空病毒衣壳和全病毒衣壳颗粒的分离和定量的制作方法

空病毒衣壳和全病毒衣壳颗粒的分离和定量
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月12日提交的美国申请62/873,619的优先权，该申请的公开内容通过引用整体并入本文。
3.发明背景
4.腺相关病毒(aav)载体已成为基因治疗中最流行的病毒载体递送系统之一。基于aav的基因递送载体(重组aav或raav)包含含有治疗性转基因的aav衣壳。细胞培养中aav载体生产的特征是形成过量的“空”衣壳，这些衣壳缺乏载体基因组，因此无法提供治疗益处。空衣壳对临床结果的影响尚不清楚，但其潜在增加对载体的先天性或适应性免疫应答是主要的担忧。
5.将空载体颗粒量化为杂质的分析方法的开发在病毒制剂、药物组合物和药物产品的表征方面受到了特别关注。目前可用的确定空病毒颗粒百分比(或空与全比率)的方法是费力、麻烦、低通量和/或低分辨率的。已经尝试过在制造过程中分离空aav和raav(“全”)颗粒并通过色谱法纯化raav颗粒；然而，尚未实现在对应于空颗粒的峰和对应于包含目标基因组的aav载体的峰之间的成功基线峰分辨率。
6.因此，仍然需要新的aav特异性测定法，以用于在非常适合高质量标准如当前的良好生产规范和usp标准的严格要求的制造过程、载体产品释放和/或药品分析中进行筛选。
7.发明概述
8.本公开提供了分离病毒制剂(例如，aav制剂)中的空衣壳和全衣壳(例如，空aav衣壳和全aav衣壳)的方法。该方法包括使病毒制剂和流动相运行通过离子(例如，阴离子或阳离子)交换柱，其中流动相在包括不连续洗脱梯度和至少一种(例如，1、2、3、4或5种)等度保持(isocratic hold)的条件下运行。
9.在另一个方面，本公开提供了量化病毒制剂(例如，aav制剂)中的空衣壳和全衣壳(例如，空aav衣壳和全aav衣壳)的方法。该方法包括使病毒制剂和流动相运行通过阴离子或阳离子交换柱，其中流动相在包括不连续洗脱梯度和至少一种(例如1、2、3、4或5种)等度保持的条件下运行。
10.在本方法的一些实施方案中，病毒制剂和流动相在高性能液相色谱(hplc)系统上运行。
11.在一些实施方案中，空衣壳和全衣壳通过基线分辨率分离，例如大于2.0的基线分辨率。
12.在一些实施方案中，该方法中使用的阴离子交换柱是强阴离子交换(sax)柱，例如季胺(q-胺)柱。在一些实施方案中，阴离子交换柱是整体柱(monolith column)。
13.在一些实施方案中，该方法中使用的阳离子交换柱是强阳离子交换(scx)柱，例如苯磺酸柱。在一些实施方案中，阳离子交换柱是整体柱。
14.在一些实施方案中，本方法中使用的流动相包含盐。在进一步的实施方案中，盐是四甲基氯化铵(tmac)或乙酸钠。在某些实施方案中，流动相的最终梯度包含0.1m至10m(例如，0.5m至5m，如1m、1.5m或2m)的盐。在某些实施方案中，盐为0.5m至5m(例如，1m)的tmac或
乙酸钠。
15.在一些实施方案中，在流动相达到最终梯度的50％之前引入至少一种等度保持，例如在流动相达到最终梯度的20％、25％、30％、35％、40％或45％之前引入至少一种等度保持。
16.在一些实施方案中，流动相的ph为约8至约10，例如约9。
17.在一些实施方案中，柱具有在0℃和50℃之间的温度，例如在20℃和25℃之间的温度。
18.还提供了通过本方法制备的高度纯化的重组病毒组合物(例如，aav组合物)。在一些实施方案中，病毒组合物包含100％的空衣壳或少于100％(例如，少于95％、少于90％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％)的空衣壳。在具体的实施方案中，本公开提供了富含空病毒衣壳的病毒制剂，该制剂通过本发明所述的方法获得，任选地制剂中不超过20％(例如，不超过15％、不超过10％、不超过5％、或不超过1％)的病毒衣壳是全病毒衣壳。在特定的实施方案中，本公开提供了富含全病毒衣壳的病毒制剂，该制剂通过本发明所述的方法获得，任选地制剂中不超过20％(例如，不超过15％、不超过10％、不超过5％、或不超过1％)的病毒衣壳是空病毒衣壳。
19.在一些实施方案中，本文中的aav可以衍生自一种或多种血清型，例如aav1、aav2、aav3、aav6、aav8和aav9。
20.在一些实施方案中，本文中的重组aav(raav)具有约20至9,000个碱基大小的重组基因组。
21.在下面的详细描述中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应该理解的是，详细描述虽然指示了本发明的实施方案和方面，但仅作为说明而不是限制的方式给出。本发明范围内的各种改变和修改将从详细描述中对本领域技术人员显而易见。
附图说明
22.图1a和图1b是显示空aav(峰1)和全aav(峰2)颗粒的峰位置的三种不同样品(堆叠)的代表性hplc色谱图。ffb:最终制剂缓冲剂。raav6-gla3:携带α-半乳糖苷酶a(gla)转基因的重组aav6。raav6-gla2:重组aav6-gla病毒的不同生产批次。aav6空：空aav6衣壳样品。
23.图2是显示通过hplc计算的全衣壳百分比相对于载体基因组与衣壳颗粒(vg/衣壳)比率的比较和相关性的图。
24.图3是显示全衣壳的峰面积和相同样品的不同进样体积的线性关系的堆叠hplc色谱图。
25.图4是显示全衣壳的峰面积和hplc分析的相同样品的不同进样体积的线性关系的图。
26.图5是显示全衣壳的峰面积和相同样品在恒定进样体积下的不同衣壳浓度的线性关系的堆叠hplc色谱图。
27.图6是显示全衣壳的峰面积和在恒定进样体积下通过hplc分析测量的相同样品的
不同衣壳浓度的线性关系的图。
28.图7是显示具有归一化衣壳浓度的不同raav样品和aav空样品的峰分离的hplc色谱图。raav6-375-1：携带α-l-艾杜糖醛酸酶(idua)转基因的重组aav6。raav6-375-2：携带idua转基因的重组aav6的不同生产批次。raav6-gla1：携带不同于raav6-gla2或3中的gla表达盒的重组aav6。
29.图8是显示柱温度对全raav6-gla2(“gla2”)衣壳样品的峰分离和保留时间的影响的hplc色谱图。
30.图9a和9b是比较来自不同商业供应商的aav和raav样品的空峰和全峰分离和保留时间的hplc色谱图。样品包括空aav6批次(lot)1、空aav6批次2和空aav6批次3。
31.图10是比较使用四种不同洗脱缓冲液的raav6-gla3和aav6-030[空aav6批次030]样品的保留时间的hplc色谱图。
[0032]
图11a是hplc色谱图，其显示了连续进样混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品，采用含有tmac的洗脱缓冲液以约0-100％的梯度运行的hplc结果。
[0033]
