琴叶榕提取物在制备预防或治疗炎症性肠病的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及中药技术领域，具体涉及琴叶榕提取物在制备预防或治疗炎症性肠病或其相关的继发性肝损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.炎症性肠病(ibd)，包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，是发达国家最易患结直肠癌(crc)的危险因素。目前，美国ibd患者人数超过200万，预计到2030年将接近400万。流行病学调查数据显示，欧洲的患病率为505/100000，加拿大为248/100000，美国为21.4/100000。近年来亚洲国家ibd的发病率也呈急剧上升趋势，女性发病率高于男性，并向青少年转移，这主要是由于生活环境和生活方式的巨大变化，与遗传因素相互作用。
3.uc是一种慢性炎症性肠病，其特征为血性腹泻、腹部痉挛，常因炎症细胞浸润而不断复发。临床和实验证据表明，长期炎症浸润会破坏肠粘膜屏障而无法恢复。由于反复发作和难以治愈，uc成为临床的一大难题。目前，临床治疗主要包括柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、抗体、janus激酶阻滞剂、干细胞治疗等。这些治疗方法主要是缓解疾病症状，但不能完全治愈uc，因此疗效并不理想。当治疗终止时，患者很容易复发，此外，长期服用这些药物会导致一系列副作用。因此，迫切需要开发一种更安全有效的uc治疗药物。
4.uc的病因尚不清楚，主要涉及生活和社会环境、生活方式和遗传等多方面因素。氧化应激在uc的发病过程中起着关键作用，在此过程中，过度氧化会破坏肠道的紧密连接，促进炎症因子渗透，从而损伤肠粘膜并加重炎症反应。此外，uc患者通常伴有一种或多种肠外症状(eim)，导致多器官损伤，如肝损伤。在uc发展过程中，肠粘膜屏障功能受损，肠通透性增加。肠道菌群的过度生长及其代谢产物如脂多糖(lps)、毒素和活性氧(ros)将通过门静脉系统进入肝脏，从而激活肝脏中的非特异性免疫系统或促炎信号，产生大量炎性细胞因子和趋化因子，加重炎症反应，从而导致肝损伤或肝炎的发生。因此，通过抑制uc和加强肠道屏障功能来治疗肝损伤或肝炎是一个很好的策略。
5.琴叶榕是广泛分布于我国南方的一种桑科植物，具有很高的食用和药用价值。在中国传统用法中，fph被认为具有清热、促进血液循环和护肝的作用。在民间，fph被用来治疗咳嗽、煲汤作为日常保健。目前尚未见琴叶榕提取物在制备预防或治疗炎症性肠病或其相关的继发性肝损伤的药物中的文献报道。


技术实现要素：

6.鉴于此，本发明的目的在于提供琴叶榕提取物在制备预防或治疗炎症性肠病或其相关的继发性肝损伤的药物中的应用。
7.琴叶榕(ficus pandurata hance，fph)是我国南方地区广泛应用于日常保健的传统中草药。
8.本发明所述的琴叶榕提取物为琴叶榕水提物。具体提取工艺可以为：取新鲜的琴叶榕地上药用部位，剪碎后加适量蒸馏水浸泡过夜，加入8-15倍蒸馏水加热沸腾后保持微沸0.5-2h后过滤，滤渣再加5-10倍蒸馏水加热沸腾后保持微沸0.5-2h，合并两次滤液浓缩即得琴叶榕水提物。
9.炎症性肠病(ibd)是一种威胁人类健康的全球性疾病，通常伴有肠-肝轴介导的肝脏损伤。氧化应激在ibd发病中起着关键作用，在此过程中，过度氧化会破坏肠道细胞之间的紧密连接，促进促炎因子渗透，从而破坏肠道黏膜。
10.本发明研究了琴叶榕提取物对小鼠ibd的抑制作用，并探讨了其潜在机制。本发明通过葡聚糖硫酸钠(dss)诱导建立uc小鼠模型，评价fph对uc的治疗作用，此外，通过western blot分析评估了结肠组织中keap1、nrf2、ho1、nqo1、nox2和p22 phox的表达，并通过elisa分析评估了氧化应激的三个重要标志物mda、gsh-px和t-sod的水平。结果表明，琴叶榕提取物可显著缓解葡聚糖硫酸钠(dss)诱导uc小鼠的体重减轻、疾病活动指数(dai)、粪便黏稠度变化、直肠出血和结肠缩短等uc症状。琴叶榕提取物可逆转dss对髓过氧化物酶(mpo)水平、二胺氧化酶(dao)活性的影响。琴叶榕提取物通过抑制tlr4/myd88/nf-κb通路抑制uc。琴叶榕提取物显著上调zo-1和occludin的蛋白表达从而增强了小鼠的肠道屏障，并通过增加t-sod、gsh-px的水平以及nrf2、ho-1、nqo1的蛋白质表达，降低mda水平和keap1、p22-phox、nox2表达调节氧化还原平衡来增强结肠的抗氧化应激特性。
