身炎症反应综合征(sirs) 的治疗、多器官功能障碍综合征(mods)的治疗、新生儿和儿童败血症的治疗、成人败血症的治疗、 心肌梗塞的治疗、线粒体损伤的治疗、肺水肿的治疗、肾或肝衰竭的治疗、或手术期间，特别是腹部 手术期间产生的氧化应激状态的治疗。
[0022]
关于本发明第五方面的可替换方面涉及本发明的第一或第二方面中任一方面描述的组合物人类 受试者的昼夜节律调节、炎症反应调节、全身炎症反应综合征(sirs)的治疗、多器官功能障碍综 合征(mods)的治疗、新生儿和儿童败血症的治疗、成人败血症的治疗、心肌梗塞的治疗、线粒体 损伤的治疗、肺水肿的治疗、肾或肝衰竭的治疗、或手术期间，特别是腹部手术期间产生的氧化应激 状态的治疗。
[0023]
在本发明背景下，成年人被认为是18岁或更大的患者。新生儿通常被认为是0至27天龄的患 者，婴儿被认为是28天至23个月大的患者，儿童被认为是24个月至11岁的患者，青少年被认为 是12至17岁的患者。虽然重量和剂量之间存在相关性，但所述相关性不总是线性的和必须针对每 组患者进行识别。
[0024]
本发明的组合物(参见本发明的第一或第二方面的组合物)使用标准方法制备，例如在西班牙和 美国药典和类似参考文献中描述或提及的那些。
[0025]
第六方面涉及本发明组合物的制备，其包括混合水、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、盐、 前药或溶剂化物、它们的盐、前药、衍生物或溶剂化物。
具体实施方式
[0026]
发明人已经发现，在不补充使用共溶剂(许多共溶剂是潜在有毒的，例如乙醇或nmp)的情况 下，单独的丙二醇(ppg)在溶解褪黑素方面是有效的；然而，单独的ppg不能产生呈现长期稳定 性的褪黑素组合物。在这个意义上，发明人已经发现补充有聚乙二醇的ppg多么惊人地不仅溶解褪 黑素而且产生呈现长期稳定性的组合物。
[0027]
因此，本发明的第一方面涉及一种组合物，其适合与水或盐水溶液组合并用于制备包含丙二醇、 聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、盐、前药或溶剂化物的可注射的褪黑素组合物。在本发明该方面的 优选实施例中，本发明第一方面的组合物的每种组分的浓度必须能够获得本发明第二方面中限定的任 何可注射组合物。
[0028]
在本发明第一方面的另一优选实施例中，组合物被冻干并且包含适当比例的下列各组分：丙二醇、 聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、盐、前药或溶剂化物，以便一旦再水化，能够获得本发明的第二方面 中限定的任何可注射组合物。
[0029]
本发明的第二方面涉及药学上可接受的可注射溶液形式的组合物，所述组合物包含水或盐水溶 液、丙二醇、聚乙二醇和褪黑素或其衍生物、盐、前药或溶剂化物。
[0030]
根据本发明第二方面的优选实施例，所述可注射组合物或溶液包含：
[0031]-每100ml总溶液5～50克(w/v)，优选每100ml总溶液10～30克(w/v)，更优选每100ml 总溶液约20克丙二醇(w/v)；
[0032]-每100ml总溶液5至50克(w/v)，优选每100ml总溶液20～40克(w/v)，更优选每100ml 总溶液约30克聚乙二醇(w/v)；
[0033]-每100ml总溶液0.1～30克(w/v)，优选每100ml总溶液0.3～30克(w/v)，更优选每100ml 总溶液0.3～20克(w/v)，更优选每100毫升总溶液0.3～10克(w/v)，更优选每100毫升总溶液 0.3～2克(w/v)，更优选每100ml总溶液0.3～1g(w/v)，更优选每100ml总溶液0.3～0.8g(w/v)， 甚至更优选每100ml总溶液约0.6g褪黑素；以及
[0034]-足量的水或盐水溶液。
[0035]