图11b是hplc色谱图，其显示了连续进样混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品，采用含有tmac的洗脱缓冲液以约15-30％的梯度运行的hplc结果。
[0034]
图11c是hplc色谱图，其显示了连续进样空aav6-030样品，采用含有tmac的洗脱缓冲液以约15-30％的梯度运行的结果。
[0035]
图12a是hplc色谱图，其显示了全raav6-gla3和空aav6-030样品在使用包含不同ph水平的tmac的洗脱缓冲液的整体hplc柱上运行的峰分离和保留时间结果。
[0036]
图12b是hplc色谱图，其显示了全raav6-gla3和空aav6-030样品在使用包含不同ph水平的tmac的洗脱缓冲液的弱阴离子交换(wax)hplc柱上运行的峰分离和保留时间结果。
[0037]
图13是hplc色谱图，其显示了全raav6-gla3和空aav6-030样品在串联配置的使用包含不同ph水平的tmac的洗脱缓冲液的aav整体柱和弱阴离子交换(wax)hplc柱上运行的峰分离和保留时间结果。
[0038]
图14是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用约10分钟和15分钟的缓梯度(较长的hplc运行时间)的峰分离和保留时间结果。
[0039]
图15是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用约10、15、20、25和30分钟的缓梯度洗脱缓冲液的峰分离和保留时间结果，与全raav6-gla3和空aav6-030样品使用约5分钟的洗脱缓冲液运行时间梯度的峰分离和保留时间结果的比较。
[0040]
图16是hplc色谱图，其显示了混合全raav6-gla3和空aav6-030样品使用约1、2、3、4和5分钟的洗脱缓冲液运行时间梯度的峰分离和保留时间结果。
[0041]
图17是hplc色谱图，其显示了包含全raav6-gla3的样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约15％-30％或15％-35％的梯度和约17％或18％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果。
[0042]
图18是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约15％-30％或15％-35％的梯度和约18％或19％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果。
[0043]
图19是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含
tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约19％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果。
[0044]
图20是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约19％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果。
[0045]
图21是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约19％的等度保持运行，并且响应时间为约0.031s/0.13s/0.5s的峰分离和保留时间结果。
[0046]
图22是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％、5％-40％或10％-40％的梯度和约19％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果。
[0047]
图23是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约5％-40％的梯度和约19％的等度保持和约20℃、25℃、30℃或35℃的柱温运行的峰分离和保留时间结果。
[0048]
图24是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约5％-50％的梯度和约19％的等度保持和约20℃或35℃的柱温运行的峰分离和保留时间结果。
[0049]
图25是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约19％的等度保持运行，并且检测波长设置为280nm激发和348/350/355nm发射的峰分离和保留时间结果。
[0050]
图26是hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约19％的等度保持运行，并且检测波长设置为348nm激发和280/350/355nm发射的峰分离和保留时间结果。
[0051]
图27是一组hplc色谱图，其显示了制剂缓冲液(fb)、空(e)、全(f)和空 全衣壳混合组合物样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约5％-40％或约5％-50％的梯度和约19％的等度保持运行的峰分离和保留时间结果的比较。
[0052]
图28a和28b是hplc色谱图，其显示了全raav6-gla3样品在约2、4、6、8、10和20μl下峰面积的负载线性关系。
[0053]
图29a和29b是hplc色谱图，其显示了空aav6-030样品在约2、4、6、8和10μl的进样体积下峰面积的负载线性关系。
[0054]
图30a和30b是显示全raav6-gla3和空aav6-030样品的峰面积的稀释线性关系的图。
[0055]
图31是显示混合样品的uv 260nm和280nm迹线的hplc色谱图，其显示出空aav峰和全aav峰的峰高的经典的260/280转换。
[0056]
图32是显示全raav6-gla3和空aav6-030样品的不同混合物的校准图的图，其表明了峰面积和衣壳浓度之间的线性关系。
[0057]
图33是一组hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包含tmac的洗脱缓冲液在不同ph值下运行的峰分离和保留时间结果。
[0058]
图34是一组hplc色谱图，其显示了混合的全raav6-gla3和空aav6-030样品使用包
含tmac的洗脱缓冲液在不同柱温下运行的峰分离和保留时间结果。
[0059]
图35a和35b是全raav6-gla3和空aav6-030样品的cryotem分析的代表性图。
[0060]
图36a和36b是代表性hplc色谱图，其显示了用于与cryotem比较的全raav6-gla3、空aav6-030和其他样品的峰分离和保留时间结果。
[0061]
