用透明质酸增强AAV介导的眼组织转导的制作方法

用透明质酸增强aav介导的眼组织转导
1.关于联邦资助研究的声明
2.本发明是在政府支持下完成的，由美国国立卫生研究院授予的授权号为ey024280。政府对本发明享有一定的权利。
3.相关申请
4.本技术要求于2019年6月27日提交的美国临时申请号62/867,596的权益，其通过引用整体并入本文。
5.发明背景
6.通过使用病毒来递送治疗性遗传物质，已经实现了基因疗法领域的重大进展。由于其低免疫原性和有效转导非分裂细胞的能力，腺相关病毒(aav)作为高效的基因疗法的病毒载体吸引了相当大的关注。已经证明aav可以感染多种细胞和组织类型，并且在过去十年中取得了重大进展以使这种病毒系统适用于人基因疗法。这十年来，眼组织的aav治疗一直是许多研究的重点，并且最近fda已经批准少数aav疗法用于患者。
7.发明概述
8.本文描述了将货物(cargo)递送至受试者的眼的方法。在一些实施方案中，受试者有此需要。在一些实施方案中，该方法包括向受试者的眼施用raav颗粒。在一些实施方案中，raav颗粒包含(a)与透明质酸(ha)混合的衣壳和(b)货物。在一些实施方案中，raav颗粒包含(a)与透明质酸(ha)混合的衣壳和(b)货物中的一种或两种。在一些实施方案中，货物递送至眼。在一些实施方案中，ha与raav颗粒衣壳直接接触。在一些实施方案中，raav衣壳至少部分地经ha包被。这些方法可以用于几种眼部疾病的基于基因疗法的治疗。在一些实施方案中，经玻璃体内施用raav颗粒。在一些实施方案中，衣壳包含一个或多个表面暴露的带正电荷残基的贴片(patch)。在一些实施方案中，衣壳的血清型是raav2或其变体。在一些实施方案中，衣壳的血清型是raav6或其变体。在一些实施方案中，该方法进一步包括在施用raav颗粒至眼之前将衣壳与ha预温育。在一些实施方案中，衣壳与包含ha的缓冲液预温育。在一些实施方案中，缓冲剂包含浓度为0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％或1.0％重量/体积的ha。在一些实施方案中，raav颗粒以约1x10
10 vg/ml、5x10
10 vg/ml、1x10
11 vg/ml、5x10
11 vg/ml、1x10
12 vg/ml、2x10
12 vg/ml、3x10
12 vg/ml、4x10
12 vg/ml、约5x10
12 vg/ml、约1x10
13 vg/ml或约5x10
13 vg/ml的滴度施用至受试者的眼。在一些实施方案中，raav颗粒以小于5x10
11 vg/ml的滴度施用至受试者的眼。在一些实施方案中，货物包括包含异源核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，异源核酸序列可操作地连接至调节序列，该调节序列指导异源核酸序列在感光细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞、m
ü
ller胶质细胞或星形胶质细胞中的表达。在一些实施方案中，调节序列选自下组：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、多腺苷酸化信号序列、内含子/外显子连接/剪接信号及其任何组合。在一些实施方案中，异源核酸序列编码治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是神经营养因子。在一些实施方案中，神经营养因子选自下组：脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白、胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)及其组合。在一些实施方案
中，治疗剂是光遗传学致动器(optogenetic actuator)。在一些实施方案中，光遗传学致动器选自下组：细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白及其组合。在一些实施方案中，施用货物以治疗下组的疾病：视网膜色素变性、勒伯尔氏先天性黑矇、年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、葡萄膜炎、best病、stargardt病、usher综合征、地图状萎缩、糖尿病性视网膜病、视网膜劈裂、色盲、无脉络膜、bardet biedl综合征、糖原贮积病及其组合。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b或aavlk03衣壳。在一些实施方案中，衣壳序列与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
9.在某些实施方案中，本文描述了包括将raav颗粒与透明质酸共同施用的方法。在一些实施方案中，具有透明质酸的raav颗粒通过玻璃体内注射施用至哺乳动物的一只或两只眼。在一些实施方案中，aav颗粒包含衣壳，该衣壳包含一个或多个表面暴露的带正电荷残基的贴片。在一些实施方案中，衣壳的血清型是aav2或其变体。在一些实施方案中，衣壳的血清型是aav6或其变体。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b或aavlk03衣壳。在一些实施方案中，raav颗粒的衣壳在施用至哺乳动物的一只或两只眼之前与透明质酸(ha)预温育。在一些实施方案中，衣壳与包含ha的缓冲液预温育。在一些实施方案中，衣壳与ha预温育至少约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟或约75分钟的持续时间。在一些实施方案中，衣壳预温育约15分钟的持续时间。在一些实施方案中，衣壳与浓度为至少约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、1.5％、2.5％、3.0％、3.5％、4％、5％或10％重量/体积的ha预温育。在一些实施方案中，raav颗粒以约1x10
10 vg/ml、5x10
10 vg/ml、1x10
11 vg/ml、5x10
11 vg/ml、1x10
12 vg/ml、2x10
12 vg/ml、3x10
12 vg/ml、4x10
12 vg/ml、约5x10
12
vg/ml、约1x10
13 vg/ml或约5x10
13 vg/ml的滴度施用。在一些实施方案中，raav颗粒以小于5x10
11 vg/ml的滴度施用。在一些实施方案中，玻璃体内注射以约200μl、约175μl、约160μl、约145μl、约130μl、约115μl、约100μl、约90μl、约80μl、约70μl、约60μl、约55μl、约50μl、约45μl、约35μl、约20μl、约10μl或约5μl的体积提供。在一些实施方案中，玻璃体内注射以约50μl的体积施用。在一些实施方案中，raav颗粒进一步包括包含异源核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，异源核酸序列或蛋白质是raav的货物。在一些实施方案中，异源核酸序列可操作地连接至调节序列，该调节序列指导异源核酸序列在感光细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞、m
ü
ller胶质细胞或星形胶质细胞中的表达。在一些实施方案中，异源核酸序列编码治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂用于治疗疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，治疗剂选自神经营养因子或光遗传学致动器。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd或地图状萎缩。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，治疗剂的产生a)保护一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞，b)恢复一个或多个杆和/或锥细胞介导的功能，c)恢复一只或两只眼的视觉行为,或d)其任何组合。在一些实施方案中，在初始施用raav颗粒至哺乳动物的一只或两只眼中后，治疗剂的产生在一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞中基本上持续至少三个月的时期。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神