11.肠道合并肝损伤是严重ibd最常见的并发症之一，lps/tlr4通路在肝损伤的触发中起关键作用，本发明通过进一步研究显示，琴叶榕提取物还可以显著抑制与结肠炎相关的继发性肝损伤，降低肝脏指数、alt和ast水平，降低小鼠肝组织中tnf-α、lps、lbp和scd14等与肝炎相关的细胞因子水平。
12.综上所述，本研究表明，琴叶榕提取物不仅可以通过抑制lps/tlr4/myd88/nf-kb途径抑制溃疡性结肠炎，通过增强结肠的抗氧化作用增强肠道屏障，还可以保护溃疡性结肠炎继发性肝损伤。
13.本发明还提供了一种预防或治疗治疗炎症性肠病的药物，包含有效含量的琴叶榕提取物和药学上可接受的载体。本发明预防或治疗治疗炎症性肠病的药物可经本领域常规方法制备成适宜的剂型。优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉剂或颗粒剂。
14.本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
15.本发明提供了琴叶榕提取物在制备预防或治疗炎症性肠病或其相关的继发性肝损伤的药物中的新用途，研究了琴叶榕提取物对小鼠ibd的抑制作用和对继发性肝损伤的保护作用，并探讨了其潜在机制。结果表明，琴叶榕提取物对dss诱导的ibd有较好的缓解作用，并对ibd伴发的继发性肝损伤有保护作用，主要通过抑制炎症途径lps/tlr4/myd88/nf-kb，以及抑制结肠氧化应激增强肠道屏障。本发明首次为琴叶榕提取物对ibd和继发性肝损伤的治疗作用提供了实验证据，进一步扩大了琴叶榕的应用前景。
附图说明
16.图1为fph减轻dss诱导的小鼠急性结肠炎的结果数据图，其中(a)为fph抗dss小鼠模型结肠炎作用的设计流程图；(b)和(c)分别为fph对结肠炎小鼠体重和弊病活动指数的影响；(d)为各组小鼠结肠的代表性照片；(e)fph对结肠炎小鼠结肠长度的影响；
17.图2为fph通过抑制tlr4/myd88/nf-κb信号通路抑制dss诱导的小鼠结肠炎的结果数据图，其中(a)为结肠h&e染色组织学分析(ec:上皮细胞，ig:肠腺，sl:粘膜下层，ml:肌层，mcl:粘膜层，gc:杯状细胞)；(b)和(c)分别为采用western blot法检测结肠组织中tlr4/myd88/nf-κb的蛋白表达，western blot结果与β-actin归一化定量分析；(d)免疫组化法检测结肠组织中tlr4和nf-κb的蛋白表达水平；
18.图3为fph对ibd小鼠肠道屏障的影响结果数据图，其中(a)为结肠匀浆对mpo浓度的影响；(b)结肠匀浆对dao浓度的影响；(c)为western blot检测结肠组织中紧密连接蛋白zo1、occludin的表达水平，(d)为western blot对β-actin进行归一化定量分析；
19.图4为fph对dss诱导的ibd小鼠结肠抗氧化作用有增强作用的结果数据图，其中(a)、(b)和(c)分别为fph对结肠匀浆中mda、t-sod和gsh-px水平的影响；(d)为western blot检测fph对结肠组织中keap-1、nrf2、ho1、nqo1、p22-phox、nox2蛋白表达的影响；
20.图5为fph减轻dss诱导的小鼠急性结肠炎继发性肝损伤的结果数据图，其中(a)为fph治疗后肝组织的代表性照片；(b)、(c)和(d)分别为fph对ibd小鼠肝脏指数、血清丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶的影响；(e)为肝组织h&e染色组织学分析；
21.图6为fph通过抑制lps/lbp/cd14信号轴减轻结肠炎小鼠继发性肝损伤的结果数据图，其中fph对ibd小鼠肝组织tnfα(a)、lps(b)、lbp(c)、scd14(d)水平的影响。
