酰基化间苯三酚衍生物在抗菌药物制备中的应用

1.本发明涉及间苯三酚衍生物的抗菌活性，属于杀菌剂领域。


背景技术：

2.藤黄科(guttiferae)金丝桃属(hypericum)植物在民间有2400余年的用药历史，主要有清热解毒、散瘀止痛、祛风湿等功效。其含有的萘骈二蒽酮类、黄酮类和间苯三酚类等成分表现出一定的抗菌、抗氧化、抗疟、抗炎和抗癌等活性，从而引起研究者的广泛关注。如针对其中间苯三酚类成分的分离以及以间苯三酚为合成起点的多环多异戊烯基间苯三酚、多环多异戊烯基酰基化间苯三酚、甲基间苯三酚等衍生物的合成等等，活性评价发现这些衍生物对隐球菌、白色念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、红色毛藓菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、铜绿假单胞菌等等均具有显著的抗菌活性，但相较于其多样化的衍生物而言，间苯三酚本身未能体现出抗菌效力，本研究依据现有间苯三酚衍生物抗菌活性的研究基础和其优异的抗氧化活性，以间苯三酚为合成起点，期望充分利用其来源广泛，成本低廉的优势，保留其抗氧化活性，提升抗菌活性，充分发挥其潜在的利用价值。
3.食品在加工和保藏过程中，易受温度、湿度、光照和微生物等多种因素影响，尤其是谷物、果蔬、奶制品、肉制品等极易受周围环境中的真菌、细菌的侵染而腐败变质，严重危害人类健康。就谷物和果蔬而言，侵染的病原微生物主要为采后致腐真菌。表1所示为常见水果采后致腐真菌侵染的宿主及病害类型。据统计，在发达国家每年约有10％～20％的新鲜果蔬由于采后致腐真菌导致腐烂，发展中国家的比例则更高，达到40％～50％。在我国，易腐烂特色水果总产量达1.16亿吨，采后损失25％～30％，约700亿元。受病原微生物侵染后腐烂的谷物和果蔬，感官品质变差、营养价值下降。另外，即使是肉眼看起来未被侵染的部分，也有可能渗入一些真菌毒素，误食后可能严重危害人类健康。
4.而在肉制品、乳制品等食品加工行业，蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌o157:h7、肠炎沙门氏菌等给人类饮食安全构成了严重威胁，其产生的毒素会引起食物中毒，严重危害人类健康。据估计，蜡样芽胞杆菌可导致乳制品工业高达30％的严重经济损失；而沙门菌则是全球主要的食源性病原体之一,2015年,沙门菌被世界卫生组织(world health organization,who)确定为引起重大疾病和死亡的食源性病原体。据估计,每年沙门氏菌感染导致全世界28亿例腹泻,中国每年有987万例由沙门氏菌引起的胃肠炎。因此，针对食品行业中广泛存在的真菌和细菌侵染，开发有效的杀菌剂，不仅有助于人体健康，也能够有效减少经济损失和资源浪费。
5.表1水果采后主要病害、致腐真菌、症状及易感染的水果类型
6.[0007][0008]
病原微生物的侵染不仅影响人类健康，严重阻碍食品行业的发展，也对农业健康发展和粮食安全问题构成严重威胁，因植物病害每年造成的粮食损失已超过产量的11％。比如我国稻田受到水稻纹枯病的影响，每年造成600万吨谷物的损失，受小麦赤霉病的影响，每年造成10％～30％的减产。植物病害的发生、病原菌抗性的发展严重威胁环境安全和人类健康。因此研究与开发能有效控制植物病原菌的高效、低毒、低残留的新型农药，已成为目前农药创制的首要目标之一。
[0009]
水果采后致腐真菌、食源性细菌、植物病原真菌、农业细菌等多种病原微生物对食品和农作物的严重侵染给食品业和农业发展造成了严重的经济损失，更是严重危害了人类健康。本研究合成了一系列酰基化间苯三酚衍生物，评价其对水果采后致腐真菌：灰葡萄孢、扩展青霉accc30898、匍枝根霉cicc 40327、核果褐腐病菌accc 36263、黄曲霉accc32601；食源性致病细菌:蜡样芽胞杆菌bncc 103930、单核增生李斯特菌atcc 19115、沙门氏菌atcc 14028、大肠杆菌o157:h7 atcc 35150；植物病原菌：立枯丝核菌、核盘菌、禾谷镰刀菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉、水稻白叶枯accc 11602、柑橘溃疡病菌等多种病原微生物的抑菌活性。该类化合物合成简单，抗菌活性较无水间苯三酚显著增强，具有广谱抗菌活性，将在果品防腐、农用杀菌等方面具有潜在的应用价值。


