一种功能化磁性微球的制备方法与流程

1.本发明涉及磁性材料技术领域，尤其涉及一种功能化磁性微球的制备方法。


背景技术：

2.磁性微球是目前体外诊断产品(ivd)的核心原料，具有超顺磁性、置于磁场中表现磁性而离开磁场后失去磁性，应用于生物大分子分离中具有快速高效且容易自动化的优点，在核酸提取、蛋白质分离、核酸测序建库、细胞分选、探针捕获、医学成像造影剂以及化学发光检测等方面具有重要应用。
3.近年来，磁性微球在分离纯化以及分析检测中的应用越来越广泛，其制备也一直备受关注。已经报道的磁性微球制备方法主要包括聚合物模板法、层层自组装法、磁性纳米粒子与有机单体共聚合方法等，但这些制备方法反应体系复杂、步骤多、耗时长、制备成本高、并且制备重复性以及磁性微球的综合性能都亟待提高。
4.磁性微球通常是由磁性材料如四氧化三铁或γ-三氧化二铁和聚合物材料如聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯组合在一起而形成的。聚合物材料可以作为模板，然后通过液相沉淀反应使磁性颗粒在聚合物材料内部或表面沉积(us4654267，cn 108129614 a，cn 108467461 a，cn 111375360a)；也可以通过表面涂覆的方法使磁性材料层层自组装附着在微球表面(chem.mater.，2001，13，109-116，us5648124)；利用磁性纳米粒子与有机单体共存的聚合方法制备磁性微球也有一些报道(cn1302831a，zl200310123800.4)。前两种方法反应体系复杂、不易控制；而最后一种方法相对简单一些，但难以得到合适粒径并且粒径均匀的磁性微球。而新兴的纳米级粒子粘附在微米级微球表面的技术(即所谓的nanospheres-on-microspheres)是通过直接表面键合或聚合的方法来实现的，但使用范围有限。
5.上述这些方法对聚合物微球和纳米粒子的性质以及反应体系都有严格的限制和要求，并且都是在液相体系中完成的。在固相体系利用研磨法直接使纳米级粒子附着在微米级微球表面的方法报道很罕见。因此，一种简便稳定的磁性微球制备方法，并且利用这种方法能获得均匀性好、重复性好、具有不含孔道的致密结构以及稳定性高的磁性微球，仍然是人们所追求的目标。


技术实现要素：

6.本发明解决的技术问题在于提供一种功能化磁性微球的制备方法，本技术提供的功能化磁性微球的制备方法简便稳定，且可获得均匀性好、重复性好、具有不含孔道的致密结构以及稳定性高的功能化磁性微球。
7.有鉴于此，本技术提供了一种功能化磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
8.a)将有机固体微球和无机磁性固体颗粒混合，得到固体分散相；
9.b)将所述固体分散相进行研磨，得到磁性固体颗粒附着在有机固体微球表面的复合磁性微球；
10.c)将所述复合磁性微球加热后再依次包覆和表面修饰，得到功能化的功能化磁性微球。
11.优选的，所述有机固体微球是无孔微球或多孔微球，所述有机固体微球的表面是功能化的或非功能化的。
12.优选的，所述有机固体微球包括非交联或交联的聚苯乙烯或非交联或交联的聚甲基丙烯酸酯。
13.优选的，所述无机磁性固体颗粒选自四氧化三铁、γ-三氧化二铁和mfe2o4中的一种或多种，其中m选自co、mg、ni、mn和zn中的一种或多种。
14.优选的，所述有机固体微球的粒径为0.1～100μm，所述无机磁性固体颗粒的粒径为1～1000nm。