因此，本发明第二方面中所述的组合物惊人地允许高负荷的且同时稳定的褪黑素，因为已经发现 在本发明中使用相对低浓度的丙二醇(ppg)，褪黑素明显溶解，从而降低了可表现为施用高浓度 ppg的副作用的刺激或疼痛的风险。因此，可以施用高剂量的褪黑素，而不同时施用大量的丙二醇 (在非常高的剂量下可以具有毒性作用)，并且在任何情况下降低副作用的风险。
[0036]
本发明的第一或第二方面中任一方面的组合物还可以包含其它药学上可接受的赋形剂。根据 emea的定义，赋形剂被认为是组合物中除活性成分之外的任何组分。可用于组合物的可注射组合 物中的赋形剂的例子包括抗菌性防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例 如焦亚硫酸钠、没食子酸丙酯；稳定剂和悬浮剂，例如改性的可溶或可溶胀纤维素，例如，羧甲基纤 维素钠(aquasorb,blanose,nymcel)；张力剂，例如氯化钠；或增溶剂，例如丙二醇或聚乙二醇。这 些赋形剂必须在本发明定义的范围内。
[0037]
根据本发明，“药学上可接受的”组合物或其组分表明它们是生理上可耐受的，并且当对人进行 给药时，其给药导致过敏、副作用、不良事件或其他类似反应例如胃病，头晕等的风险低。优选地， 如本文所使用的表述“药学上可接受的”是指其已经被州或联邦政府的管理机构批准，或者其列举在 美国药典或其他公认的药典中，用于动物，以及更具体地用于人类中。因此，本发明的组合物是无 热原的。
[0038]
本发明的组合物包括褪黑素，以及其衍生物、盐、前药或溶剂化物。例如，通过常规化学方法， 通常通过使褪黑素与合适的酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应，从而由褪黑素合成药 学上可接受的盐。通常优选非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。酸加成盐的例子包 括矿物酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐；和有机酸加成盐， 例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、 甲烷磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
[0039]
在本技术中使用的术语“前药”在本文中定义为意指经历化学衍生化的化学化合物(例如在给药 至受试者之后，提供活性化合物自身的活性化合物的酯、醚或酰胺衍生物)，化学衍生化为例如取代 或添加另外的化学基团以改变(用于药物用途)其任何物理化学性质，例如溶解度或生物利用度。本 领域技术人员已知用于制备给定活性化合物的前药的公知方法的例子，并且所述方法可见于例如 krogsgaard-larsen et al.,textbook of drug design and discovery,taylor&francis(2002年4月)。
[0040]
特别优选的前药是当将化合物给药至患者时，增加本发明化合物的生物利用度(例如，允许口服 给药的化合物更容易被吸收到血液中)，或相对于原物种改进原化合物向生物隔室(例如，脑或淋巴 系统)的递送的那些化合物。
[0041]
根据本发明，术语“溶剂化物”必须理解为是指具有通过非共价键结合的另一分子
(最可能是极 性溶剂)的任何形式的根据本发明的褪黑素。这种溶剂化物的例子包括水合物和醇化物，例如甲醇 化物。盐、溶剂化物和前药的制备可以通过本领域已知的方法实施。必须注意，非药学上可接受的 盐、溶剂化物或前药也在本发明的范围内，因为它们可用于制备药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
[0042]
本领域已知同样包括在本发明中的各种褪黑素衍生物。根据具体实施例，根据式(i)定义褪黑 素衍生物、其盐、前药或溶剂化物
[0043][0044]
其中，
[0045]
n是选自1、2、3和4的整数；
[0046]
r1和r3独立地选自直链或支链c