技术实现要素：

[0010]
本发明的目的在于提供一种酰基化间苯三酚衍生物及该类衍生物在防治水果采后致腐真菌、食源性致病细菌和多种农作物病原菌中的用途。
[0011]
所述间苯三酚衍生物1-20，结构如下所示：
[0012][0013]
本技术提供上述20种酰基间苯三酚衍生物的抗菌活性。
[0014]
本技术所述抗菌活性的菌种包含水果致腐真菌：灰葡萄孢、扩展青霉 accc30898、匍枝根霉cicc 40327、核果褐腐病菌accc 36263、黄曲霉 accc32601；食源性致病细菌:蜡样芽胞杆菌bncc 103930、单核增生李斯特菌 atcc 19115、沙门氏菌atcc 14028、大肠杆菌o157:h7 atcc 35150；植物病原菌：立枯丝核菌、核盘菌、禾谷镰刀菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉、水稻白叶枯细菌accc 11602、柑橘溃疡病菌。
具体实施方式
[0015]
为了更好的理解本发明的实质，通过以下具体实施方式进一步说明，但本发明不限于这些实施例。
[0016]
实施例1：间苯三酚衍生物的制备
[0017]
化合物1-20(参照文献european journal of medicinal chemistry 155(2018) 255e262；j antibiot(tokyo)2019,72(5),253-259；j.nat.prod.2016,79,2195-2201) 合成，经物理性质和核磁质谱鉴定和文献报道的一致，确定了权利要求所列举的间苯三酚衍生物1-20。所有化合物经多次硅胶柱层析等常规方法分离获得纯品，用于进一步活性测试。
[0018]
实施例2：间苯三酚衍生物对水果采后致腐真菌的室内抑菌活性测定
[0019]
本实验中所用的植物病原真菌为实验室4℃保存的菌种，采用菌丝生长速率法，实验室所有植物病原真菌所用培养基均为马铃薯琼脂葡萄糖培养基(简称 pda)。pda培养基
配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水 1000ml。
[0020]
pda培养基配制方法：将马铃薯洗净去皮，称200g切成小块，加水煮烂(煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤于烧杯中加蒸馏水至1000 ml，根据实验需要加15-20g琼脂，加入20g葡萄糖，搅拌使其充分溶解后，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。
[0021]
实验方法
[0022]
1)菌丝生长速率法。
[0023]
1、先将植物病原菌在pda平板上25℃培养3～6天活化。
[0024]
2、将pda培养基加热溶化，冷却至45-50℃，分别加入不同浓度杀菌组合物制成带药平板。
[0025]
3、以无菌操作手续，用打孔器在培养3～6天的各菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径5mm)，再用接菌针挑至含药平板中央，然后将培养皿倒置于培养箱(25℃)中培养。
[0026]
4、待空白对照组长满后观察测定菌丝的生长情况，并采用十字交叉法测得直径并处理数据，计算菌丝生长抑制率(percentages of growth inhibition,pgi)。
[0027]
5、菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/(对照菌丝直径-菌饼直径)
×
100
[0028]
6、每个处理重复3次。
[0029]
表2间苯三酚衍生物对水果采后致腐真菌抑菌活性
[0030][0031]
表3间苯三酚衍生物对水果采后致腐真菌的ec
50
(μg/ml).
