使用序列相似肽进行反向选择分选的制作方法

技术特征：
1.一种选择细胞或病毒的方法，所述细胞或病毒在其表面表达与目的蛋白抗原(pai)特异性和/或选择性结合的抗原结合蛋白，所述方法包括以下步骤：(i)提出细胞群或病毒群；(ii)使步骤(i)的细胞群或病毒群与包含pai和可检测标记a的第一抗原复合体(第1ac)或包含可检测标记a的pai接触；(iii)使步骤(i)的细胞群或病毒群与包含相似蛋白抗原(spa)的至少第二抗原复合体(第2ac)接触，其中spa的氨基酸序列与pai的氨基酸序列至少有1个氨基酸不同，其中第2ac包含可检测标记b；或与spa和可检测标记b接触；以及(iv)选择至少一种与第一ac特异性和/或选择性结合的细胞或病毒，其中，可检测标记a和可检测标记b彼此系可检测地不同。2.根据权利要求1所述的方法，其中选定的(i)细胞为免疫细胞，优选为t细胞，优选为cd4或cd8 t细胞；或b细胞；或表达异源抗原结合蛋白的哺乳动物或酵母细胞；或(ii)选定的病毒为噬菌体。3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白选自包含t细胞受体(tcr)或其抗原结合片段、b细胞受体(bcr)或其抗原结合片段以及嵌合抗原受体(car)或其抗原结合片段的组。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中(a)细胞群包括：(i)免疫细胞，优选为肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞受体文库、健康受试者的外周血、患病受试者的外周血或其免疫细胞富集级分；或(ii)真核细胞，优选为表达异源抗原结合蛋白文库的哺乳动物细胞或酵母细胞；或(b)病毒群包含表达异源抗原结合蛋白文库的病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫细胞富集级分富含干细胞、t细胞，优选为cd8 t细胞或cd4 t细胞、b细胞、浆细胞。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中，目的蛋白抗原(pai)为肿瘤相关抗原(taa)、病毒蛋白或细菌蛋白。7.根据权利要求4至6所述的方法，其中，患病受试者患有选自由免疫疾病、肿瘤性疾病、病毒引起的疾病或细菌引起的疾病组成组的疾病。8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，其中，透过可检测标记一个或多个免疫细胞特异性表面标志物来选择免疫细胞富集级分。9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其包含在生长因子和/或分化因子存在的情况下孵育细胞群的进一步步骤，优选为从细胞因子组成的组中选择。10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中，所述ac为抗原提呈细胞，或包含颗粒、pai和可检测标记a或spa和可检测标记b的复合体。11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其包括一个或多个以下进一步的步骤(a)使步骤(i)的细胞群与包含pai和可检测标记c的第三抗原复合体(第3ac)接触，所述可检测标记c系可检测地不同于与细胞群接触的其他ac的一个或多个或所有其他可检测标记，优选为可检测地不同于至少可检测标记a，优选为可检测地不同于至少可检测标记a
和可检测标记d(如果存在可检测标记d)；和/或(b)使步骤(i)的细胞群与包含pai和可检测标记d的第四抗原复合体(第4ac)接触，所述可检测标记d系可检测地不同于与细胞群接触的其他ac的一个或多个或所有其他可检测标记，优选为可检测地不同于至少可检测标记a，优选为可检测地不同于至少可检测标记a和可检测标记c；和/或(c)使步骤(i)的细胞群与包含spa和可检测标记e的第五抗原复合体(第5ac)接触，所述可检测标记e系可检测地不同于与细胞群接触的其他ac的一个或多个或所有其他可检测标记，优选为可检测地不同于至少可检测标记b，优选为可检测地不同于至少可检测标记b和可检测标记f(如果存在可检测标记f)；和/或(d)使步骤(i)的细胞群与包含spa和可检测标记f的第六抗原复合体(第6ac)接触，所述可检测标记f系可检测地不同于与细胞群接触的其他ac的一个或多个或所有其他可检测标记，优选为可检测地不同于至少可检测标记b，优选为可检测地不同于至少可检测标记b和可检测标记e；和/或(e)使步骤(i)的细胞群与一种或多种另外抗原复合体(ac)接触，其中每个ac均包含spa，该spa之至少一个氨基酸序列与第2ac的spa氨基酸序列不同，并且其中每个另外ac包含一个或更多标记，其中，一个或更多标记与第2ac的一个或更多标记相同或可检测地不同。