1-c4烷基；以及
[0047]
r2选自氢、直链或支链c
1-c4烷基、-c(＝o)o-ra和-c(＝o)-n(h)-ra，其中ra是直链或支链c
1-c4烷基。
[0048]
在具体实施例中，本发明的组合物可通过静脉内注射。一个具体方面包括在本发明的组合物中 存在第二药品。所述第二药品可以是组合物的一部分或者可以作为单独的组合物提供，用于在相同 时间或在不同时间给药。
[0049]
通常，本发明的组合物，以及褪黑素的“治疗有效量”将取决于各种因素，诸如所治疗的病症的 严重性、患者的性别、年龄或体重，以及其他因素。例如，本发明的组合物可在每天一次或多次以 标准总日剂量0.1～1000mg/kg/天的范围内服用。
[0050]
本发明涉及褪黑素、其盐、前药、衍生物或溶剂化物在药品的制备中的用途，该药品用于在人或 动物诸如败血症的治疗过程、用于全身炎症反应综合征(sirs)的治疗或用于多器官功能障碍综合 征(mods)的治疗、心肌梗塞的治疗、线粒体损伤的治疗、肺水肿的治疗、肾或肝衰竭的治疗或手 术诱发的氧化应激状态的治疗。在具体的实施例中，所述用途包括每24小时施用5～1,000mg， 5～700mg，5～600mg或5～300mg的褪黑素。在另一具体实施例中，对患者施用的褪黑素的量为每4 小时30～90mg，优选40～70mg。在具体实施例中，每24小时患者施用55～75mg褪黑素。一般地， 根据人等效剂量计算(reagan-shaw et al.2007.faseb j 22:659-661)，褪黑素的最小剂量的范围在 50～500mg/天之间(venegas et al.2012.j pineal res 52:217-227)。
[0051]
在本发明的另一优选实施例中，所述用途涉及每24小时施用至少300mg，优选至少400mg，甚 至更优选至少500mg褪黑素。在本发明的该优选实施方案中，所述用途优选是指败血症的治疗。
[0052]
在具体实施方案中，通过灌注进行给药。在另一实施方案中，褪黑素、其盐、前药、衍生物或 溶剂化物每天给药1、2、3、4、5或6次或更多次，直到达到所需的总日剂量。治疗期可以根据患 者的进展而变化，并且通常持续1～30天。
[0053]
在具体实施例中，所述成人败血症是严重的败血症。sirs是一系列严重临床损伤
的一般性炎症 反应。根据美国胸科医师学会/重症监护医学学会商定的定义，通过两种或多种以下症状(i)至(iv) 的存在而在临床上识别该综合征：
[0054]
(i)温度》38℃或《36℃。
[0055]
(ii)心率》90次/分钟。
[0056]
(iii)呼吸率》20次呼吸/分钟或paco2《32mmhg。
[0057]
(iv)白细胞计数》12,000个细胞/mm3，《4,000个细胞/mm3或》10％的未成熟(条带)形式。
[0058]
败血症相当于因感染明显集中引起的sirs。其诊断需要两种或更多种sirs标准和清楚的临床 感染图片或微生物研究(在正常无菌流体中存在病原微生物，在尿中或在支气管分泌物的定量培养物 中超过100,000cfu/ml)的存在。此外，当与器官功能障碍，低灌注或低血压(《90mm hg收缩压) 相关时，败血症被认为是严重的。低灌注的表现可以包括但不限于乳酸酸中毒(乳酸》3mmol/l)， 少尿(利尿50《30ml/h持续3小时或24小时内700ml)，凝血病(凝血酶原时间的延长或血小板 减少症小于100,000/ml)，或精神状态的急剧变化(激动、神志不清)。
[0059]
在本文件的上下文中，术语“治疗”是指服用根据本发明的化合物或配剂，以预防、改善或根除 疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状。“治疗”还涵盖预防、改善或根除疾病的生理后遗症。
[0060]
在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”及其变体不旨在排除其它技术特征、补充、组分或 步骤。对于本领域的技术人员，可以从说明书以及从本发明的实施过程中部分地推导出。