图37a和37b是显示通过auc、hplc和cryotem方法测试的来自不同raav6样品的空aav衣壳(a)和全aav衣壳(b)的百分比定量比较的图。
[0062]
图38a和38b是显示使用hplc和cryotem使用jmp软件计算的不同病毒样品中空(a)和全(b)aav颗粒百分比的相关性的图。
[0063]
图39是一组hplc色谱图，其显示了针对aav1空批次和重组aav1样品(aav1-cmv-gfp、17-aav-321和17-aav-037)使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-30％的梯度和约20％的等度保持运行的空衣壳和全衣壳的峰分离、保留时间和定量百分比结果。
[0064]
图40是一组hplc色谱图，其显示了针对aav2空批次和重组aav2样品(17-aav-077和17-aav-155)使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-30％的梯度和约12％的等度保持运行的空衣壳和全衣壳的峰分离、保留时间和定量百分比结果。
[0065]
图41是一组hplc色谱图，其显示了针对aav3空批次和重组aav3样品(aav3-cmv-gfp、17-aav-124和17-aav-324)使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-30％的梯度和约15％的等度保持运行的空衣壳和全衣壳的峰分离、保留时间和定量百分比结果。
[0066]
图42a和42b是hplc色谱组图，其显示了针对aav8空批次(17-aav-082)和重组aav8样品(18-aav-070、17-aav-339、17-aav-340、17-aav-341和aav8 rsm)使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-30％的梯度和约14％的等度保持运行的空衣壳和全衣壳的峰分离、保留时间和定量百分比。
[0067]
图43是一组hplc色谱图，其显示了针对样品pd批次076、pd70批次19-bav-484pd、pd76批次20-bav-027pd和run24批次19-bav-470样品使用包含tmac的洗脱缓冲液以约0％-40％的梯度和约5％的等度保持运行的空和全aav9衣壳的峰分离、保留时间和定量百分比结果。
[0068]
发明详述
[0069]
本发明所述的方法可用于使用柱色谱在如aav药物组合物和药物产品的aav制剂中分离和量化空腺相关病毒(aav)衣壳和全aav(例如重组aav或raav)衣壳。例如，高效液相色谱(hplc)，也称为高压液相色谱，可用于对病毒制剂、药物组合物和药物产品中的空aav衣壳和全aav(raav)衣壳进行基线分离，以达到准确测量每个峰的面积或高度的程度。
[0070]
aav病毒是一种无包膜单链dna病毒，其可通过工程改造将dna(例如，治疗或报告基因)递送至靶细胞。在aav载体制造过程中，dna通过aav复制酶(rep)蛋白的作用被包装成自组装的病毒颗粒。然而，这种dna包装过程通常效率低下，产生大量缺乏载体基因组的空颗粒。取决于所使用的制造工艺，空颗粒污染可以是用于基于转染的程序的全颗粒的高达20到30倍(lock等人，hum.gene ther.(2010b)21:1273-1285)。空颗粒的存在显著地增加了治疗期间给予的aav衣壳蛋白的剂量，因此增加了针对载体衣壳的非预期的免疫后果的可能。因此，本发明所述的方法也可用于纯化大规模生产批次的病毒制剂、药物组合物和药物产品。
[0071]
术语“空衣壳”、“空病毒颗粒”和“空aav”是指aav病毒体，其包含与所需产品基本
相似的aav蛋白衣壳，但缺少包装在其中的核酸分子。
[0072]
术语“全衣壳”、“全病毒颗粒”、“raav”和“全raav”是指aav病毒体，其包含包裹感兴趣核苷酸序列的aav蛋白衣壳。
[0073]
发明人意外地发现，改进的hplc参数可用于实现对应于样品中空aav衣壳和全aav衣壳的色谱峰之间的基线分辨率。峰分辨率是色谱图上两个峰之间的距离。“基线分离”或“基线分辨率”是指分辨率因子为至少1.5。当分辨率》1.5时，两个峰之间将存在约《1％的相互干扰。在一些实施方案中，对应于空病毒颗粒和全病毒颗粒(衣壳)的色谱峰以》2.0的基线分辨率分离。在一些实施方案中，峰分辨率大于2.0。
[0074]
本发明所述的hplc系统包括固定相和流动相。例如，包含聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙烯酯)载体基质的整体强阴离子交换(sax)柱可用作固定相，以基于空颗粒与载体相比稍弱的阴离子性质分离空aav衣壳和全aav衣壳。在某些情况下，在样品结合条件允许的情况下，为了实现色谱峰基线分离，使用弱阴离子交换(wax)柱可能是有益的。在某些情况下，在样品结合条件允许的情况下，为了实现色谱峰基线分离，使用强阳离子交换(scx)柱或弱阳离子交换(wcx)柱可能是有益的。保留时间(rt)优选足够高，以允许更好地分离峰并增加容量因子。因此，可以调节流动相的酸碱度以实现基线分离。在一些实施方案中，sax、wax、scx或wcx柱或多个强aex、cex、sax、wax、scx或wcx柱可以以串联布置使用，其连接使得柱长度增加。
[0075]
在一些实施方案中，流动相包含缓冲组合物，例如双三丙烷(btp)。流动相缓冲液浓度可以变化。例如，可以使用约1mm至约100mm(例如，1至50mm)的浓度。在一些实施方案中，流动相中的洗脱缓冲液可包含一种或多种盐，包括但不限于氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、四甲基氯化铵(tmac)、乙酸钠(naoac)和/或乙酸铵(nh4oac)。在一些实施方案中，盐的浓度可为约0.1m至约10m，或约0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.5m、2.0m、3.0m、3.5m、4m、4.5m、5.0m、5.5m、6.0m、6.5m、7m、7.5m、8.0m、8.5m、9.0m或9.5m。在一些实施方案中，缓冲组合物的ph为约9.0。在一些实施方案中，流动相缓冲液的ph在约8.0至约9.5的范围内。
[0076]
流动相可以作为梯度运行(即梯度洗脱色谱)。色谱运行期间流动相组成的稳定变化称为梯度洗脱。例如，洗脱溶剂可以以特定的百分比开始，并且可以随着时间稳定增加。梯度可以从0％开始增加至约100％。在一些实施方案中，梯度从约2％-15％开始并增加至约30％-100％，其中流动相包含1m盐洗脱溶剂。在其他实施方案中，梯度从约10％开始并增加至约30％。在其他实施方案中，梯度从约15％开始并增加至约30％。在其他实施方案中，梯度从约15％开始并增加至约35％。在其他实施方案中，梯度从约15％开始并增加至约40％。在其他实施方案中，梯度从约15％开始并增加至约45％或约50％。