15.优选的，所述无机磁性固体颗粒经过酸性溶液处理得到，所述酸性溶液为0.01～2.0m的盐酸或硝酸或硫酸，所述处理的方式为超声处理1～30min。
16.优选的，所述有机固体微球的表面功能化基团包括阴离子基团或阳离子基团，所述阴离子基团包括磺酸基或羧基，所述阳离子基团包括氨基或季铵盐。
17.优选的，所述研磨的介质为粒径0.5～50mm的刚性球珠，所述刚性球珠的材质为二氧化锆或三氧化二铝。
18.优选的，所述包覆的包覆层选自有机物和无机物中的一种或两种；所述无机物包括二氧化硅，所述有机物包括聚甲基丙烯酸酯类聚合物。
19.优选的，所述修饰的基团包括羟基、氨基、羧基或基于上述三种基团的活化基团。
20.本技术提供了一种功能化磁性微球的制备方法，通过将含功能团的微米级有机固体微球与纳米级无机磁性固体颗粒混合形成固体粉末分散相，然后将此分散相与合适粒径的刚性球珠混合，在一定条件下研磨一段时间得到纳米级磁性颗粒附着在微米级有机微球表面的复合磁性微球，最后将得到的复合磁性微球进行处理和筛分，并进一步对其表面进行包覆和修饰，得到功能化的功能化磁性微球。
21.本技术利用成熟的聚合物微球制备和磁性纳米粒子合成技术，通过固相共研磨法实现磁性纳米粒子在聚合物微球表面的附着和机械化学反应；进一步的，将聚合物微球进行磺化，并且将磁性纳米颗粒进行酸化，使前者带负电荷，后者带正电荷，由于静电吸引作用，在研磨时有利于两者的粘附；同时，将含环氧基团的聚合物微球和含氨基基团的磁性纳米颗粒一起研磨，会产生像环氧树脂一样的化学键合反应；且研磨也有利于形成磁性微球表面的具有不含孔道的致密结构，从而减少非特异性吸；在此基础之上，通过一般的物理处理以及进一步表面包覆和修饰就能得到功能性的磁性微球。
22.本发明制备方法简便，易控制，适宜规模化生产；成球过程中无需消耗溶剂，降低生产成本；由本方法制备的功能化磁性微球分散性好，稳定性高，可以批量生产性价比高的功能化磁性微球，并有效推动功能化磁性微球载体在生物分离纯化以及分析检测中的应用。
附图说明
23.图1为本发明固相研磨法在聚合物微球表面附着磁性纳米粒子的示意图；
24.图2为本发明实施例1制备的羧基聚合物修饰磁性微球的电子显微镜照片；
25.图3为本发明实施例3中研磨及反应后小球附着在大球上面的含羧基磁性微球的电子显微镜照片
26.图4为本发明实施例2中经过研磨得到的磁性微球的光学显微镜照片；
27.图5为本发明实施例2中未经研磨得到的磁性微球的光学显微镜照片。
具体实施方式
28.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
29.鉴于现有技术中磁性微球的制备方法工艺流程复杂、制备过程比较难控制，且制备的磁性微球磁性不够强、分散性和均匀性不够好的问题，本技术提供了一种简便稳定的功能化磁性微球的制备方法，利用该方法能够获得均匀性好、重复性好、具有不含孔道的致密结构以及稳定性好的功能化磁性微球。本技术利用聚合物微球和磁性纳米粒子，通过固相共研磨法实现了磁性纳米粒子在聚合物微球的表面附着和机械化学反应。具体的，本技术提供了一种功能化磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
30.a)将有机固体微球和无机磁性固体颗粒混合，得到固体分散相；
31.b)将所述固体分散相进行研磨，得到磁性固体颗粒附着在有机固体微球表面的复合磁性微球；
32.c)将所述复合磁性微球加热后再依次包覆和表面修饰，得到功能化的功能化磁性微球。