具体实施方式
22.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
23.一、材料与方法
24.1.1.试剂及药物制备
25.葡聚糖硫酸钠(dss，mw：36～50kda，s5036，9011-18-1)来自mp biomedicals inc.(加利福尼亚州，美国)，丙氨酸转氨酶(alt，c010-2-1)和天冬氨酸转氨酶(ast，c009-2-1)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(中国南京)，mpo(#m1002070-2)和dao(#m1002199-2)检测试剂盒购自酶联生物科技有限公司(中国上海)，elisa试剂盒包括mda(417210607)、gsh-px(312210519)、t-sod(535210519)、lps(261210519)、lbp(845210621)、scd14(521210621)，tnfα(569210610)购自天津安诺瑞康生物技术有限公司(天津)(中国天津)。zo-1(af5145)、occludin(df7504)、myd88(af5195)、ho1(af5393)、nqo1(df6437)、keap1(af5266)、nox2(df6520)、p22-phox(df1009)的一抗(t0022)来自affinity biosciences ltd(oh,usa)。nrf2(a0674)、tlr4(293072)和nf-κb(8242s)的一抗分别购自爱博泰克生物技术(中国武汉)、santa cruz(加利福尼亚州，美国)和cell signal technology(波士顿，美国)。
26.琴叶榕提取物(简称fph)的制备：琴叶榕采集于广东省江门市开平市大津村，经广州中医药大学鉴定教研室黄海波教授鉴定为桑科榕属植物ficus pandurate hance。取新鲜的琴叶榕地上药用部位480g，剪碎后加适量蒸馏水浸泡过夜，取10倍蒸馏水加热沸腾后保持微沸1h后过滤，滤渣再加8倍蒸馏水加热沸腾后保持微沸1h，合并两次滤液浓缩至含生药量4.8g/ml的琴叶榕水提取液。提取液于-36℃冻存备用，用时稀释至所需的药物浓度。
27.1.2.实验设计
28.从广东省实验医学动物中心(中国佛山)中购进10周龄的c
57
bl/6小鼠(雄性)，所有小鼠自由进食和饮水，并保持在12小时光/暗循环的条件。将小鼠随机分配到对照组、2.5％dss(模型)、2.5％dss fph高剂量(fph-h，48g/kg，根据原料量计算)、2.5％dss fph低剂量(fph-l,24g/kg,根据原料数量计算)组。从第1天到第12天灌胃fph，并通过2.5％dss(w/v)诱导结肠炎小鼠模型7天(从第6天到第12天)。在fph治疗终止后24小时处死小鼠，整个实验设计如图1(a)所示。
29.1.3.疾病活动指数(dai)评估
30.dai评分是根据体重变化、直肠出血和大便黏稠度确定的。dai的评分系统如表1所示。
31.表1:dai评分系统
[0032][0033]
1.4.样品收集
[0034]
fph给药后麻醉小鼠取血清，处死并解剖小鼠。简而言之，收集血液并通过在4℃下以4,000rpm离心10分钟获得血清。取出结肠进行长度测量。部分结肠组织用4％多聚甲醛(pfa)固定进行苏木精伊红(h&e)染色，其余部分-80℃保存。肝脏也被取出并称重，部分固定用于h&e染色进行组织病理学检查，其他组织储存在-80℃。
[0035]
1.5.酶联免疫吸附测定(elisa)
[0036]
elisa检测试剂盒已商业化，并根据制造商的介绍进行生化分析。结肠和肝脏组织在预冷磷酸盐缓冲盐(pbs，0.01m，ph7.4)中洗涤，并用10倍的pbs(v/w)制备匀浆。样品于4℃5,000g离心10min，收集上清液用于生化分析。
[0037]
1.6.蛋白质印迹分析
[0038]
