一种全雄青虾规模化繁育的方法与流程

1.本发明涉及基因工程领域，特别是一种全雄青虾规模化繁育的方法。


背景技术：

2.青虾，又名河虾，学名日本沼虾，其肉质鲜美、营养价值高，是我国重要的淡水虾类养殖品种。青虾雌雄性别差异显著，雄虾个体大，生长快，具有生长优势，市场上，大规格青虾有明显的价格优势。
3.青虾养殖过程中，放苗2个多月后雌虾开始性成熟，周期性抱卵、孵化产生大量仔虾。雌虾的繁殖导致密度过高从而影响生长速度，最终上市规格偏小，进而影响经济效益。
4.甲壳动物单性化育种是一项新兴的水产动物育种技术。虾蟹单性化养殖，可以利用其性别差异性的生长优势，减少因繁殖消耗的能量，有效控制养殖密度。因此，单性化的全雄苗技术在青虾养殖中具有广阔的市场前景。甲壳动物全雄制种技术的核心是制备“假雌”母本，目前主流的依靠有rnai技术干扰iag基因生产“假雌”亲虾并由此生产全雄品系，该方法已经在罗氏沼虾中成熟运用。此外，还有切除促雄性腺也可制备“假雌”亲本，但该方法操作技术要求高，劳动强度大，死亡率高，并且逆转效率极低，因而不适合规模化量产。尽管生产上对全雄青虾苗种需求迫切，但目前还没有规模化的全雄青虾育种方法。因此，本发明生产的全雄青虾将提升青虾单性化育种技术，同时将促进青虾养殖业升级。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全雄青虾规模化繁育的方法，能够解决青虾养殖过程中自繁引起的养殖密度过高，生长速度慢、大规格虾比例低的问题；采用本方法繁育的虾苗雄性比例高，生长快，经济效益好。
6.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
7.一种全雄青虾规模化繁育的方法，包括如下步骤：
8.步骤一，根据青虾基因序列sequence1序列体外制备dsrna；
9.从青虾的精巢中提取rna后，采用逆转录试剂盒的试剂及操作方法合成cdna；根据转录组seqno 01序列，设计合成引物序列sequence1f和sequence1r；
10.再利用primestar max premix进行pcr扩增序列；获得的序列用于后续dsrna合成；
11.步骤二，将得到的dsrna对虾苗进行转染，检测干扰效果；
12.步骤三，将rna干扰后的青虾饲养至体长3
±
0.5cm时抓捕，鉴定雌雄性别情况；对其中的表现型为雌虾的进行分子生物学的性别鉴定；
13.步骤四，全雄青虾的培育与验证：
14.选取经过分子标记验证后的“假雌
”♀
zz亲虾与雄虾
♂
zz交配受精；
15.按照每个雌虾建家系，每个家系虾进行分池养殖，体长至3
±
0.5cm鉴定雌雄性别情况；保留其中子代全部是雄虾的母本，用与后续全雄虾苗的培育；
16.步骤五，全雄青虾母本“假雌”虾的传代：
17.经验证后“假雌
”♀
zz亲虾与雄虾
♂
zz交配后育苗，对其后代全雄虾苗进行rna干扰后养殖至性别分化，挑选其中表型为雌虾的“假雌”虾，用于后续继续传代和扩繁。
18.前述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，步骤一中dsrna合成的具体步骤为：按照t7high yield transcription kit试剂盒的操作步骤进行dsrna的制备，合成含有t7启动子的sequence1的dna作为反应的模板，反应体系为：t7 rnapolymerase mix 2μl；reaction buffer4μl；atp/utp/gtp/ctp solution mix 8μl；dna模板2μl；rnase inhibitor 3μl，rnase-free h2o 31μl；反应液混匀后，在pcr仪上37℃反应2h后；所得的转录产物进行纯化、浓度测定后用于后续rnai试验。