经节细胞、m
ü
ller胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含神经营养因子。在一些实施方案中，神经营养因子选自下组：脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白、胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)及其组合。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是视网膜色素变性或青光眼。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含光遗传学致动器。在一些实施方案中，光遗传学致动器选自细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白或其组合。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。在一些实施方案中，衣壳序列与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
10.在一些实施方案中，本文描述了用于为有此需要的哺乳动物提供治疗有效量的治疗剂的方法。在一些实施方案中，该方法包括将raav颗粒与透明质酸(ha)经玻璃体内共同施用至哺乳动物的一只或两只眼。在一些实施方案中，ha与raav衣壳直接缔合。在一些实施方案中，raav颗粒与透明质酸的共同施用达有效为哺乳动物提供治疗有效量的治疗剂的时间。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav2或aav6衣壳，或其变体。在一些实施方案中，raav颗粒包含选自aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b和aavlk03衣壳的衣壳变体。在一些实施方案中，治疗剂是异源核酸序列。在一些实施方案中，raav颗粒包括包含异源核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，异源核酸序列可操作地连接至调节序列，该调节序列指导异源核酸序列在感光细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞、m
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ller胶质细胞或星形胶质细胞中的表达。在一些实施方案中，异源核酸序列编码治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自神经营养因子或光遗传学致动器。
11.在一些实施方案中，治疗剂用于治疗疾病、疾患或病症。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd或地图状萎缩。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，治疗剂的产生a)保护一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞，b)恢复一个或多个杆和/或锥细胞介导的功能，c)恢复一只或两只眼的视觉行为或d)其任何组合。在一些实施方案中，在初始施用raav颗粒至哺乳动物的一只或两只眼中后，治疗剂的产生在一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞中基本上持续至少三个月的时期。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞、m
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ller胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含神经营养因子。在一些实施方案中，神经营养因子选自下组：脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白、胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)及其组合。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是视网膜色素变性或青光眼。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含光遗传学致动器。在一些实施方案中，光遗传学致动器选自细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白或其组合。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。在一些实施方案中，衣壳序列与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:
5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
12.在一些实施方案中，本文描述的是用于治疗或改善疾病、病症或疾患的一种或多种症状的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有此需要的哺乳动物的一只或两只眼经玻璃体内共同施用raav颗粒和透明质酸。在一些实施方案中，共同施用达足以治疗或改善哺乳动物的疾病、病症或疾患的一种或多种症状的时间。在一些实施方案中，raav颗粒包含i)编码治疗剂的多核苷酸和ii)aav2或aav6衣壳或其变体。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b或aavlk03衣壳。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd或地图状萎缩。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，治疗剂的产生a)保护一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞，b)恢复一个或多个杆和/或锥细胞介导的功能，c)恢复一只或两只眼的视觉行为，或d)其任何组合。在一些实施方案中，在初始施用raav颗粒至哺乳动物的一只或两只眼中后，治疗剂的产生在一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞中基本上持续至少三个月的时期。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞、m
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ller胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含神经营养因子。在一些实施方案中，神经营养因子选自下组：脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白、胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)及其组合。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是视网膜色素变性或青光眼。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含光遗传学致动器。在一些实施方案中，光遗传学致动器选自细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白或其组合。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。