[0032][0033]
由表2和表3可知，间苯三酚衍生物抗菌活性显著提升，化合物1-6和化合物19对黄曲霉、扩展青霉、灰葡萄孢、核果褐腐病菌和匍枝根霉具有显著的抑菌活性，100μg/ml下对
扩展青霉抑制率均为100％，化合物19对灰葡萄孢菌和核果褐腐病菌的ec
50
分别为0.39、1.75μg/ml。
[0034]
实施例3：间苯三酚衍生物对植物病原真菌的室内抑菌活性测定
[0035]
表4间苯三酚衍生物对植物病原真菌的室内抑菌活性
[0036][0037]
由表4生测结果可知，本发明涉及的间苯三酚衍生物对5种植物病原真菌均具有良好的抑菌活性，当酰基侧链烷烃含支链时抗菌活性显著下降，为直链烷烃或环烷烃时抗菌活性显著。
[0038]
实施例3：间苯三酚衍生物对农业细菌的室内抑菌活性测定
[0039]
采用微量肉汤稀释法：将农业细菌接种于20ml nb培养基中，然后置于 37℃的恒温摇床中孵育12h，转速为150rpm。取适量菌体培养液用酶标仪测定在600nm下的吸光度，以不加细菌的培养液作为空白对照，根据od
600 0.1相当于浓度为1
×
108cfu/ml，用nb培养基将细菌悬浮液稀释成浓度1
×
10
6 cfu/ml的菌液后，备用。
[0040]
用排枪吸取50μl稀释好的细菌菌液置于96孔板中，然后依次加入50μl 的化合物溶液，空白对照为加入同等体积的pbs溶液，阳性对照为叶枯唑，每个浓度设置3个重复。将样品置于37℃的恒温培养箱中孵育24h后，测定其在 600nm处的od值，计算出抑制率。测定间苯三酚衍生物对2种植物病原细菌的抑制效果，结果见表5。
[0041]
表5间苯三酚衍生物对农业细菌的室内抑菌活性
[0042][0043]
表6间苯三酚衍生物对农业细菌的mic
90
(μg/ml)
[0044]
[0045][0046]
由表5和表6生测结果可知，本发明涉及的大部分间苯三酚衍生物对水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌的抑菌活性较强，化合物1对水稻白叶枯病菌的mic
90
值可达6.25μg/ml，对柑橘溃疡病菌的mic
90
值可达12.50μg/ml。
[0047]
实施例4：间苯三酚衍生物对食源性致病细菌的室内抑菌活性测定
[0048]
采用微量肉汤稀释法：将食源性细菌接种于20ml lb培养基中，然后置于 37℃的恒温摇床中孵育18-24h，转速为150rpm。取适量菌体培养液用酶标仪测定在600nm下的吸光度，以不加细菌的培养液作为空白对照，根据od
600 0.1 相当于浓度为1
×
108cfu/ml，用lb培养基将细菌悬浮液稀释成浓度1
×
10
6 cfu/ml的菌液后，备用。
[0049]
用排枪吸取50μl稀释好的细菌菌液置于96孔板中，然后依次加入50μl 的化合物溶液，空白对照为加入同等体积的pbs溶液，每个浓度设置3个重复。将样品置于37℃的恒温培养箱中孵育18-24h后，测定其在600nm处的od 值，计算出抑制率。测定间苯三酚衍生物对4种食源性细菌的抑制效果，结果见表7和表8。
[0050]
表7间苯三酚衍生物对食源性细菌的抑菌活性
[0051]
[0052][0053]
表8间苯三酚衍生物对食源性细菌的mic
90
和ec
50
(μg/ml)
[0054]
[0055][0056]
由表7和表8生测结果可知，化合物1-6对单核增生李斯特菌atcc 19115 和大肠杆菌o157:h7 atcc 35150具有显著的抗菌活性，ec
50
分别可达1.26和 1.07μg/ml。
[0057]
综上所述，本发明所述的酰基间苯三酚衍生物对多种严重危害果品质量的水果采后致腐真菌、农业植物病原真菌、农业细菌和食源性致病细菌具有良好的抗菌活性，具有广谱的抗菌效力，可进一步作为杀菌先导化合物来开发。