结肠组织用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(碧云天，中国)的ripa裂解缓冲液在冰上裂解30分钟。在4℃下以15000rpm离心10分钟后收集蛋白质样品，并通过二喹啉甲酸(bca)蛋白质分析试剂盒(碧云天，中国)测量蛋白质浓度。将等量的蛋白质(40μg)在8％～15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上(默克密理博有限公司ipvh00010，德国达姆施塔特)。在室温下用quickblock
tm
溶液(碧云天，p0252，中国上海)封闭膜15分钟，在pbst缓冲液中洗涤，并在4℃下与zo-1、occludin、ho1、nqo1、keap-1、nrf2、nox2、p22 phox、tlr4、myd88、nf-κb和β-actin的一抗孵育过夜。用pbst洗涤3次后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶(hrp)(1:10000)结合的二抗孵育1.5h。用增强化学发光(ecl)试剂盒检测膜印迹。所有蛋白质印迹的灰色分析均采用image j软件进行。
[0039]
1.7.苏木精-伊红(h&e)染色
[0040]
根据参考文献进行组织病理学检查，结肠和肝组织在4％pfa中固定24小时，用梯
度乙醇脱水，石蜡包埋，切片(4μm厚)，h&e染色，并用中性胶固定。在光学显微镜下观察组织的形态学变化，并拍摄照片(结肠组织放大50倍和200倍，肝组织放大100倍和200倍)。
[0041]
1.8.免疫组织化学(ihc)研究
[0042]
ihc分析检测各组结肠组织中tlr4、nf-κb的蛋白表达。将石蜡包埋样品切片(4μm)并在室温下用3％h2o2密封以使酶失活，然后在10mm柠檬酸钠缓冲液(ph 6.0)中煮沸10分钟并在室温下冷却。用正常山羊血清阻断切片，然后在4℃下用抗tlr4、抗nf-κb一抗(1:200)和相应的二抗孵育过夜。细胞核用dapi染色。在光学显微镜下观察tlr4、nf-κb在结肠组织中的表达，并拍摄照片(放大200倍)。
[0043]
1.9.统计分析
[0044]
所有数据均表示为平均值
±
标准误差(sem)。采用student’s t检验比较两组间的统计学差异。p《0.05水平上具有统计学意义。
[0045]
2.结果
[0046]
2.1.fph对dss致小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用
[0047]
通过自由饮用2.5％dss建立uc小鼠模型，评价fph对uc的治疗作用。实验设计如图1(a)所示。结果显示，与对照组相比，dss模型组体重下降、腹泻、直肠出血严重，为uc的典型特征，而fph治疗组体重下降、腹泻、直肠出血明显减轻(图1(b))。模型组dai评分明显高于对照组，说明uc模型建立成功。经fph处理后(24g/kg和48g/kg，以生药量计算)，dss诱导的高dai评分明显逆转(图1(c))，说明fph对uc的治疗效果良好。此外，如图1(d)和1(e)所示，fph可以显著延长uc小鼠的结肠。这些数据表明，fph可能是治疗uc的一个很好的候选者。
[0048]
2.2.fph通过抑制tlr4/myd88/nf-kb通路抑制uc
[0049]
通过h&e染色，观察fph对uc小鼠结肠组织病理形态学的影响。如图2(a)中箭头所示，对照组肠粘膜层中有许多柱状细胞，形状规则、排列整齐，充满杯状细胞。dss诱导后，组织病理学形态发生显著变化，包括粘膜层被破坏，杯状细胞几乎不可见，肌层和粘膜层均增宽，表明肠道通透性显著增加。此外，dss诱导后粘膜层炎症浸润明显增强。fph治疗后，肠粘膜中杯状细胞明显恢复，柱状细胞排列规则，说明肠道通透性和炎症明显改善。tlr4/myd88/nf-kb信号通路在uc的发生发展中起着关键作用。在这项研究中，western blot和ihc分析用于评估fph对tlr4/myd88/nf-kb信号通路的影响。如图2(b)-2(d)所示，dss显著增加结肠组织中tlr4、myd88、nf-kb的表达(与对照组相比，p《0.05)，而fph强烈抑制dss诱导的结肠中tlr4、myd88、nf-kb的高水平表达(与模型组相比，p《0.01)。所有结果表明，fph可通过抑制tlr4/myd88/nf-kb信号通路抑制uc。
[0050]
2.3.fph增强uc小鼠肠道屏障