[0061]
以下实施例以举例说明的方式提供，并且不旨在限制本发明。
[0062]
实施例
[0063]
本发明将通过发明人进行的检验进行下面的说明，检验清楚地显示本发明组合物的稳定性和有效 性。
[0064]
实施例1本发明的组合物的制备
[0065]
在约20％的丙二醇和约30％的聚乙二醇中以足量的无热原水(api)制备浓度为6mg/ml的用 于可注射溶液的褪黑素。
[0066]
表1检验的组合物的定性和定量组成
[0067]
组分组成(每ml)功能褪黑素6.0mg活性成分丙二醇200.0mg赋形剂聚乙二醇(macrogol)300.0mg赋形剂用于注射剂的水足量1ml溶剂
[0068]
用于封装表1中所述的组合物的材料是预先在烘箱中灭菌的i型玻璃安瓿(ep)。
[0069]
实施例2稳定性检验
[0070]
2.1一般原则
[0071]
本研究是表1中指定的产品在制备后和6个月时间的稳定性研究。为此目的，使用三个工业规模 的浴，每个包含1000安瓿的表1中指定的产品。
[0072]
2.2稳定性测试结果
[0073]
表2：表1描述的含6mg/ml褪黑素的溶液的长期稳定性数据
[0074][0075]
从所示的长期稳定性检验可以推断储存6个月后，包括含6mg/ml注射用褪黑素的溶液的所述安 瓿符合具有这些特征的产品所需的技术规范。
[0076]
实施例3：败血症患者的临床研究
[0077]
本发明的组合物，将实施例1所述的安瓿中含6mg/ml注射用褪黑素的溶液(以下称为“褪黑素可注射剂”)用于临床研究，将14名败血症患者在腹部手术后随机分配成2个研究组(a和b)。 组a对应于除了标准治疗之外，以60mg/天的剂量接受褪黑素注射剂5天的患者，每天采集血液样品 以进行连续的分析测定。治疗组b接受标准治疗和安慰剂，后者是具有相同赋形剂但不含褪黑素活 性成分的相同的小瓶；也从该组的每个患者获得每日血液样品以进行连续地分析测定。血液样品称 为t0、t1、t2、t3、t4和t5。
[0078]
对每个参与患者，从这些样品分析以下血液参数：白细胞数、红细胞数、血红蛋白、血细胞比容、 嗜中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比和血小板数。在参与研究的每个患者
中测定的生化参数为： 转氨酶(got和gpt)、γ-谷氨酰转移酶、肌酸酐、尿素，碱性磷酸酶(alp)和乳酸脱氢酶(ldh)。
[0079]
进行的测定的正当性
[0080]
包括白细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞数的血液参数以及血小板数是指示败血症状态的参数。在 这方面，已知败血症导致淋巴细胞百分比下降。
[0081]
测定的生化参数与肝功能相关，例如：
[0082]-谷氨酸草酰乙酸转氨酶或天冬氨酸氨基转移酶(got/ast)：属于转氨酶群的酶，其通过转移 氨基，催化氨基酸转化成相应的α-酮酸，反之亦然。它见于细胞质和线粒体中。它对肝病是高度特 异的。
[0083]-谷氨酸丙酮酸转氨酶或丙氨酸氨基转移酶(gpt/alt)：也是属于转氨酶群的酶，其通过转移 氨基，催化氨基酸转化成相应的α-酮酸，反之亦然。其最高的活性水平见于肝脏。
[0084]-γ-谷氨酰转移酶(ggt)：有助于肝-胆汁疾病的诊断和控制。ggt的酶活性通常是这类疾病 增加的唯一参数，并且它是高度敏感的。
[0085]-碱性磷酸酶(alp/fa)：在人血清中，存在四种结构的基因型：肝-骨-肾型、肠型、胎盘型和 干细胞变体。该酶见于成骨细胞、肝细胞、肾、脾、胎盘、前列腺、白细胞和小肠中。肝-骨-肾型 特别重要。
[0086]
关于肾功能，已经测定了以下参数：
[0087]-肌酸酐是由肌肉代谢产生的废物分子。肌酸酐来自肌酸，是肌肉中产生能量的非常重要的分子。 每天约2％的身体肌酸转化为肌酸酐。肌酸酐通过血液从肌肉运输到肾。肾过滤大部分肌酸酐，并 在尿液中排除。血清肌酸酐的测定是相当可靠准确地表明肾脏功能状态的检验。