19.前述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，步骤二中的虾苗的选取的方法为：收集安徽升金湖、湖南洞庭湖地区的野生青虾，体长大于6cm，体重大于3g，收集完以后保留升金湖地区的雄性个体作为父本，保留洞庭湖地区的雌虾作为母本，用于后续育种试验。
20.前述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，步骤二中的虾苗的繁殖的方法为：
21.步骤a，室内驯化与营养强化：
22.收集的虾雌雄分开于独立的水泥池饲养，水温要保持在22℃左右，每天饲料早晚投喂一次，每周投喂螺蛳肉2次进行营养强化，投喂量为虾体重的1％～3％，每天人工吸污，保证池底洁净；每周换水2次，每次换水量为20％；
23.步骤b，人工繁殖：
24.营养强化1个月后，水温升至27℃时，按照雌雄比4：1进行混合投放种虾进行交配；雌虾产卵后，将抱卵的青虾转移至孵化池饲养，放养密度为20只/平方米；每天观察受精卵孵化情况；保持水质、水温稳定，溶解氧＞6mg/l，亚硝酸＜0.03mg/l；
25.受精卵孵化后，用100目网布从表层收集幼体；计数以后，参照10万尾/m3的密度将幼体放至育苗池中；第二天向水池中添加小球藻到终浓度100万细胞/ml，开始投喂丰年虫、轮虫、枝角类等青虾幼体喜食的饵料生物，每天四次；培育时，育苗池水温在30℃左右，ph值在7.2～8.2之间；全池曝气，溶氧≥5mg/l，每日换水一次，换水量20％，保持水质稳定；每天观察幼体摄食、蜕皮发育情况，幼体经20天左右培育完成变态发育、开始转为底栖时，投喂南美白对虾配合饲料粉料，日投喂量为虾苗体重的1～2％。
26.根据权利要求1所述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，其特征在于，所述步骤二中sequence1基因dsrna对虾苗的转染具体方法为：选取变态后虾苗p＜40，按照1μg/只的dsrna注射于青虾的肌肉中，注射后虾苗放回水泥池饲养，当天按照10g/m3泼洒维生素c减少应激性。
27.前述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，步骤三中鉴定雌雄性别情况的方法为：采用人工观察法，青虾体长至3.0
±
0.5cm时抓捕，利用青虾雄性生殖孔凸起鉴定性别，第五步足基部存在凸起的为雄虾，不存在凸起的为雌虾。
28.前述的一种全雄青虾规模化繁育的方法，步骤四中所述“假雌”亲本的检测与筛选的具体方法包括：
29.分子标记进一步筛选：
30.利用青虾性别特异性分子标记，对群体中表型为雌性的青虾进行遗传学上的鉴定；提取每只雌虾的dna后，然后进行pcr扩增后进行电泳验证，正常群体中，雌虾的dna可以
seqno01。使得其中的雄虾性别逆转为假雌虾，假雌虾是表型为雌性且具有产卵功能的雄虾。经过养殖后，先利用分子标记初步筛选出假雌虾，再与普通父本交配后建立家系，通过子代的性别比例来推断rnai处理后亲本性别的遗传类型，筛选其中真正的假雌虾。经筛选的假雌虾用于后续建立全雄品系，再利用繁殖的全雄苗进行rnai干扰，批量获取假雌虾，完成全雄青虾的传代和规模化扩繁。
42.一种全雄青虾规模化繁育的方法，如图1所示，包括如下步骤：
43.步骤一，根据青虾基因序列sequence1序列体外制备dsrna；