[0051]
髓过氧化物酶(mpo)是一种糖蛋白，在中性粒细胞受到刺激时促进一系列的过氧化物应激反应，是反映肠道炎症发展的关键标志物。二胺氧化酶反映肠粘膜损伤和肠道屏障。如图3(a)和3(b)所示，与对照组相比，dss诱导结肠mpo水平升高，dao水平降低。fph治疗后，dss对mpo和dao的影响显著逆转(与模型组相比，p《0.01)。此外，通过western blot分析，研究了fph对结肠组织中紧密连接(tj)蛋白表达(zo-1和occludin)的影响。结果表明，fph可显著增加dss诱导的结肠炎小鼠模型结肠组织中zo-1和occludin的蛋白表达(图3(c)和3(d))，表明fph对肠道屏障的增强作用，这与h&e染色结果一致。
[0052]
2.4.fph增强结肠炎模型小鼠结肠抗氧化能力
[0053]
氧化应激被认为是ibd病理生理学的重要机制，因此，以氧化应激为靶点是治疗ibd的一个很好的策略。在本研究中，通过elisa和western blot分析研究了fph对dss诱导的结肠炎小鼠结肠氧化应激的影响。如图4(a)-4(c)所示，dss诱导后，总超氧化物歧化酶(t-sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)这两个重要的抗氧化参数显著降低(与对照组相比，p《0.05)，丙二醛(mda)显著升高(与对照组相比，p《0.01)。fph治疗后，dss对t-sod、gsh-px和mda的影响显著逆转(与模型组相比，p《0.05)。此外，还评估了fph对氧化应激相关蛋白表达的影响，包括keap1、nrf2、ho1、nox2、p22 phox、nqo1。图4(d)中的结果显示dss显著上调产生ros的三个重要蛋白keap1、nox2和p22 phox的表达，并下调nrf2及其下游因子血红素加氧酶-1(ho1)以及醌氧化还原酶1(nqo1)的表达(一种细胞溶质抗氧化剂黄素蛋白，催化nad(p)h氧化为nad(p)

。然而，fph治疗后，结肠组织中keap1、nox2和p22 phox水平明显降低，nrf2、ho1和nqo1水平显著升高，表明fph对结肠氧化应激具有良好的调节作用。总之，这些数据表明fph可以通过增强结肠抗氧化活性来增强肠道屏障，从而减轻小鼠溃疡性结肠炎。
[0054]
2.5.fph抑制小鼠结肠炎相关继发性肝损伤
[0055]
临床上，ibd常伴有继发性肝损伤，加重病情导致慢性肝炎或肝纤维化。在研究中，在dss诱导的ibd小鼠模型中评估了fph对肝损伤的保护作用。如图5(a)所示，dss诱导后肝组织外观发生明显变化，而fph可显著逆转dss诱导的肝外观变化。肝脏指数数据显示fph可以延缓dss对小鼠肝脏指数的影响(图5(b))。此外，血清alt、ast(图5(c)和5(d))水平(反映肝损伤的两个生化参数)在fph治疗后也显著逆转(与模型组相比，p《0.05)。h&e染色显示dss组小鼠肝组织具有典型的肝损伤特征，肝细胞排列紊乱，空泡增大，细胞边缘不清，细胞膜破裂，可见坏死区。fph治疗后，肝组织病理变化的典型特征显著改善(图5(e))。总之，这些数据表明fph可以抑制小鼠溃疡性结肠炎相关的继发性肝损伤。
[0056]
2.6.fph通过调节肠肝轴保护uc小鼠继发性肝损伤
[0057]
本研究表明，fph通过抑制tlr4/myd88/nf-kb通路减轻uc，并抑制uc相关的小鼠继发性肝损伤。据报道，肝肠轴在肝脏疾病的发病机制中起着关键作用，而肠源性脂多糖(lps)在通过门静脉循环诱导器官损伤、炎症和肝纤维化中起着核心作用。因此，推测fph保护uc小鼠继发性肝损伤的潜在机制可能与调节肝肠轴有关。因此，通过elisa测定肝脏中lps和lps相关信号因子如可溶性cd14(scd14)、lps结合蛋白(lbp)和tnfα的水平。图6(a)-6(d)中的数据显示dss显著增加肝组织中lps、scd14、lbp和tnfα的水平(与对照组相比，p《0.05)，而fph显著逆转dss对小鼠的影响(与模型组相比，p《0.05)。
[0058]
综上，上述结果表明fph可以通过增强结肠的抗氧化活性来加强小鼠的肠道屏障，从而减轻溃疡性结肠炎和溃疡性结肠炎相关的继发性肝损伤。