[0077]
流动相可以以缓梯度(较长的运行时间或较慢的洗脱溶剂强度增加)或陡梯度(较短的运行时间或较快的洗脱溶剂强度增加)或两者的组合运行。此外，可以在梯度流动相中加入等度保持。在等度保持或流动中，流动相组成保持不变。发明人已经做出了一项重要发现，即在梯度洗脱中加入等度保持显著提升了对应于空病毒颗粒和全病毒颗粒的色谱峰的分辨率，并产生了峰的基线分离。这转而增加了样品中测量的空病毒颗粒和全病毒颗粒的量的准确度。
[0078]
在某些实施方案中，约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约
17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％的等度保持可以并入色谱运行的梯度洗脱。在一些实施方案中，峰对称性也通过在该方法中添加两侧有两个梯度的等度保持而得到改善。在其他实施方案中，峰不对称和拖尾小于2.0。
[0079]
在一些实施方案中，流动相的运行时间，无论是否以梯度运行，都在约1分钟至60分钟之间。在其他实施方案中，流动相的运行时间为约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约31分钟、约32分钟、约33分钟、约34分钟、约35分钟、约36分钟、约37分钟、约38分钟、约39分钟、约40分钟、约41分钟、约42分钟、约43分钟、约44分钟、或约45分钟。
[0080]
本发明所述的hplc方法可与uv或荧光检测一起使用。在一些实施方案中，用于激发和发射的波长分别设定为280nm
±
20nm和348nm
±
20nm。
[0081]
在一些实施方案中，检测器的响应时间设定为0.5秒。在一些实施方案中，响应时间被设置用于在色谱峰上产生至少20个数据点。在一些实施方案中，响应时间被设置在约0.1-1.0秒之间。
[0082]
病毒制剂可以通过任何已知的生产系统获得，例如哺乳动物细胞aav生产系统(例如基于293t或hek293细胞的系统)和昆虫细胞aav生产系统(例如基于sf9昆虫细胞的系统和/或使用杆状病毒辅助载体的系统)。可以通过使用众所周知的技术如不连续氯化铯密度梯度从细胞培养物中纯化病毒制剂(参见，例如，grieger,mol ther methods clin dev.(2016)3:16002)。
[0083]
本方法可用于纯化和分析多种aav血清型的病毒制剂，例如aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav8.2、aav9、aavrh10、aav10和aav11，以及其变体、杂交体、嵌合体或假型。“假型”或“交叉包装”的raav是指重组aav，其衣壳被另一种aav血清型的衣壳取代，以例如改变病毒的转导效力或嗜性特征(例如，balaji等人,j surg res.184(1):691-8(2013))。“嵌合”或“杂交”raav是指重组aav，其衣壳由衍生自不同血清型的衣壳蛋白组装而来和/或其衣壳蛋白是具有衍生自不同血清型的序列的嵌合蛋白(例如，血清型1和2；参见，例如，hauck等人,mol ther.7(3):419-25(2003))。例如，本方法可用于纯化和分析重组aav，其基因组如itr衍生自如aav2的血清型，而其衣壳衍生自另一种血清型；例如，aav2/8、aav2/5、aav2/6、aav2/9或aav2/6/9；参见，例如，u.s.专利7,198,951和9,585,971。
[0084]
除非本发明另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，但是与本发明描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。一般而言，本发明所述的心脏病学、医学、药物和药物化学以及细胞生物学所使用的相关命名法和技术是本领域公知和常用的。酶促反应和纯化技术如本领域中常见的或如本发明所述根据制造商的说明书进行。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。在整个说明书和实施方案中，词语“具有”和“包含”或其变体如“有”、“拥有”、“包括”或“含有”将被理解为意味着包括所述整数或整数的组，但不排除任
何其他整数或整数的组。本发明提到的所有出版物和其他参考文献通过引用整体并入。尽管本发明引用了许多文献，但该引用并不应该被视为承认这些文献中的任何一个构成本领域普通常识的一部分。如本发明所用，用于一个或多个感兴趣值的术语“约”或“大约”指的是与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，该术语指的是落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的数值范围，除非另有说明或从上下文中明显看出。如本发明所用，两个数字“之间”的值可以是两个数字之一。
[0085]
为使本发明得到更好的理解，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0086]
实施例1：阴离子交换hplc用于分离空病毒颗粒和全病毒颗粒
[0087]
评估了阴离子交换hplc分离病毒制剂内空aav颗粒和重组aav(raav)(全)颗粒的能力。运行四种不同的aav样品以评估空aav衣壳和全aav衣壳(raav样品)的色谱峰分离和峰定位。样品包括：最终制剂缓冲液(ffb)；主要包含由供应商制造的全aav衣壳(全raav6-gla3)的参考样品；主要包含全aav衣壳(raav6-gla3)的sangamo制备样品；和主要包含空aav衣壳(空aav6-030)的sangamo制备样品。
[0088]
使用了安捷伦1100hplc系统。液相色谱-质谱(lc-ms)级或hplc级试剂可用于减少背景。在该实施例中，lc-ms级试剂用于制备包含双三丙烷和氯化钠的流动相。通过将hplc级或高纯度化合物溶解在lc-ms级水中制备hplc缓冲液。将缓冲溶液调节至适当的ph并通过0.2μm过滤器过滤。然后将溶液转移到hplc瓶中。在此实施例中，选择hplc系统的a管线用于含盐量较低的缓冲液，而选择b管线用于含较高盐浓度的缓冲液。选择c管线用于hplc级水，而d管线用于异丙醇(ipa)。管线c和d仅在需要更换溶剂或冲洗系统时使用。为了分离，使用整体aav分析柱。在实验开始之前，将溶剂管线放入适当的瓶中，并以3毫升/分钟的速度冲洗至少5分钟(每条管线)。
[0089]
cimac
tm aav全/空-0.1分析柱(1.3μm)阴离子交换柱(bia separations，斯洛文尼亚)用高盐缓冲液以1毫升/分钟清洗10-15分钟，同时监测压力(通常低于色谱柱规格)。然后用该方法的初始条件平衡该柱。如果需要切换缓冲液，则先用水冲洗溶剂管线，然后再用下一个缓冲液冲洗。对于长期储存，在关闭系统之前，用ipa冲洗溶剂管路和系统。使用双三丙烷(btp)作为缓冲剂，因为其具有两个pka值并涵盖一系列ph值(约6.5