12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中(i)第1ac包含至少一种另外的可检测标记，第2ac包含至少一种另外的可检测标记，两者相同或不同；和/或(ii)所述一个或更多另外ac包含至少一个另外的可检测标记；其中选择所述至少一个另外的标记，以便可区分第1ac和第2ac以及一个或多个另外ac。13.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中，可检测标记独立选自萤光标记，优选为选自由黄嘌呤类、吖啶类、恶嗪类、菁类、苯乙烯基染料、香豆素类、卟啉类、金属-配体络合物类、萤光蛋白质类、纳米晶体、苝类和酞菁类组成的组。14.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中第1ac为mhc-i或mhc-ii与pai的复合体，其中pai为靶肽(tp)，优选为肿瘤特异性靶肽和/或第2ac为mhc-i或mhc-ii与spa的复合体，其中spa为靶相似肽(tsp)，其中tsp与tp的氨基酸序列至少有1个氨基酸不同。15.根据权利要求14所述的方法，其中透过以下一项或多项标准选择所述至少一个tsp的氨基酸序列：(a)tsp提呈于健康组织；(b)衍生自hla类型来源；和(c)与各自hla结合。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，tsp的氨基酸序列长度为8至16个氨基酸，其中：(1)tsp的氨基酸序列的下列位置與tp的氨基酸序列不同x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x8(i)位置x1、x2和x3，其中位置x4至x8與tp相同或相似；(ii)位置x4、x5和x6，其中位置x1至x3以及位置x7和x9與tp相同或相似；或
(iii)位置x7和x8，其中位置x1至x6與tp相同或相似；或如果tp的長度為8個氨基酸；或(2)tsp的氨基酸序列的下列位置與tp的氨基酸序列不同x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x9(i)位置x1、x2和x3，其中位置x4至x9與tp相同或相似；(ii)位置x4、x5和x6，其中位置x1至x3以及位置x7至x9與tp相同或相似；或(iii)位置x4、x5、x6和x7，並且其中位置x1至x3以及位置x8至x9與tp相同或相似；或(iv)位置x7、x8和x9，其中位置x1至x6與tp相同或相似；或如果tp的長度為8-9個氨基酸；或(3)tsp的氨基酸序列的下列位置与tp的氨基酸序列不同x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10
(i)位置x1、x2和x3，其中位置x4至x
10
与tp相同或相似；(ii)位置x4、x5、x6和x7，其中位置x1至x3以及位置x8至x
10
与tp相同或相似；或(iii)位置x4、x5和x6，其中位置x1至x3以及位置x7至x
10
与tp相同或相似；或(iv)位置x8、x9和x
10
，其中位置x1至x7与tp相同或相似；或如果tp的长度为8-10个氨基酸；或(4)tsp的氨基酸序列的下列位置与tp的氨基酸序列不同x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11
(i)位置x1、x2和x3，其中位置x4至x
11
与tp相同或相似；(ii)位置x4、x5、x6和x7，其中位置x1至x3以及位置x8至x
11