44.从青虾的精巢中提取rna后，采用逆转录试剂盒的试剂及操作方法合成cdna；根据转录组seqno 01序列，设计合成引物序列sequence1f(5-3tcaggggccatgaactct，seqno02)和sequence1r(5-3gagcaaaccttgttgttgga，seqno 03)；再利用primestar max premix进行pcr扩增序列；pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳后，转入pmd-t19载体中后转化入dh5α感受态细胞中，经蓝白斑菌落筛选，挑取白色单菌落到lb液体培养基继续培养后经菌落pcr检测后，送测序公司完成测序；获得的序列用于后续dsrna合成；
45.作为一种优选，步骤一中dsrna合成的具体步骤为：按照t7 high yield transcription kit试剂盒的操作步骤进行dsrna的制备，合成含有t7启动子的sequence1的dna作为反应的模板，反应体系为：t7 rna polymerase mix 2μl；reaction buffer 4μl；atp/utp/gtp/ctp solution mix 8μl；dna模板2μl；rnase inhibitor 3μl，rnase-free h2o 31μl；将反应液混匀后，在pcr仪上37℃反应2h后；所得的转录产物进行纯化、浓度测定后用于后续rnai试验。
46.步骤二，将得到的dsrna对虾苗进行转染，检测干扰效果；
47.作为一种优选，虾苗的选取的方法为：收集安徽升金湖、湖南洞庭湖地区的野生青虾，体长大于6cm，体重大于3g，收集完以后保留升金湖地区的雄性个体作为父本，保留洞庭湖地区的雌虾作为母本，用于后续育种试验。
48.作为一种优选，虾苗的繁殖的方法为：
49.步骤a，室内驯化与营养强化：
50.收集后的虾雌雄分开后于独立的水泥池饲养。水温要保持在22℃左右，每天饲料早晚投喂一次，每周投喂螺蛳肉2次进行营养强化，投喂量为虾体重的1％～3％。每天人工吸污，保证池底洁净。每周换水2次，每次换水量为20％。
51.步骤b，人工繁殖：
52.营养强化1个月后，水温升至27℃时，按照雌雄比4：1进行混合投放种虾进行交配。雌虾产卵后，将抱卵青虾转移至孵化池进行饲养，放养密度为20只/平方米。孵化期间每天观察受精卵孵化情况。保持水质、水温稳定，溶解氧＞6mg/l，亚硝酸＜0.03mg/l。
53.受精卵孵化后，用100目网布从表层收集幼体。幼体定量计数以后，参照10万尾/m3的密度将幼体放至育苗池中。第二天向池中添加小球藻到终浓度100万细胞/ml，开始投喂丰年虫、轮虫、枝角类等青虾幼体喜食的饵料生物，每天四次。培育时，育苗池水温在30℃左右，ph值在7.2～8.2之间。全池曝气，溶氧≥5mg/l，每日换水一次，换水量20％，保持水质稳定。每天观察幼体摄食、蜕皮发育情况，青虾幼体经20天左右完成变态发育、开始转为底栖时，投喂南美白对虾配合饲料粉料，日投喂量为虾苗体重的1～2％。
54.作为一种优选，将得到的dsrna对虾苗转染具体方法为：选取变态后虾苗p＜40，按
照1μg/只的dsrna注射于青虾肌肉中，注射完以后，放回水泥池饲养，当天按照10g/m3泼洒维生素c减少应激性。
55.步骤三，将rna干扰后的青虾饲养至体长3
±
0.5cm时抓捕，鉴定雌雄性别情况；对其中表型为雌虾的虾进行分子生物学性别鉴定；
56.作为一种优选，鉴定雌雄性别情况的方法为：采用人工观察法，通过足基部的雄性交接器凸起来判断雌雄。然后对群体中表型为雌性的青虾进行遗传学上的鉴定；提取每只雌虾的dna后，进行pcr扩增后进行电泳验证，测试结果如图2所示，经过pcr检测以后，正常群体中，雌虾dna显示250bp的条带，而雄虾dna无法扩增出条带。
57.步骤四，全雄青虾的培育与验证：
58.经分子标记检测出的“假雌
”♀
zz亲虾养殖至卵巢发育成熟，后与雄虾
♂
zz交配受精；