–
9.5)。缓冲液浓度选择为约20mm，以提供足够的缓冲能力而不显著增加离子强度。然而，可以使用其他合适的浓度。
[0090]
图1a和图1b是显示空aav(峰1)和全aav(峰2)颗粒的峰位置的三种不同样品(堆叠)的代表性色谱图。如图1a(30分钟)和图1b(15分钟)所示，所有样品均表现出明显的峰分离模式。主要包含全衣壳的样品显示出对应于空衣壳的较小峰，随后是对应于全衣壳的较大峰，二者之间没有基线分离。空aav样品显示出对应于空衣壳的较大峰，其指示了空aav颗粒与全aav颗粒的峰定位。
[0091]
尽管由于较高的灵敏度显示了来自荧光(trp)模式的数据，但使用uv也观察到了类似的峰模式。
[0092]
所有三种样品都显示出空aav和全aav颗粒的一致峰位置(保留时间)。尽管没有基线分辨率，但使用峰积分计算峰面积。峰面积的比例可用于计算空aav与全aav的比率。尽管为了达到根据usp规定的可验证的测定，峰之间的基线分辨率是必要的，但这种方法可用于估计aav药物产品中空颗粒的近似百分比。
[0093]
实施例2：阴离子交换hplc用于计算病毒样品中空病毒颗粒和全病毒颗粒的百分比
[0094]
来自多个样品的峰面积用于计算每个样品中的全aav颗粒的百分比。另外，使用靶向aav盒中bgh poly a区域的引物/探针序列测量vg滴度，并且使用aav6 elisa试剂盒测量衣壳滴度。基于vg和衣壳数据，计算比率以获得全aav颗粒的百分比。表1显示了通过实施例1(两次运行)中描述的hplc方法确定的峰面积、vg和衣壳滴度。
[0095]
全raav6-381含有包含针对锌指核酸酶(zfn)转基因的表达盒的基因组，并且该基因组大小为2,629个碱基。全raav6-375含有包含针对idua转基因的表达盒的基因组，并且该基因组大小为3,077个碱基。全raav6-384含有包含针对ids转基因的表达盒的基因组，并且该基因组大小为2,780个碱基。全raav6-gla3含有包含针对gla转基因的表达盒的基因组，并且该基因组大小为2,772个碱基。全raav6-gla1和全raav6-gla2各自含有包含针对gla基因的表达盒的基因组，并且基因组大小分别为2,729个碱基和3,321个碱基。此处使用的所有样品是仅用于研究的样品。
[0096]
表1.通过hplc方法与vg/衣壳方法计算的全aav％
[0097][0098]
绘制通过hplc和vg/衣壳测量的全病毒颗粒的百分比并与所有样品进行比较。除了gla1和gla2样品外，所有样品的比率相似，表明hplc和其他可接受方法的结果之间存在相关性。方法的比较如图2所示。
[0099]
实施例3：用于计算病毒样品中空病毒颗粒和/或全病毒颗粒百分比(％)的阴离子交换hplc的精度
[0100]
为测试实施例1中描述的hplc方法的精度，全raav6-375和全raav6-381的相同样品运行5次并且计算全aav颗粒的峰面积。样品全raav6-375和全raav6-381的不同之处在于样品中的病毒颗粒含有不同的转基因。基于usp指南，精度应为《2％。如表2和表3所示，测量的峰面积显示出《2％的进样精度。回收率也接近100％(根据第一次样品进样计算)。还获得uv260和280的峰面积并用于计算260/280的比率。然而，荧光信号显示了较高的信噪比。
[0101]
表2.样品1(全raav6-375)的5次独立进样的精度和峰面积的回收％
[0102][0103]
表3.样品2(全raav6-381)的5次独立进样的精度和峰面积的回收％
[0104][0105]
实施例4：针对不同进样体积、衣壳浓度和衣壳含量的阴离子交换hplc的线性关系
[0106]
分析进样体积以及衣壳浓度的线性关系。根据先前描述的方法进行hplc程序。如图3和图4所示，当相同样品的体积变化时，发现全aav颗粒的峰面积结果是线性的。
[0107]
还使用ffb将样品稀释到不同的衣壳滴度，然后将相同体积的每个稀释样品进样到hplc系统中。类似地，当衣壳的浓度在恒定样品体积中变化时，发现全aav颗粒的峰面积结果是线性的。图5和图6显示了在恒定体积下不同的进样衣壳浓度之间的线性关系。
[0108]
根据所描述的方法分析具有相似衣壳滴度的不同病毒组合物样品。用ffb将样品稀释至相同的衣壳滴度，并为每个稀释的样品进样相同的体积。这些结果表明，无论样品类型如何，进样的衣壳量大致相同。还证明了归一化样品的一致峰面积，如图7所示。
[0109]
包含gla的aav6衣壳样品用于确定不同温度下的峰分离。图8显示，在约20℃至约35℃的温度范围内，存在一致的峰分离。
[0110]
来自不同商业供应商的含有gfp转基因或空制剂的aav样品显示，所有样品包含全aav颗粒和空aav颗粒的异质混合物。如图9a所示，样品全raav6-gla3具有最高百分比的全aav颗粒。
[0111]
实施例5：安捷伦1260hplc系统的洗脱剂变化
[0112]
在安捷伦1260hplc系统上分析来自先前实施例的样品，并显示出类似的结果和峰分离模式(数据未示出)。
[0113]
分析了四种洗脱盐(1m的nacl、tmac、乙酸钠和乙酸铵溶液)在对应于空衣壳和全衣壳的色谱峰之间的基线分离。得到全衣壳样品(全raav6-gla3)和空衣壳样品(aav6-030)的洗脱曲线。除非另有指示，使用先前描述的方法。因为洗脱剂的离子和洗脱强度是不同的，所以将洗脱液缓冲梯度保持在0-100％以获得完整的洗脱曲线。比较全raav6-gla3和空aav6-030的主峰保留时间(rt)，并用于计算净rt。最高净差异应产生最清晰的基线分离。
[0114]
四种洗脱盐的洗脱曲线如图10所示，且四种洗脱盐的净rt差异在表4中列出。氯化钠(nacl)显示了最高的洗脱强度(并且因此最低的rt)，而乙酸铵(nh4oac)显示了最低的洗脱强度(并且因此较高的rt)。使用四甲基氯化铵(tmac)时显示了最高的净rt差异，随后是乙酸钠(naoac)，而nacl和nh4oac在两个样品之间产生较低的净rt差异。
[0115]
表4.全raav6-gla3和空aav6-030洗脱的净rt差异
[0116]
洗脱盐(1m)空峰rt(分钟)全峰rt(分钟)净rt(分钟)
nacl3.6993.7830.084tmac3.9714.1390.168naoac4.0804.2270.147nh4oac4.2674.3440.077
[0117]
实施例6：包含不同梯度的tmac的流动相
[0118]
分析了tmac的不同梯度，以提升对应于全病毒颗粒和空病毒颗粒的峰之间的基线分离。除非另有指示，如前所述进行该方法。缓冲液a包含ph9.0的20mm btp，而缓冲液b包含ph9.0的20mm btp和1m tmac。以往，梯度以0-100％运行。但是为了提升峰分离，对较缓和较窄梯度进行了评估。每个梯度使用全raav6-gla3样品、空aav6-030样品以及两种样品的混合运行。使用五次进样来评估可重复性。
[0119]