33.在上述功能化磁性微球的制备方法中，首先将有机固体微球和无机磁性固体颗粒混合，得到固体分散相；在此过程中，所述有机固体微球可以是无孔微球，也可以是多孔微球；所述有机固体微球的粒径为0.1～100μm。所述有机固体微球的表面是功能化的或非功能化的，更具体地，所述功能化基团包括阴离子基团或阳离子基团，所述阴离子基团包括磺酸基或羧基；所述有机固体微球包括非交联或交联的聚苯乙烯或非交联或交联的聚甲基丙烯酸酯。在本技术中，所述有机固体微球的制备从聚苯乙烯种子微球开始，其制备方法按照本领域技术人员熟知的方法进行。在得到聚苯乙烯种子微球之后，则将其在十二烷基硫酸钠和邻苯二甲酸二丁酯中进行活化，再在过氧化苯甲酰、二乙烯基苯、邻苯二甲酸二丁酯中进行溶胀，最后在聚乙烯吡咯烷酮中进行反应，得到多孔聚合物微球。在得到多孔聚合物微球之后，则将其分散于冰醋酸和浓硫酸中反应，即得到表面功能化的多孔聚合物微球。上述表面功能化的多孔聚合物微球的制备方法也可以按照其他方案制备，得到表面功能化的多孔聚合物微球即可，以使聚合物微球表面带有负电荷，利于后期无机磁性固体颗粒的吸附。
34.本技术中，所述无机磁性固体颗粒选自四氧化三铁、γ-三氧化二铁和mfe2o4中的一种或多种，其中m选自co、mg、ni、mn和zn中的一种或多种。所述无机磁性固体颗粒的粒径为1～1000nm，其是经过酸性溶液处理得到的，即将无机磁性固体颗粒置于0.01～2.0m的盐酸溶液中超声处理1～30min，清洗后研磨，即可得到表面带有正电荷的无机磁性固体颗粒。
35.在得到无机磁性固体颗粒和有机固体微球之后则在两者的固体分散相中加入二氧化锆或三氧化二铝球珠进行研磨，即可得到磁性固体颗粒附着在有机固体微球表面的复合磁性微球；所述研磨的时间为1～2h。
36.本技术然后再将复合磁性微球进行加热处理，之后依次包覆和表面修饰，即得到功能化磁性微球；本技术在研磨后进行表面包覆可以使表面粘附的纳米颗粒更稳定、不至于脱落，而接下来的表面修饰是使其带上功能团，便于生物分子嫁接。在上述过程中，所述包覆的包覆层选自有机物和无机物中的一种或两种，在本技术中，所述包覆层可以选自有机物，可以选自无机物，还可以同时选择有机物和无机物；所述无机物包括二氧化硅，所述有机物包括聚甲基丙烯酸酯类聚合物。本技术优先制备了无机物和有机物同时包覆的磁性微球，即将复合微球在溶剂和碱性条件下加入硅源-正硅酸四乙酯反应，即得到二氧化硅涂覆的磁性微球，将其分散于乙醇、氨水和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷中反应，得到双键修饰的硅烷化磁性微球；将得到的双键修饰的硅烷化磁性微球分散于十二烷基硫酸钠、甲基丙烯酸缩水甘油脂、n，n-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸钾中，通过自由基引发聚合反应，得到聚合物包覆的磁性微球。
37.本技术所述修饰的基团包括羟基、氨基、羧基或基于上述三种基团的活化基团，所述活化基团具体是指在羧基、氨基、羟基的基础上生成的便于嫁接有机或生物分子的活化基团。在本技术中先进行了氨基的修饰再进行了羧基修饰；所述氨基修饰是将上述得到的聚合物包覆的磁性微球分散于n，n-二甲基甲酰胺和乙二胺中反应；所述羧基修饰是将氨基修饰的磁性微球分散于n，n-二甲基甲酰胺、三乙胺和丁二酸酐中反应。氨基和羧基修饰的复合磁性微球可以经过常用的表面基团活化方法嫁接生物分子，如蛋白和核酸等，以便应用于生物分离纯化以及分析检测。