[0088]-尿素，其测定是最广泛使用的以评价肾脏功能的测试。尿素是蛋白质和氨基酸代谢的最终产 物。在蛋白质降解中，蛋白质分解成氨基酸并脱去氨基。随着氨的形成，在肝脏中合成尿素。这 是人体中过量氮降解的最重要途径。
[0089]
为了检测组织(比如，肝)中的损伤，已经测定了在人体几乎所有组织中发现的酶乳酸脱氢酶(也 称为“乳酸脱氢酶”(ldh))。它在细胞呼吸(其中来自食物的葡萄糖转变成能被细胞使用的能量 的过程)中起重要作用。
[0090]
即使ldh在组织细胞中充裕，血液水平通常较低。然而，当组织由于损伤或疾病而受损时，它 们将更多的ldh释放到血流中。通常引起血流中ldh量增加的病症如下：肝病、心脏病发作、贫 血、肌肉创伤、骨折、癌症、感染如脑膜炎、脑炎或hiv。
[0091]
结果与讨论
[0092]
独立的统计学家对来自研究的数据进行统计分析，并获得以下结果：
[0093]
·
白细胞：结果显示组a和组b的白细胞水平均下降；虽然两组的白细胞平均值都下 降，但差异在统计学上并不显著。
[0094]
·
红细胞：尽管两组的红细胞平均值都下降，但差异在统计学上并不显著。
[0095]
·
血红蛋白：尽管两组的血红蛋白平均值都下降，但差异在统计学上并不显著。
[0096]
·
血细胞比容：虽然两组的血细胞比容平均值都下降，但差异在统计学上并不显著。
[0097]
·
血小板：尽管两组的血小板平均值都增加，但差异在统计学上并不显著。
[0098]
·
淋巴细胞：组之间存在显著差异(p＝0.015)，即，不管在什么时间(差异在所有测 量时刻相同)，组a(用褪黑素注射剂处理)的淋巴细胞平均值大于组b(安慰剂)的淋巴细 胞平均值。此外，时间的影响在统计学上是显著的(p＝0.005，因为不遵循球形度)，这意 味着淋巴细胞水平的增加在不同的测量时刻是不同的。具体地，差异是由于相对于初始时间 的时间4和5。
[0099]
·
嗜中性粒细胞：像在淋巴细胞的情况下，研究组之间存在显著差异(p＝0.007)，即， 不管在什么时间(在所有测量时刻差异相同)，组b(安慰剂)的嗜中性粒细胞平均值大于组 a(褪黑素)的嗜中性粒细胞平均值。时间上的差异在统计学上是显著的(p＝0.042，因为不 遵循球形度)。几乎可以说，在时刻3之后，组a(褪黑素)中的下降开始是显著的。
[0100]
·
got：尽管接受治疗的患者(组a)的初始got水平较高，但平均值的差异在统 计学上并不显著(p＝0.633)。不同时刻的变化在统计学上也不显著，即got水平几乎保持 相同。
[0101]
·
gpt：gpt水平的变化在不同的测量时刻并不显著。平均值在统计学上也不显著。
[0102]
·
ggt：ggt水平的变化在不同的测量时刻并不显著。平均值在统计学上也不显著。
[0103]
·
alp(碱性磷酸酶)：在不同的测量时刻，碱性磷酸酶的变化并不显著。平均值在 统计学上也不显著。
[0104]
·
尿素：尿素水平在时间上没有显著差异；它们在两组中几乎保持相同(friedman检 验，对于组a，p＝0.205，并且对于组b，p＝0.959)。如果在每个测量时刻比较两组之间 的尿素水平，可以看出在所有测量时刻(除了最后一个测量时刻)，组b(安慰剂)中的尿素 水平较高。差异在统计学上是显著的。
[0105]
·
肌酸酐：肌酸酐水平在时间上没有显著差异；它们在两组中保持相同(friedman检 验，对于组a，p＝0.122，对于组b，p＝0.831)。如果在每个测量时刻比较两组之间的肌 酸酐水平，可以看出组a和组b之间的肌酸酐水平在统计学上没有显著差异。
[0106]
·
ldh：ldh水平在时间上没有显著差异；它们在两组中几乎保持相同(friedman 检验，对于组a，p＝0.355，对于组b，p＝0.921)。如果在每个测量时刻比较两组之间的 ldh水平，可以看出，在所有测量时间，组a(褪黑素)的ldh水平较高，尽管差异在统计 学上并不显著。