与tp相同或相似；或(iii)位置x4、x5和x6，其中位置x1至x3以及位置x7至x
11
与tp相同或相似；或(iv)位置x8、x9、x
10
和x
11
，其中位置x1至x7与tp相同或相似；或(v)位置x9、x
10
和x
11
，其中位置x1至x8与tp相同或相似；如果tp的长度为8-11个氨基酸；或(5)tsp的氨基酸序列的下列位置与tp的氨基酸序列不同x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12
(i)位置x1、x2和x3，其中位置x4至x
12
与tp相同或相似；(ii)位置x4、x5、x6和x7，其中位置x1至x3以及位置x8至x
12
与tp相同或相似；或(iii)位置x4、x5和x6，其中位置x1至x3以及位置x7至x
12
与tp相同或相似；或(iv)位置x8、x9、x
10
、x
11
和x
12
，其中位置x1至x7与tp相同或相似；或(v)位置x9、x
10
、x
11
和x
12
，其中位置x1至x8与tp相同或相似；如果tp的长度为8-12个氨基酸。17.根据权利要求16所述的方法，其中，tsp的氨基酸序列长度与tp不同。18.根据权利要求1至17任一项所述的方法，其中，spa或tsp的氨基酸序列与pai或tp具有小于95％的氨基酸同一性、小于90％的氨基酸同一性或小于85％的氨基酸同一性。19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中，使步骤(i)的细胞群与各包含不同相似蛋白抗原(spa)的不多于10个抗原复合体(ac)接触，使用不多于9个不同spa、不多于8个不同spa、不多于7个不同spa、不多于6个不同spa、不多于5个不同spa、不多于4个不同spa、不多于3个不同spa、不多于2个不同spa或不多于1个spa。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述spa为tsp。21.根据权利要求20所述的方法，其中，不同tsp的数量系介于1-10个、介于2-8个、介于3-5个或介于1-3个，优选为使用3个tsp。22.根据权利要求1至21任一项所述的方法，其中，权利要求1的步骤(ii)和(iii)和/或权利要求10的步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)以任何顺序或组合连续或同时进行。23.根据权利要求1至22任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括：a)正向选择(选择)结合于第1ac、第1和第3ac或第1、第3和第4ac的细胞；和/或b)负向选择(排除)结合于第2ac、第2和第5ac或第2、第5和第6ac的细胞。24.根据权利要求1至22任一项所述的方法，其中所述标记透过流式细胞术分析检测，优选为macs分析、facs分析或制备型分选分析。25.根据权利要求1至24任一项所述的方法，其中，步骤i)细胞群中所含的细胞为t细胞和/或b细胞且经表型分析。26.根据权利要求25所述的方法，其中，t细胞的表型分析包括确定一个或多个t细胞标志物。27.根据权利要求1至25任一项所述的方法，其中，b细胞的表型分析包括确定一个或多个b细胞标志物。28.根据权利要求1至27任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：使步骤(i)的细胞群与包含无关蛋白抗原(ipa)的无关抗原复合体(iac)接触，其中当ipa的氨基酸序列与pai的氨基酸序列比对时，ipa的氨基酸序列的两个或两个以下氨基酸位置与pai相同，其中iac包含可检测地不同于可检测标记a的可检测标记g。29.根据权利要求28所述的方法，其中透过以下一项或多项标准选择至少一个ipa的氨基酸序列：(a)ipa提呈于健康组织；(b)衍生自hla类型来源；(c)与各自hla结合。30.根据权利要求28至29所述的方法，其中，ipa或ipa中所含的至少一种蛋白质或肽的氨基酸序列与pai具有小于30％的氨基酸同一性、小于20％的氨基酸同一性或小于10％的氨基酸同一性。31.根据权利要求28至30所述的方法，其中，所述iac为mhc-i或mhc-ii与无关肽(ip)的复合体，其中当与tp的氨基酸序列比对时，ip的氨基酸序列的一个氨基酸位置或无氨基酸位置与tp相同。