38.本发明提供了一种简便的固相研磨与表面包覆相结合的制备功能化磁性微球的方法；本方法易控制，适宜规模化生产，成球过程中无需消耗溶剂，降低生产成本，减少环境污染；由本方法制备的功能化磁性微球均匀性好、磁性强、稳定性高。
39.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的功能化磁性微球的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
40.实施例1
41.1)聚合物多孔微球的制备
42.称取4.5克聚乙烯吡咯烷酮k-30，溶解于240毫升体积分数为75％的乙醇水溶液中，准确取15毫升经过纯化后的苯乙烯加入上述溶液，用玻璃烧瓶反应器预热80度，然后一次性引入60毫升质量体积分数为1.25％的偶氮二异丁腈乙醇溶液，令反应液在80度下反应2.5小时，整个反应在氮气氛围下进行；产物用离心分离、乙醇清洗重分散得到粒径为约750纳米的单分散聚苯乙烯种子微球；
43.在150毫升质量体积分数为0.25％的十二烷基硫酸钠水溶液中准确加入邻苯二甲酸二丁酯1毫升，在超声波细胞破碎仪中以200瓦的功率脉冲乳化5分钟得到精细白乳液，加入上述合成的种子微球1克，将反应瓶置于35度摇床以150cpm转速活化24小时。活化完成后按照邻苯二甲酸二丁酯乳液同样的方法制备500毫升含1克过氧化苯甲酰、15毫升二乙烯基苯、10毫升邻苯二甲酸二丁酯水包油乳液，将制得的白色精细乳液加入到活化种子微球乳液中，继续在摇床中以同样的参数溶胀24小时；向经过溶胀24小时后的乳液中加入500毫升质量体积分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，转移到油浴反应装置在通氮气下以80度，80rpm搅拌下聚合24小时。产物用离心分离、乙醇清洗多次后旋蒸干燥，在索氏提取器中用250ml四氢呋喃提取24小时。提取后的产物再用乙醇清洗2次后旋蒸干燥得到约3微米的多
孔微球模板固体粉末；
44.将上面得到的多孔微球模板分散于30毫升冰醋酸中，在1小时内以滴加的方式逐渐加入250毫升浓硫酸，将反应装置升温到80度下反应6小时。反应结束后将装置内的浓硫酸反应液小心倾入含2.5升雪花碎冰中，待混合液降至室温后以离心分离、去离子水清洗多次，最终将得到的多孔离子交换树脂微球80度干燥过夜并分散开；
45.2)磁性纳米粒子的制备
46.在150毫升纯水中，加入150毫升含6.18克六水合氯化铁、2.57克四水合氯化亚铁的水溶液。随后加入400毫升体积分数为3.5％的氨水水溶液，令反应液升温到80度反应2小时，上述反应严格在氮气保护下进行。随后降至室温，将产物离心分离。之后用0.1m hcl溶液超声处理磁性纳米材料5分钟，再用去离子水清洗2次。最后将得到磁性纳米颗粒在80度干燥过夜并研磨成粉末；
47.3)复合磁性微球的制备
48.将上述得到的分散开的多孔离子交换树脂微球与得到的粉末状磁性纳米颗粒混合，加入适量粒径为1-5毫米的二氧化锆球珠，在行星式研磨仪上中速研磨1小时。之后筛分，去掉二氧化锆球珠，经乙醇清洗后，在80度干燥3小时；
49.4)复合磁性微球的无机化合物和有机聚合物包覆
50.将上面得到的复合磁性微球分散于1000毫升体积分数为80％的乙醇水溶液中，搅拌下先后加入15毫升体积分数为28％的氨水水溶液、7.5毫升纯化后的正硅酸四乙酯，令体系在35度下反应3小时。随后将产物离心分离、去离子水清洗数次，最终分散于纯水中，得到二氧化硅涂覆的磁性微球；