[0107]
非参数检验的分析
[0108]
尽管样本量很小，尽管遵守所有变量的正态性假设，但是使用非参数检验，因为它们在样本如此 小时更加稳健和合适。
[0109]
考虑到这一点，一方面，对独立样品使用friedman检验，分别比较每组中不同参数随时间的进 展。对于随时间的进展，在以下参数中获得统计学上的显著差异(p《0.10)：
[0110]
·
在不同时间观察到的组a的血红蛋白水平(p＝0.069)。
[0111]
·
在不同时间观察到的组a(p＝0.056)和组b(p＝0.069)的血小板水平。
[0112]
·
在不同时间观察到的组a(p＝0.030)和组b(p＝0.085)的淋巴细胞水平。
[0113]
·
在不同时间观察到的组a的嗜中性粒细胞水平(p＝0.070)。
[0114]
·
在不同时间观察到的组a(p＝0.013)和组b(p＝0.077)的got水平。
[0115]
·
在不同时间观察到的组b的gpt水平(p＝0.004)。
[0116]
·
在不同时间观察到的组a的ggt水平(p＝0.079)。
[0117]
此外，对独立样品，独立地使用mann-whitney检验比较在每个时刻组a和组b之间的直接差异， 得到以下结果：
[0118]
·
在时刻t2，组a和组b之间在红细胞(p＝0.026)，血红蛋白(p＝0.038)和血细 胞比容(p＝0.053)水平上存在差异。
[0119]
·
在所有时间淋巴细胞水平都存在差异。
[0120]
·
在t2(p＝0.007)和t3(p＝0.011)，组a和组b之间在嗜中性粒细胞水平上存在 差异。
[0121]
·
在t5，组a和组b之间在gpt水平上存在差异(p＝0.038)。
[0122]
结论
[0123]
在接受注射剂的组a的败血症患者中用褪黑素注射剂治疗显示淋巴细胞百分比逐渐增加。这种增 加在统计学上是显著的。这些患者还显示嗜中性粒细胞百分比在统计学上显著下降。淋巴细胞的增 加和嗜中性粒细胞的减少都发生在研究的所有时间，在研究期结束时达到接近健康个体的正常值的水 平。这种情况使得接受褪黑素注射剂治疗的患者的免疫恢复，因为在接受注射剂治疗的患者中实现 了淋巴细胞和嗜中性粒细胞之间的平衡。
[0124]
此外，在接受注射剂治疗的患者中，用褪黑素注射剂治疗不涉及任何肝或肾损伤。
[0125]
统计分析详情
[0126]
下面提供对在研究的所有时刻(t0，...，t5)测量的参数上进行的分析的详情。
[0127]
白细胞
[0128][0129]
虽然两组的白细胞平均值下降，但差异在统计学上并不显著。
[0130]
红细胞
[0131][0132]
虽然两组的红细胞平均值下降，但差异在统计学上并不显著。
[0133]
血红蛋白
[0134][0135]
虽然两组的血红蛋白平均值下降，但差异在统计学上并不显著。
[0136]
血细胞比容
[0137][0138]
虽然两组的血细胞比容平均值下降，但差异在统计学上并不显著。
[0139]
血小板
[0140][0141]
虽然两组的血小板平均值下降，但差异在统计学上并不显著。
[0142]
淋巴细胞
[0143][0144]
受试者内的效果检验
[0145]
变换变量：平均值
[0146][0147]
组之间存在显着差异(p＝0.015)，即，不管在什么时间(在所有测量时刻，差异相同)，组a的 淋巴细胞平均值大于组b的淋巴细胞平均值。
[0148]
此外，时间的影响在统计学上是显著的(p＝0.005，因为不遵循球形度)，这意味着淋巴细胞水平的 增加在不同的测量时刻是不同的。
[0149]
具体来说，差异是由于时间4和5相对于初始时间产生：
[0150]
受试者内的效果检验
[0151][0152]
受试者内的对比检验
[0153][0154]
嗜中性白细胞
[0155][0156]
与前面的情况一样，组之间存在显著差异(p＝0.007)，即，不管在什么时间(在所有测量时刻，差 异相同)，组b的嗜中性粒细胞平均值大于组a的嗜中性粒细胞平均值。