32.一种确定编码抗原结合蛋白或其抗原结合部分的核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：(i)分离来自根据权利要求1至26选定细胞的编码抗原结合蛋白或其抗原结合部分的核酸；和(ii)确定核酸的序列。33.一种产生表达编码抗原结合蛋白或其抗原结合部分的核酸的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供来自本发明第一方面的方法中选定细胞的编码抗原结合蛋白或其抗原结合部
分的核酸序列；(ii)任选地在表达控制元素控制下产生包含步骤(i)中所提供核酸序列的核酸载体；和(iii)将步骤(ii)的核酸载体引入宿主细胞。34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，抗原结合蛋白为tcr或其片段、bcr或其片段或抗体或其片段。35.根据权利要求34所述的方法，其中，tcr、bcr或抗体的氨基酸序列包含六个cdr序列。36.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括以下步骤：(i)提出受试者的细胞群；(ii)使步骤(i)的细胞群与包含pai和可检测标记a的第一抗原复合体(第1ac)或包含可检测标记a的pai接触；(iii)使步骤(i)的细胞群与包含spa的至少第二抗原复合体(第2ac)接触，其中spa的氨基酸序列与pai的氨基酸序列至少有1个氨基酸不同，其中第2ac包含可检测标记b；或与spa和可检测标记b接触；以及(iv)选择至少一种与第一ac特异性结合的细胞，其中，可检测标记a和可检测标记b彼此系可检测地不同(v)透过培养增加至少一个所选细胞数目；和(vi)将培养的细胞重新引入受试者体内。37.根据权利要求36所述的方法，其中，有需要的受试者患有选自由免疫疾病或肿瘤性疾病、病毒引起的疾病或细菌引起的疾病组成组的疾病，或处于患上所述疾病的风险。38.一种在其表面表达与目的蛋白抗原(pai)特异性和/或选择性结合的抗原结合蛋白的选定免疫细胞在治疗免疫疾病或肿瘤性疾病、病毒引起的疾病或细菌引起的疾病中的用途，其包括以下步骤：(i)提出包含免疫细胞的细胞群；(ii)使步骤(i)的细胞群与包含pai和可检测标记a的第一抗原复合体(第1ac)或包含可检测标记a的pai接触；(iii)使步骤(i)的细胞群与包含spa的至少第二抗原复合体(第2ac)接触，其中spa的氨基酸序列与pai的氨基酸序列至少有1个氨基酸不同，其中第2ac包含可检测标记b；或与spa和可检测标记b接触；以及(iv)选择至少一种与第一ac特异性结合的细胞，其中，可检测标记a和可检测标记b彼此系可检测地不同；肿瘤性疾病优选为癌症。39.一种选择免疫细胞的方法，所述免疫细胞在其表面表达与目的蛋白抗原(pai)特异性结合的抗原结合蛋白，所述方法包括以下步骤：(i)提出包含免疫细胞的细胞群；(ii)使步骤(i)的细胞群与包含pai和可检测标记a的第一抗原复合体(第1ac)或包含可检测标记a的pai接触；(iii)使步骤(i)的细胞群与包含无关蛋白抗原(ipa)的至少第二抗原复合体(第2ac)接触，其中当ipa的氨基酸序列与pai的氨基酸序列比对时，ipa的氨基酸序列的两个或两个
以下氨基酸位置与pai相同，其中iac包含可检测标记g；或与ipa和可检测标记g接触；以及(iv)选择至少一种与第一ac特异性结合的细胞，其中，可检测标记a和可检测标记g彼此系可检测地不同。

技术总结
本发明涉及一种选择细胞或病毒的方法，所述细胞或病毒在其表面表达与目的蛋白抗原(PAI)特异性结合的抗原结合蛋白，同时应用使用相似蛋白抗原(SPA)的反向选择。此外，本发明提出了一种确定编码抗原结合蛋白或其抗原结合部分的核酸之序列的方法，以及一种产生表达编码抗原结合蛋白或其抗原结合部分的核酸之细胞的方法。本发明还涉及一种用选定细胞群治疗受试者的方法。疗受试者的方法。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：伊玛提克斯美国公司
技术研发日：2020.06.04
技术公布日：2022/4/8