51.将二氧化硅涂覆的磁性微球离心去水，重新分散于1000毫升体积分数为80％的乙醇水溶液中，搅拌下先后加入15毫升体积分数为28％的氨水水溶液和10毫升γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，令反应液升温到70度，在氮气保护下反应24小时。待反应结束降温后将产物离心分离、乙醇清洗多次，最终分散于无水乙醇中，得到双键修饰的硅烷化磁性微球；
52.将双键修饰的硅烷化磁性微球离心去乙醇，重新分散于1000毫升质量体积分数为0.25％的十二烷基硫酸钠水溶液中，加入5毫升甲基丙烯酸缩水甘油酯、2克n，n-亚甲基双丙烯酰胺、0.5克过硫酸钾、100毫升无水乙醇，通氮气搅拌1小时后，升温到80度反应24小时。待反应降温后将产物离心分离、无水乙醇清洗数次，最终分散于n，n-二甲基甲酰胺中，得到聚合物包覆的磁性微球；
53.5)复合磁性微球的进一步表面修饰
54.将上述含环氧基的聚合物包覆磁性微球离心去溶剂，重新分散于500毫升n，n-二甲基甲酰胺中，加入6毫升乙二胺，将反应液升温到80度反应24小时。待反应降温后将产物离心分离、乙醇和去离子水交替清洗数次，最终分散于n，n-二甲基甲酰胺中，得到氨基修饰的磁性微球；
55.将得到的氨基修饰磁性微球离心去溶剂，重新分散于500毫升n，n-二甲基甲酰胺中，加入5毫升三乙胺，5克丁二酸酐后于室温下反应24小时。将得到的产物离心分离、乙醇和去离子水交替清洗数次后，最终分散于200毫升纯水中，得到羧基磁性微球，微观照片如图2所示。
56.实施例2利用含环氧基团微球与含氨基基团纳米磁珠固相研磨法制备复合磁性微球
57.称取购得的5微米含环氧基团的聚合物微球3.8克和购得的300纳米含氨基基团的纳米磁珠6.8克，分散在200毫升乙醇中混匀，沉降分离，将固体晾干；将上述得到的分散均匀的固体混合粉末，加入适量粒径为1～5毫米的二氧化锆球珠，在行星式研磨仪上中速研磨1小时；之后筛分，去掉二氧化锆球珠，在80度干燥反应3小时。同时留出一部分聚合物微球和纳米磁珠，不经过固相研磨，直接在80度干燥反应3小时，作为对比实验使用。
58.实施例3固相研磨与否的对比试验
59.将实施例2中经过固相研磨和不经过固相研磨的干燥的复合微球，分别分散于300毫升n，n-二甲基甲酰胺中，加入3毫升三乙胺和5克丁二酸酐后于室温下反应24小时；将得到的产物离心分离、乙醇和去离子水交替清洗数次后，把产物分散在20％乙醇水溶液中，用3微米尼龙膜分离去掉小于3微米的颗粒，最终分散于200毫升纯水中，得到小球附着在大球上面的复合含羧基磁性微球(经过固相研磨的结果如图3所示。)
60.图4和图5是对比的结果，由图4可知，经过固相研磨的，所有大球上面都附着有小球，由图5可知，不经过固相研磨的，有大球上没有或很少小球的微球出现；这说明固相研磨通过机械力增强了小球与大球的接触，提高了两种微球的作用和反应机会，验证了本发明的实验基础。
61.接下来，将上述小球附着在大球上面的含羧基磁性微球分散于100毫升0.5m nacl溶液中，加入最终溶液浓度为0.5％的聚乙烯亚胺(分子量为1800)，室温搅拌1小时；用0.5mnacl溶液洗涤两次，加入3克edc-hcl和2克nhs，室温震荡反应1小时，在表面进行键合和交联。水洗三次，得到表面涂覆聚乙烯亚胺的含氨基功能团的磁性微球。
62.以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
63.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。