59.按照每个雌虾建立家系，获得的每个家系的仔虾进行分池养殖，体长至3
±
0.5cm鉴定雌雄性别情况；保留子代全部是雄虾的母本，用与后续全雄虾苗的培育。
60.作为一种优选，家系验证筛选的方法为：用正常性别的雄虾与假雌虾按照雌雄比4:1进行配对，水温保持在27℃，完成交配产卵后，抓取抱卵虾单独孵化，待孵化出幼体，以雌虾为单位建立家系，每个家系的幼体采用步骤1的方法培育成仔虾。待每个家系的后代单独培育至3cm左右，采用人工观察法，通过第五步足基部的雄性交接器凸起来判断雌雄。当子代的雌雄比例约为1:1时，母本的遗传型为zw，淘汰该母本；当子代雄性比例为100％时，保留其zz型母本用于后续扩繁；
61.步骤五，全雄青虾母本“假雌”虾的传代：
[0062]“假雌”亲本的扩群传代：
[0063]
经家系验证后的假雌亲本精养后进行交配产卵，待繁育成仔虾后，对全雄仔虾进行规模化rnai干扰，将合成的dsrna用壳聚糖纳米颗粒包被以后，按照1μg/只的标准注射到全雄虾苗的肌肉处，经过壳聚糖纳米颗粒包被以后，dsrna进入青虾体内干扰效率显著性提高到30％。全雄zz型虾苗经过rnai逆转后，筛选其中表型为雌性的虾，均为假雌虾，zz型假雌虾在水泥池养殖3个月左右开始性成熟。随后可以与正常雄虾交配，然后进入室外土塘大规模繁殖或者工厂化育苗；
[0064]
为了进一步提高假雌虾产卵量，作为一种优选，步骤c，将假雌虾转移至室外池塘进行为期2个月的养殖，提高其规格与产卵量。室外养殖期间，养殖密度控制在30000尾/亩，养殖期间，每天投喂两次，每周投喂2次螺蛳肉进行营养强化，保持水质的稳定，进水时用80目筛绢网过滤，防止普通雌虾进入池塘引起的串种。经过室外营养强化的雌虾体长可以达到4cm以上，单只抱卵量4000个以上，此后采用室外土池育苗或者进行工厂化育苗，进行全雄青虾规模化生产。
[0065]
以下通过实验验证采用本发明的方法得到的青虾的技术效果：
[0066]
将本发明获得的全雄青虾在德清开展养殖对比测试：
[0067]
试验塘为6个2亩左右的标准小池塘，3月20日左右，池塘遍池用生石灰60千克/亩进行清塘消毒，消除野杂鱼和其他虾类的残余品种，并晒塘10天。4月15日池塘开始进水，池塘进水1米左右开始调水肥水，水质保持“肥、活、爽、嫩”，透明度在30厘米左右。4月25日，水质稳定以后，按照每亩30000尾的密度投放工场化全雄青虾苗。对照组放苗规格为2000尾/
kg，放苗15kg/亩，共计30000尾/亩。投苗以后，根据天气与温度情况，每天投喂1次，按青虾总重量的0.5％～1％投喂，每周调整一次投喂量，每15天加水一次，每次换水量不超过20cm。养殖期间，勤于观察，做好养殖管理与记录。经过100天左右养殖，青虾规格达到5cm以上，开始用地笼抓捕。统计雄虾的产量、雄性率、规格在3g以上的比例，实验结果见表1。
[0068]
表1
[0069][0070]
结果分析：经过统计分析后，发现全雄青虾规格在4g以上的比例在69.8％，同步性好，雄性率100％。平均产量在62.5kg/亩，明显优于对照组的普通虾苗。因此，经济效益可观。
[0071]
本发明方法攻克目前青虾养殖过程中过渡繁殖和早熟的问题，也有利于解决青虾自繁过程中的近交衰退。用本发明提供的方法步骤，可以培育全雄青虾，雄性率99％以上；全雄品种在养殖过程中，养殖4个月，相比普通品种亩产增加8％以上，5g大规格青虾比例提高15％。本发明建立的规模化培育全雄青虾的方法，操作性强，培育的全雄青虾具有生长快、性状稳定，能够有效控制养殖密度，为实现青虾的单性化养殖提供强有力的技术支撑。
[0072]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。