一种多通道导电神经移植物及其制备方法与流程

1.本发明属于神经移植物技术领域，具体涉及一种多通道导电神经移植物及其制备方法。


背景技术：

2.由运动、意外伤害或手术切除等导致的神经损伤是外科临床中的多发病，也是医学界的疑难杂症之一。当断裂处有缺损时，需要借助神经移植物进行修复和诱导组织再生。由于自体神经移植来源匮乏、尺寸不匹配，临床上逐渐采用神经移植物桥接缺损严重的神经损伤，而修复的效果同神经移植物的结构和性能密切相关。
3.一般来说，神经移植物应该具备然细胞外基质的基本特性。比如具有良好的生物相容性和降解性，适宜的力学强度和用于细胞粘附和迁移的多孔结构。丝素蛋白（sf）提取自天然蚕丝，不仅具有优异的生物相容性，而且机械性能和降解速率可控，降解产物主要是可被人体组织吸收利用的游离氨基酸，因此是制备神经移植物的极佳选择。此外，由于神经组织中大多数细胞是取向排列的，因此理想的神经移植物最好具有与其相应的三维各向异性。
4.导电材料可以刺激包括骨骼、皮肤、心脏和神经在内的电响应组织和器官，它们已广泛用于这些电信号敏感组织的再生。神经中的神经元系统是可快速传输信号的电兴奋细胞，引入电活性材料或施加电刺激后，可以对神经细胞的一系列生物学功能进行调节。
5.申请号201810497604.x公开了一种具有三维取向结构的神经移植物及其制备方法和制作设备，涉及组织工程技术领域。该具有三维取向结构的神经移植物的制备方法包括：将聚合物溶液经静电纺丝形成纤维并落入接收液，其中，接收液定向流动呈层流或过渡流状态；接收液选自环己烷、c1-c6的醇中的任意一种，优选为甲醇、乙醇或丙醇，该发明的神经移植物不具备导电性。现有技术中公开的神经移植物导电性和取向性不能同时满足，且降解性能差等缺点。
6.鉴于以上原因，特提出本发明。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种多通道导电神经移植物及其制备方法，本发明的方法得到优异导电性能的取向多通道可降解的神经移植物，可以更好的实现神经缺损处的修复。
8.本发明的第一目的，提供了一种多通道导电神经移植物制备方法，所述的方法包括如下步骤：（1）将新鲜提取的丝素蛋白溶液置于50-70℃环境中浓缩至浓度为15-25%，稀释，放置；（2）将放置后的丝素蛋白溶液灌注至塑料管中，放置在单向冷冻装置中冷冻处理，再将塑料管移至冻干机中处理20-28h，得到支架；
（3）将支架切成圆柱体，用甲醇处理，冷冻干燥；（4）将步骤（3）冷冻干燥的支架浸泡在pedot:pss溶液和sds的混合液中，取出，滤纸吸去表面的液体，脱水，真空干燥，得到所述的多通道导电神经移植物。
9.进一步的，步骤（1）中稀释至丝素蛋白浓度为3-5%。
10.本发明中丝素蛋白浓度稀释至3-5%，是为了冻干后可以得到适宜的力学性能和孔洞结构。
11.进一步的，步骤（1）中放置在50-70℃环境中20-28h。
12.其中，经过步骤（1）的处理得到能在单向冷冻过程中形成纳米纤维的溶液。
13.进一步的，步骤（2）中冷冻剂为丙酮和干冰的混合物，冷冻剂温度为-80~-70℃，冷冻时间为20-60min。
14.丙酮和干冰的混合物配制过程是向丙酮中加入干冰直至混合物成为糊状。
15.进一步的，步骤（3）中圆柱体直径为2-10mm，长为2-10mm。
16.进一步的，步骤（3）中甲醇处理25-35min，使丝素蛋白不溶于水。
17.进一步的，步骤（4）中pedot:pss溶液和sds的混合液中sds浓度为0.2-0.6%，sds在此范围内既能提高pedot:pss的导电率，也不会引起明显的细胞毒性。
18.进一步的，步骤（4）中脱水为依次放置在浓度为30%、50%、70%、90%和100%的叔丁醇溶液，所述的叔丁醇溶液为由乙醇配制而成，每次脱水12-18min。
19.本发明中的脱水方法既能保持神经移植物的形态又能对其进行初步的脱水干燥。