图11a到图11c示出了使用包含tmac的洗脱缓冲液对全raav6-gla3、空aav6-030和混合样品显示梯度分离的色谱图。全衣壳和空衣壳混合样品的连续进样给出了一致的峰rt和峰面积，从而证明了该方法的高精度。此外，来自混合样品的空峰与空aav6-030样品的主峰相匹配(图11a-图11c)。为了进一步提升空衣壳和全衣壳的峰分离，将梯度从0-100％收窄到约15-30％，并运行多次测定以确定可重复性。虽然较窄梯度的峰分离更佳，但其峰也变得更宽。来自空衣壳和全衣壳混合样品的峰与来自全raav6-gla3样品和空aav6-030样品的类似峰相对应，表明混合两种样品不会导致峰rt的任何非预期的移动。这些结果表明，通过包括不同有效载荷的不同方法产生的病毒样品仍然可以包括合理数量的可以识别和区分的空颗粒和全颗粒。
[0120]
实施例7：采用弱阴离子交换柱和串联色谱的梯度法
[0121]
在实施例1-6中，使用aav强阴离子交换(aex)整体柱。在该研究中，分析了弱阴离子交换柱(例如，biowax np3(无孔，4.5
×
50mm，3μmhplc柱)以确定其对空病毒颗粒和全病毒颗粒峰分离的影响。还分析了串联柱以确定增加柱长或组合两种基质(弱和强aex)对空病毒颗粒和全病毒颗粒峰分离是否产生影响。使用连接器将整体柱和wax柱背靠背连接以进行串联色谱。使用包含raav6-gla039(携带gla转基因的重组aav6批次039；sangamo，richmond，ca)和空aav6-030的样品。除非另有指示，使用先前实施例中描述的方法。对于wax柱和整体柱，分析了不同流动相的ph水平对空病毒颗粒和全病毒颗粒色谱峰基线分离的影响。
[0122]
整体柱与ph9.0的流动相显示出强烈的结合。在较低的ph水平下，rt向左移动表明结合丢失或者减少的结合和更快的洗脱。rt优选足够高，以允许更好地分离峰并增加容量因子。然而，包含某些ph水平的流动相并未显示峰分离。与整体柱相比，wax柱在相同的ph水平显示出对样品更紧密的结合(高rt)。与整体柱相比，wax柱可见较少的峰分离。此外，峰不对称性变得更大(更宽的峰)。在较低的流动相ph水平下，两种柱都显示较低的aav结合，并且病毒组合物的部分或大部分在空隙体积(0-1.5ml之间)中洗脱(图12a和图12b)。
[0123]
当柱串联使用时，其峰分离与单独的整体柱相似。此外，当ph降低时，结合减少(更的低rt)且全衣壳和空衣壳峰之间的分离较小。类似地，当连接两个整体柱进行串联色谱时，峰分离仍然是相同的，如图13所示。
[0124]
结合所述方法和样品，整体柱(具有q-胺)比wax柱(具有二乙基氨基乙基(deae))产生更好的峰分离。
[0125]
实施例8：采用整体柱的缓梯度
[0126]
分析了较缓的梯度(较长的运行时间)以确定全病毒颗粒和空病毒颗粒色谱峰之间的改进的峰分辨率。使用整体aav柱，将梯度设定为缓冲液b的15-30％。运行时间不同。在原始方法中，梯度运行超过5分钟。分析了五个更多梯度(10、15、20、25和30分钟)。因此，每个实验的运行时间变长。全raav6-gla3和空aav6-030的混合用作病毒组合物的测试样品。还分析了更快的梯度(1、2、3和4分钟)。
[0127]
转到图14，较缓的梯度没有提高峰分辨率，因为峰更宽并且被分解。然而，当在5分钟的梯度时间比较单个样品和混合样品时，即使未显示峰基线分辨率，也可以看到具备不对称性的更尖锐的峰。另一方面，如果使用较快的梯度(1-4分钟)，则分离并未改进且峰变得更尖锐(图15和图16)。尽管期限快速的方法，但是运行时间应当足够长以允许有效的hplc峰分离。
[0128]
实施例9：梯度流动相内的等度保持产生对应于空病毒颗粒和全病毒颗粒的峰之间的基线分离
[0129]
等度保持被纳入梯度方法，以确定其对对应于病毒组合物中空病毒颗粒和全病毒颗粒的色谱图峰之间的基线分离的影响。raav6-gla039用作全病毒颗粒样品。以10分钟的梯度时间(相同的运行时间，不同的梯度)对约17％、18％、19％或20％的等度保持进行测试。一旦确定优选的条件，就对包含全raav6-gla3和空aav6-030的混合样品进行分析。
[0130]
实验开始之前将样品在冰上新解冻。直接分析每个样品或者如有需要在ffb中稀释后分析每个样品。将样品转移到hplc瓶中并用具有狭缝的适当盖子封盖。然后将瓶转移到预期位置的hplc多采样器，其位置在序列内鉴定。
[0131]
如图17至图19所示，包含等度保持作为梯度流动相的一部分，在相同样品中产生了对应于空衣壳和全衣壳的峰之间的基线分离。包含约17％或18％的等度保持产生了fabry样品的清晰分离(图17)。分析混合样品时，显示了具有清晰的峰基线分离的类似图形(图18)。尽管在较高百分比(约19％或20％)的等度保持下显示了峰分离，但样品没有完全结合，部分样品在空隙体积中洗脱。
[0132]
为了获得完全结合，将约0-40％的梯度与等度保持联合使用。该梯度允许样品以最低离子强度结合，并使用等度保持维持峰分离。这些条件产生了在空峰和全峰之间具有清晰基线分辨率的所有或大部分样品组合物的结合(图19)。
[0133]
向梯度流动相添加等度保持产生了对应于空病毒颗粒和全病毒颗粒的峰之间的基线分辨率。为了使用本发明所述的方法对样品中的组分进行定量，优选允许结合全部样品的条件以确保样品在柱上经历梯度分离并且很少或没有样品产物在空隙体积中洗脱。
[0134]
实施例10:用于增强样品结合、峰对称性和对应于空病毒颗粒与全病毒颗粒的峰之间的基线分离的条件
[0135]
分析了例如初始梯度百分比和等度保持百分比的方法条件，以增强样品结合和峰对称性并减少峰拖尾。另外，获得用于荧光检测的上限波长。除非另有指定，否则使用实施例5中所述的方法。使用样品全raav6-gla3和空aav6-030的混合物来进一步改进梯度方法。选择了19％的等度保持，并改变了梯度开始和结束的百分比。此外，改变激发和发射波长以获得优选的波长。
[0136]
19％的等度保持导致了全病毒颗粒和空病毒颗粒峰的基线分离，如图20所示。初
始梯度为0％，其线性地增加至约15％，随后逐渐增加至约19％，等度保持在此显示了空aav6颗粒的分离。进一步的梯度增加至约40％或50％，导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用增加至约100％的进一步梯度以清洁柱。优选在梯度开始时使用较低百分比的缓冲液b，以使对应于空aav6颗粒的峰形和宽度变窄。因此，选择5％的开始梯度作为初始梯度。结果表明，5％初始梯度改善了空aav6的峰不对称性。此外，约50％的最终梯度导致了改善的全aav6峰对称性。约5-15-50％的梯度的使用导致了》2.0的分辨率和《2.0的不对称性和拖尾，其符合用于hplc分析的usp方法的要求。
[0137]
为了确定优选的激发/发射波长，通过固定一个参数并改变另一个参数来进行实验。分别为280nm和348nm的激发和发射波长，显示了优选的峰特性、检测和信噪比。
[0138]