[0157]
受试者内的效果检验
[0158]
变换变量：平均值
[0159][0160]
时间上的差异在统计学上是显著的(p＝0.042，因为不遵循球形度)。几乎可以说在时刻3之后，下 降开始是显著的。
[0161]
受试者内的效果检验
[0162][0163]
受试者内的对比检验
[0164][0165]
got
[0166][0167]
即使治疗组a中的患者的初始got水平较高，平均值的差异在统计学上并不显著(p＝0.633)。在 不同时刻的变化也并不显著，即got水平几乎保持相同。
[0168]
受试者内的效果检验
[0169]
变换变量：平均值
[0170][0171]
gpt
[0172][0173]
在不同的测量时刻gpt水平的变化并不显著。平均值在统计学上也并不显著。
[0174]
ggt
[0175][0176]
在不同的测量时刻ggt水平的变化并不显著。平均值在统计学上也并不显著。
[0177]
碱性磷酸酶
[0178][0179]
在不同的测量时刻，碱性磷酸酶的变化并不显著。平均值在统计学上也并不显著。
[0180]
非参数检验分析：
[0181]
一方面，分别比较每组中不同参数随时间的进展(对独立样品使用friedman检验)，在以下方面获 得统计学上的显著差异(p《0.10)：
[0182]
在不同时间观察到的组a的血红蛋白水平(p＝0.069)：
[0183][0184]
在不同时间观察到的组a(p＝0.056)和组b(p＝0.069)的血小板水平：
[0185][0186]
在不同时间观察到的组a(p＝0.030)和b(p＝0.085)的淋巴细胞水平：
[0187][0188]
在不同时间观察到的组a的嗜中性粒细胞水平(p＝0.070)：
[0189][0190]
在不同时间观察到的组a(p＝0.013)和组b(p＝0.077)的got水平：
[0191]
[0192]
在不同时间观察到的组b的gpt水平(p＝0.004)：
[0193][0194]
在不同时间观察到的组a的ggt水平(p＝0.079)：
[0195][0196]
·
如果在每个时刻独立比较组a和组b之间的直接差异(对独立样本进行mann-whitney检验)， 则在时刻t2，组a和组b之间在红细胞(p＝0.026)、血红蛋白p＝0.038)和血细胞比容(p＝ 0.053)水平上存在差异。
[0197]
淋巴细胞水平在所有时间都存在差异：
[0198][0199]
·
在t2(p＝0.007)和t3(p＝0.011)，组a和组b之间在嗜中性粒细胞水平上存在差异。
[0200]
·
在t5，组a和组b之间在gpt水平上存在差异(p＝0.038)。
[0201]
·
尿素水平在时间上没有显著差异；它们在两组中几乎保持相同(friedman检验，对于组a，p＝ 0.205，对于组b，p＝0.959)：
[0202]
尿素
[0203][0204]
·
然而，如果在每个测量时刻比较两组之间的尿素水平，则在除了最后一个测量时刻之外的所有 测量时刻，组b的尿素水平较高。差异在统计学上是显著的：
[0205][0206]
此外，每组中以下参数随时间的进展分别没有表现出显著差异：
[0207]
肌酸酐
[0208]
·
肌酸酐水平在时间上没有显著差异；它们在两组中保持相同(friedman检验，对于组a，p＝0.122， 对于组b，p＝0.831)：
[0209][0210]
·
如果在每个测量时刻比较两组之间的肌酸酐水平，可以看出组a和组b之间的肌酸酐水平在统计 学上没有显著差异：
[0211][0212]
ldh
[0213]
·
ldh水平在时间上没有显著差异；它们在两组中几乎保持相同(friedman试验，对于组a，p＝ 0.355，对于组b，p＝0.921)：
[0214][0215]
·
如果在每个测量时刻比较两组之间的ldh水平，则在所有测量时间，组a的ldh水平较高，但差异 在统计学上并不显著：
[0216]