20.本发明的第二目的，提供了一种由所述的方法制备的多通道导电神经移植物。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的方法首先利用“浓缩-稀释”后快要成胶的丝素蛋白溶液进行单向冷冻，冻干后制备得到具有取向纤维分布在多通道表面的各向异性的sf支架，然后通过浸涂的方式在sf支架的通道表面引入pedot:pss，从而赋予支架一定的电活性。本发明的神经移植物表面有取向纤维分布的sf多通道结构能够诱导神经细胞的轴突定向生长，更好地完成神经修复，电活性pedot:pss层的存在能够促进神经细胞生长和分化，加速神经组织的再生。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是本发明所述的多通道导电神经移植物的制备示意图；图2是本发明不同浓度的丝素蛋白下制备的神经移植物的sem 图；图3是本发明实施例4制备的神经移植物的sem图；图4是本发明实施例4和对比例3制备的神经移植物的光学照片；图5是不同方法制备的神经移植物对pc12细胞活性的影响图；图6是本发明nsf4-m和1/2pedot-sds组pc12细胞的激光共聚焦图像。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
25.本发明所述的多通道导电神经移植物的制备示意图如图1所示。
26.本发明中所述的pedot:pss溶液，规格：固含量为1.0-1.3%，pedot与pss的质量比是1:2.5。
27.实施例1本实施例的一种多通道导电神经移植物制备方法，所述的方法包括如下步骤：（1）将新鲜提取的丝素蛋白溶液置于50℃环境中浓缩至浓度为15%，再稀释至丝素蛋白浓度为3%，放置在50℃环境中28h；（2）将放置后的丝素蛋白溶液灌注至塑料管中，将塑料管放置在单向冷冻装置中冷冻处理，塑料管底部与铜板直接接触，冷冻剂为丙酮和干冰的混合物，冷冻剂温度为-80℃，冷冻时间为20min，再将塑料管移至冻干机中处理20h，得到支架；（3）将支架切成圆柱体，圆柱体直径为2mm，长度为10mm，用甲醇处理25min，使其不再溶于水，冷冻干燥；（4）将步骤（3）冷冻干燥的支架浸泡在pedot:pss溶液和sds的混合液中，pedot:pss溶液和sds的混合液中sds浓度为0.2%，取出，滤纸吸去表面的多余的液体，依次放置在浓度为30%、50%、70%、90%和100%的叔丁醇溶液，所述的叔丁醇溶液为由乙醇配制而成，每次脱水12min，真空干燥，得到所述的多通道导电神经移植物。
28.实施例2本实施例的一种多通道导电神经移植物制备方法，所述的方法包括如下步骤：（1）将新鲜提取的丝素蛋白溶液置于60℃环境中浓缩至浓度为20%，再稀释至丝素蛋白浓度为4%，放置在60℃环境中24h；（2）将放置后的丝素蛋白溶液灌注至塑料管中，将塑料管放置在单向冷冻装置中冷冻处理，塑料管底部与铜板直接接触，冷冻剂为丙酮和干冰的混合物，冷冻剂温度为-75℃，冷冻时间为40min，再将塑料管移至冻干机中处理24h，得到支架；（3）将支架切成圆柱体，圆柱体直径为6mm，长度为6mm，用甲醇处理30min，使其不再溶于水，冷冻干燥；（4）将步骤（3）冷冻干燥的支架浸泡在pedot:pss溶液和sds的混合液中，pedot:pss溶液和sds的混合液中sds浓度为0.4%，取出，滤纸吸去表面的多余的液体，依次放置在浓度为30%、50%、70%、90%和100%的叔丁醇溶液脱水，所述的叔丁醇溶液为由乙醇配制而成，每次脱水15min，真空干燥，得到所述的多通道导电神经移植物。
29.实施例3本实施例的一种多通道导电神经移植物制备方法，所述的方法包括如下步骤：（1）将新鲜提取的丝素蛋白溶液置于70℃环境中浓缩至浓度为25%，再稀释至丝素蛋白浓度为5%，放置在70℃环境中20h；（2）将放置后的丝素蛋白溶液灌注至塑料管中，将塑料管放置在单向冷冻装置中
冷冻处理，塑料管底部与铜板直接接触，冷冻剂为丙酮和干冰的混合物，冷冻剂温度为-70℃，冷冻时间为60min，再将塑料管移至冻干机中处理28h，得到支架；（3）将支架切成圆柱体，圆柱体直径为10mm，长度为2mm，用甲醇处理35min，使其不再溶于水，冷冻干燥；（4）将步骤（3）冷冻干燥的支架浸泡在pedot:pss溶液和sds的混合液中，pedot:pss溶液和sds的混合液中sds浓度为0.6%，取出，滤纸吸去表面的多余的液体，依次放置在浓度为30%、50%、70%、90%和100%的叔丁醇溶液，所述的叔丁醇溶液为由乙醇配制而成，每次脱水18min，真空干燥，得到所述的多通道导电神经移植物。