样品收集的响应时间也有变化。发现约0.5s的响应时间足以在峰上产生至少20个数据点，后者为usp的另一个要求。更低的响应时间也可以增加数据点的数量，但是，文件可能大到足以减慢分析。
[0139]
还研究了温度的影响。已经证明，较高的温度导致高rt下较小峰的添加。这些结果表明该方法可以进一步区分颗粒的其他变体。aav6柱证明了优选温度为40℃或更低，例如约15-25℃，且在最高达50℃下具有可接受的性能。
[0140]
实施例11：进样体积、衣壳进样浓度和多次进样精度的线性关系
[0141]
全raav6-gla3和空aav6-030样品用于确定进样体积、衣壳进样浓度和多次进样精度的线性关系。此外，还研究了不同比例制备的不同混合样品的线性关系。
[0142]
分析约1-100μl的进样体积以确定负载线性关系。全raav6-gla3和空aav6-030的样品用于混合和独立地使用。比较了对应于全病毒颗粒和空病毒颗粒的峰的峰面积。尽管具有大量不同的衣壳滴度，但两种样品在最高约10μl的体积下显示出高度线性。在更高的体积下，一部分样品的非结合产生了峰面积的非线性增加。
[0143]
测定了可进样病毒颗粒浓度(例如衣壳)的线性。全rraav6-gla3和空aav6-030两种样品在2x最终制剂缓冲液中稀释，并且每种溶液进样10μl。全raav6-gla3的衣壳滴度为6.11e 12衣壳/ml，空aav6-030的衣壳滴度为3.2e 13衣壳/ml。测定了两种样品在两个峰的面积响应并发现其呈线性。每种样品的主峰导致高线性范围(全raav6-gla3为6.11e 10-9.55e 8衣壳/进样以及空aav6-030为3.2e 11-5e9衣壳/进样)，其中最低点显示》100的样品达到噪声比。因此，检测限(lod)和定量限(loq)可以低得多。这些结果表明该方法非常灵敏，低于此量的衣壳也可以进行主峰分析。
[0144]
空aav衣壳应具有较高的检测uv280/260nm，而全aav应具有较高的检测uv260/280nm(因为衣壳内的dna)。一致地观察到同样的情况表明空aav和全aav的假定峰位置是正确的。
[0145]
通过计算所有峰的总峰面积的相关峰的百分比来获得每种色谱图的空和全百分比的分析。为计算在全raav6-gla3和空aav6-030中空和全衣壳的百分比，使用负载线性(见上文)数据。多个进样体积的数据显示，全raav6-gla3中空和全的百分比分别为8％和92％；同时空aav6-030中空和全aav颗粒的百分比分别为6％和94％，其具有合理的差异(《10％)。这些值可用于通过以不同的比例将其混合并计算这些混合物中空和全的理论百分比，来构建自定义标准曲线。所得色谱图的峰面积可用于构建简化曲线(线性或二次)。反算法可用于获得每种混合物的回收百分比。
[0146]
为了确定样品具有空aav和全aav峰并且峰面积响应是线性的，制备了由全raav6-gla3和空aav6-030的混合物组成的标准曲线，并在图32中示出。从混合物中取10μl进样，获得每个峰的峰面积。相对于空或全进样衣壳量百分比对峰面积进行作图。线性关系用于反算回收百分比，并被证明在
±
20％以内。该实验还表明，含有两种aav峰的样品混合物的范围和回收是高度线性的(r2》0.99)。为了进一步改进曲线拟合，使用软件来拟合线性或二次曲线。结果发现，二次曲线也可以是具有较低的残余标准偏差的良好拟合。然而，线性和二次曲线拟合都可以使用。
[0147]
表5.用于标准曲线的两种样品混合物的设计和所得峰面积以及基于线性曲线的回收％
[0148][0149]
已经证明，在两种流动相的约8.8-9.2的ph范围内，峰分离仍然存在高分辨率。然而，在ph 9.2下观察到一些峰拖尾，并且在极端ph条件下具有峰rt移动(图33)。
[0150]
除了ph，还分析了柱温的影响。柱隔室温度在约15至50℃之间变化，并且分析空aav和全aav的峰分离。在较低温度下，峰分离不受影响(具有一些拖尾)，而在》30℃时，色谱图中会出现额外的峰，如图34所示。
[0151]
通过将样品加热到不同的温度，研究了样品温度对色谱图的影响。在较高的温度下(例如，约90℃)，样品降解并且在梯度洗脱期间没有显示任何峰(数据未显示)。因此，该方法可用于分析样品的稳定性。
[0152]
实施例12：与auc和cryotem相比，通过hplc量化的空颗粒和全颗粒％的比较
[0153]
使用实施例10中描述的hplc方法分析了总共10个样品(包括全raav6-gla3、全raav6-384、全raav6-gla4(携带gla转基因的重组aav6)和空aav6-030)，并计算空衣壳和全衣壳的百分比。其中五个样品进行cryotem分析，并且获得了全衣壳和空衣壳的百分比。
[0154]
hplc方法与cryotem方法之间的比较分析证明了强相关性，如表6和表7所示。在表中，raav6-378具有含有针对左zfn转基因的表达盒的基因组；raav6-447具有含有针对f8(因子viii)转基因的表达盒的基因组；raav6-000490和18-raav6-550各自具有含有针对cd19转基因的表达盒的基因组，但分别在sf9和hek293细胞中产生。
[0155]
这些方法之间的相关性还如图43(空衣壳％)和图44(全衣壳％)所示。在95％的覆盖率下，hplc与tem相关性的皮尔逊相关系数(r)为0.999。这些结果表明本文所述的hplc方法相较于样品内空衣壳和全衣壳定量的tem方法是准确的。
[0156]
表6.利用hplc和tem的空衣壳％比较
[0157][0158]
表7.hplc和tem的全衣壳％比较
[0159][0160][0161]
注意：nd-未测定
[0162]
根据优选实施方案，可以使用以下参数：管线a(缓冲液a)约20mm双三丙烷(btp)ph 9.0；管线b(缓冲液b)约20mm双三丙烷(btp)，1m盐(tmac)ph 9.0；管线c-lc-ms(或同等)级水；管线d异丙醇；在lc-ms(或同等)级水中密封清洗(sw)约10％ipa；针洗(nw)约50％甲醇；uv检测设置
–
260
±
20nm，280
±
20nm；荧光检测设置
–
激发/发射＝280nm/348nm；样品进样量约10μl；多取样器参数:针洗-标准；吸入速度约100μl/分钟；喷射速度约400μl/分钟；等待时间约在吸入后1.2s；样品冲洗系数-5；柱温约20℃；dad设置：信号a-260
±
20nm，参考400
±
100nm，响应时间》0.25s；信号b-280
±
20nm，参考400
±
100nm，响应时间》0.25s；狭缝约4nm；fld设置：激发-280nm，发射-348nm，响应时间约0.25s。
[0163]
根据某些实施方案，可以使用表8中示出的流动相梯度程序。
[0164]
表8.梯度程序(1m tmac作为缓冲液b)
[0165][0166]
实施例13：等度保持hplc方法在空颗粒和全颗粒分离和定量中的广泛应用
[0167]