30.实施例4本实施例的多通道导电神经移植物制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（1）中稀释至丝素蛋白浓度为4%。
31.实施例5本实施例的多通道导电神经移植物制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（1）中稀释至丝素蛋白浓度为5%。
32.对比例1本对比例的神经移植物制备方法与实施例1相同，不同之处在于，将步骤（2）中将塑料管放置在单向冷冻装置中冷冻处理替换为放置在在-80℃冰箱中冷冻处理20min，然后冻干，且去掉步骤（4），得到神经移植物。
33.对比例2本对比例的神经移植物制备方法与实施例1相同，不同之处在于，去掉步骤（4）。
34.对比例3本对比例的神经移植物制备方法与对比例2相同，不同之处在于，将步骤（1）中稀释至丝素蛋白浓度为4%。
35.对比例4本对比例的神经移植物制备方法与对比例2相同，不同之处在于，步骤（1）中稀释至丝素蛋白浓度为5%。
36.对比例5本对比例的神经移植物制备方法与实施例4相同，不同之处在于，将步骤（4）中pedot:pss溶液和sds的混合液用水稀释一倍。
37.对比例6本对比例的神经移植物制备方法与实施例4相同，不同之处在于，步骤（4）中pedot:pss溶液不加sds。
38.试验例1对比例1-4制备的神经移植物的sem图如图2所示。其中，a-d为横截面图，a-d为纵切面图；a和a分别为对比例1制备的神经移植物的横截面和纵切面图；b和b分别为对比例2制备的神经移植物的横截面和纵切面图；c和c分别为对比例3制备的神经移植物的横截面和纵切面图；d和d分别为对比例4制备的神经移植物的横截面和纵切面图。
39.从图中可以看出，对比例1得到的是各向同性的神经移植物，孔洞是散乱分布的。而对比例2-4得到的是各向异性的神经移植物，具有沿轴向的取向孔道和纤维结构，这是由
于采用单向冷冻处理的结果。对比例2孔道数量少于对比例3，对比例4为紧密片层缺少取向纤维，由于神经细胞需要足够生长空间和适宜取向结构诱导，对比例3的丝素蛋白浓度4%下制备的神经移植物比较符合要求。
40.试验例2实施例4制备的神经移植物的微观结构如图3所示，a为横截面，b为纵切面。可以看出，引入导电物质pedot:pss后，相较于对比例3，神经移植物孔道数量和大小有所增加，表面取向纤维结构有所覆盖和减少。
41.实施例4和对比例3制备的神经移植物的基本特征如图4所示，其中，右边为对比例3制备的神经移植物，颜色为乳白色，左边为实施例4制备的神经移植物，颜色为蓝黑色。
42.试验例31、测试不同方法制备的神经移植物对pc12细胞活性的影响，如图5所示，实施例4记为pedot-sds，对比例3记为nsf4-m，对比例5记为1/2pedot-sds，对比例6记为pedot，细胞培养板记为blank。
43.从图5中可见，在第5天，除了blank组，细胞活性最高的为1/2pedot-sds组，证明在对比例5的条件下所制备的神经移植物生物相容性较为优异。
44.2、nsf4-m和1/2pedot-sds组pc12细胞的活性如图6所示，其中，a为nsf4-m，b为1/2pedot-sds。
45.从图6中可以看出，一方面，1/2pedot-sds组细胞增殖、分化数目比nsf4-m多，体现了导电物质对细胞生长的促进作用；另外一方面，分化细胞的轴突沿多通道轴向伸展，体现了取向结构对细胞生长的诱导作用。
46.3、nsf4-m、pedot、pedot-sds和1/2pedot-sds的导电率如表1所示。
47.从表1中可以看出，nsf-m基本不具有导电性。相较于pedot，加入sds后pedot-sds的电导率由（6
±
3）
×
10-2
s/cm上升到（13
±
4）
×
10-2
s/cm。即使稀释一倍后，1/2pedot-sds的导电率仍有（8
±
2）
×
10-2
s/cm。
48.综合pc12细胞活性以及导电率等性能，最终确定在本发明的各制备条件下制备的神经移植物的性能较好。
49.本发明人对其他实施例也做了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
50.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。