使用实施例10中描述的hplc方法分析包括aav1、aav2、aav3、aav8和aav9的另外5种不同aav血清型的病毒制剂，并计算空衣壳和全衣壳的百分比。对于每种血清型，运行不同的样品以评估空aav衣壳和全aav衣壳的色谱峰分离和峰定位。此外，对于每种血清型，该方法就用于高效结合的1m tmac的浓度、等度保持和等度保持每一侧的两种线性梯度进行修改。
[0168]
对于aav1血清型，样品包括aav1空批次和从virovek购买的aav1 cmv-gfp；以及由sgmo vector core使用hek293细胞中的三转染过程制造并通过cscl密度梯度法纯化的批次17-aav-321和17-aav-037。对于三转染方法，通过sangamo的载体核心组使用平台法产生raav。简而言之，将hek293细胞铺在十层cellstack舱室中(corning，acton，ma)，并生长三天至80％的密度。三种质粒：含有rep和cap基因的aav辅助质粒，含有腺病毒辅助基因的腺病毒辅助质粒和含有两侧为aav2倒置末端重复的待包装序列的转基因质粒，使用磷酸钙转染到细胞中(xiao等人1998)。三天后收获细胞。通过三轮冷冻/解冻裂解细胞，并通过离心除去细胞碎片。使用聚乙二醇沉淀raav。重悬后，通过在氯化铯(cscl)梯度上超速离心过夜纯化病毒。病毒通过透析配制然后过滤灭菌。分离sangamo样品以主要地分离经纯化的全aav1颗粒。数据表明，20％的等度保持导致全病毒颗粒和空病毒峰的基线分离，如图39所示。初始梯度为0％，其线性地增加至约8％，随后逐渐增加至约20％，等度保持在此显示了空aav颗粒的分离。增加至约30％的进一步梯度导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用进一步的梯度增加至约95％以清洁柱。数据显示，空aav1中的空和全百分比分别为85.2％和9.3％；aav1 cmv-gfp中的空和全百分比分别为13.8％和84.1％；17-aav-321中的空和全百分比分别为20.6％和79.4％；以及19-aav-037中的空和全百分比分别为6.4％和90.0％。
[0169]
对于aav2血清型，样品包括从virovek购买的aav2空批次；以及由sgmo vector core使用hek293细胞中的三转染过程制造并通过cscl密度梯度法纯化的批次17-aav-077和17-aav-155。分离sangamo样品以主要地富集全aav2颗粒。数据表明，12％的等度保持导致全病毒颗粒和空病毒峰的基线分离，如图40所示。初始梯度为0％，其线性地增加至约8％，随后逐渐增加至约12％，等度保持在此显示了空aav颗粒的分离。增加至约30％的进一步梯度导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用进一步的梯度增加至约100％以清洁柱。数据显示，aav2空中的空和全百分比分别为72.3％和21.4％；17-aav-077中的空和全百分比分别为5.9％和79.6％；17-aav-155中的空和全百分比分别为78.5％和
8.9％。
[0170]
对于aav3血清型，样品包括aav3空批次和从virovek购买的aav3 cmv-gfp；以及由sgmo vector core使用hek293细胞中的三转染过程制造并通过cscl密度梯度法纯化的批次17-aav-124和17-aav-324批次。分离sangamo样品以主要地分离经纯化的全aav3颗粒。数据表明，15％的等度保持导致全病毒颗粒和空病毒峰的基线分离，如图41所示。初始梯度为0％，其线性地增加至约8％，随后逐渐增加至约15％，等度保持在此显示了空aav颗粒的分离。增加至约30％的进一步梯度导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用进一步的梯度增加至约100％以清洁柱。数据显示，aav3空中的空和全百分比分别为74.1％和17.9％；aav3 cmv-gfp中的空和全百分比分别为55.2％和41.5％；17-aav-124中的空和全百分比分别为55.4％和44.6％；17-aav-324中的空和全百分比分别为72.9％和27.2％。
[0171]
对于aav8血清型，样品包括aav8空批次(17-aav-082)以及和由sgmo vector core使用hek293细胞中的三转染过程制造并通过cscl密度梯度法纯化的批次18-aav-070、17-aav-339、17-aav-340和17-aav-341。分离aav8空批次以富集空aav8颗粒，同时分离所有其他批次以分离经纯化的全aav8颗粒。还测试了aav8 rsm(主要由全aav8衣壳组成)，其购自atcc，由位于南特(法国)的atlantic gene therapies-umr 1089和巴塞罗那自治大学(西班牙)的动物生物技术和基因治疗中心(cbateg)制造。数据表明，14％的等度保持导致全病毒颗粒和空病毒峰的基线分离，如图42a和42b所示。初始梯度为0％，其线性地增加至约8％，随后逐渐增加至约14％，等度保持在此显示了空aav颗粒的分离。增加至约30％的进一步梯度导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用进一步的梯度增加至约95％以清洁柱。数据显示，aav8空中的空和全百分比分别为76.6％和22.2％；aav8批次18-070中的空和全百分比分别为15.2％和81.5％；aav8批次17-339中的空和全百分比分别为1.8％和95.5％；aav8批次17-340中的空和全百分比分别为28％和70.4％；aav8批次17-341中的空和全百分比分别为4.3％和93.3％；aav8 rsm中的空和全百分比分别为0％(未检测到)和100％。aav8 rsm的低浓度可能导致空峰低于可检测极限。
[0172]
对于aav9血清型，样品包括aav9批次070和076，其在sf9细胞工艺中使用基于杆状病毒的感染制造并通过亲和层析纯化；以及批次24，其由sgmo vector core使用hek293细胞中的三转染过程制造并通过cscl密度梯度法纯化。分离这些批次以主要地分离经纯化的全aav9颗粒。数据表明对于aav9血清型，5％的等度保持导致全病毒颗粒和空病毒峰的基线分离，如图43所示。初始梯度为0％，其线性地增加至约3％，随后逐渐增加至约5％，等度保持在此显示了空aav颗粒的分离。增加至约40％的进一步梯度导致对应于全病毒颗粒的峰的洗脱。在该方法期间，使用进一步的梯度增加至约100％以清洁柱。数据显示，pd批次076中的空和全百分比分别为53.6％和43.3％；pd70批次19-bav-484pd中的空和全百分比分别为5.8％和87.8％；pd76批次20-bav-027pd中的空和全百分比分别为54.2％和41.1％；run24批次19-bav-470中的空和全百分比分别为2.7％和97.3％。
[0173]
表9.不同aav血清型的hplc方法参数
[0174][0175]
缓冲液a：20mm btp，ph 9.0；
[0176]
缓冲液b：20mm btp，1m tmac，ph 9.0。