13.在一些实施方案中，本文描述了用于为有此需要的哺乳动物提供治疗有效量的治疗剂的方法。在一些实施方案中，该方法包括将raav颗粒与透明质酸经玻璃体内共同施用至哺乳动物的一只或两只眼。在一些实施方案中，将raav颗粒与透明质酸共同施用至哺乳动物的一只或两只眼达有效为哺乳动物提供治疗有效量的治疗剂的时间。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b或aavlk03衣壳。在一些实施方案中，衣壳序列与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
14.在某些方面，本文描述了用于治疗或改善疾病、病症或疾患的一种或多种症状的方法。在一些实施方案中，方法包括向有此需要的哺乳动物的一只或两只眼经玻璃体内共同施用raav颗粒与透明质酸达足以治疗或改善该哺乳动物的疾病、病症或疾患的一种或多种症状的时间。在一些实施方案中，raav颗粒包含i)编码治疗剂的多核苷酸和ii)aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b或aavlk03衣壳。在一些实施方案中，衣壳选自aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10和aavshh10y。在一些实施方案中，衣壳选自aav3、aav3b和aavlk03。在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:2所示的野生型
aav2衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代包含y272f、y444f、t491v、y500f、y700f、y704f和y730f的一种或多种。在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:6所示的野生型aav6衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代包含y445f、y705f、y731f、t492v和s663v的一种或多种。在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:1所示的野生型aav1衣壳的氨基酸残基531处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代是e531k。在一些实施方案中，衣壳包含aav7bp2。在一些实施方案中，衣壳包含aav2g9。在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:8所示的野生型aav8衣壳的氨基酸残基533和/或733处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代是e533k和/或y733f。在一些实施方案中，衣壳包含如seq id no:2所示的野生型aav2衣壳的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代包括：(a)y444f；(b)y444f y500f y730f；(c)y272f y444f y500f y730f；(d)y444f y500f y730f t491v；(e)y272f y444f y500f y730f t491v，或在如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9或seq id no:10中分别所示的野生型aav1、aav3、aav4、aav5、aav7、aav9或aav10衣壳蛋白中的任一种中与其对应的等同氨基酸位置处。在一些实施方案中，衣壳包含如seq id no:6中所示的野生型aav6衣壳的非天然氨基酸取代，其中非天然氨基酸取代包括：(a)y445f；(b)y705f y731f；(c)t492v；(d)y705f y731f t492v；(e)s663v；或(f)s663v t492v。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd或地图状萎缩。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，治疗剂的产生a)保护一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞，b)恢复一个或多个杆和/或锥细胞介导的功能，c)恢复一只或两只眼的视觉行为或d)其任何组合。在一些实施方案中，在初始施用raav颗粒至哺乳动物的一只或两只眼中后，治疗剂的产生在一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞中基本上持续至少三个月的时期。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞、m
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ller胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含神经营养因子。在一些实施方案中，神经营养因子选自下组：脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白、胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)及其组合。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是视网膜色素变性或青光眼。在一些实施方案中，治疗剂的产生保护一个或多个视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。在一些实施方案中，治疗剂包含光遗传学致动器。在一些实施方案中，光遗传学致动器选自细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白或其组合。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。在一些实施方案中，衣壳序列与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
15.在某些实施方案中，本文描述了用于储存aav和透明质酸(ha)的混合物的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包含：(a)浓度为约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％或10％重量/体积的ha；(b)平衡盐溶液(bss)；(c)人工脑脊液；和/或(d)磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在一些实施方案中，缓冲液进一步包含(e)林格氏乳酸溶液；(f)tmn200溶液；(g)聚山梨酯20；和/或(h)泊洛沙姆188。
在一些实施方案中，ha的浓度为0.4％重量/体积。
16.附图简述
17.以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以展示本公开的某些方面。通过参考以下结合附图的描述可以更好地理解本公开，其中相同的参考数字标识相同的元件，并且其中：
18.图1是透明质酸(ha)的化学结构的示意图，透明质酸(ha)是d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-葡糖胺的二聚体的线性多联体。
19.图2a-2b例示了在感染前5分钟、15分钟和1小时，在体外向661w鼠感光细胞施用raav颗粒的影响，所述raav颗粒的衣壳已经与ha(商品名)预温育。用ha预处理增加了aav2的661w细胞的转导(图2a)。aav5的661w细胞如图2b中所示。衣壳与以3:1(aav:)的比率预温育，然后以2000的感染复数(moi)注射到细胞中。对照包括未感染的细胞和单独用载体感染的细胞。
20.图3例示了向hek293t细胞施用在体外以5000和10,000的moi注射的基于自身互补(sc)raav6的颗粒的影响，所述颗粒表达由smcba启动子可操作地控制的mcherry报告转基因。在指示的情况下，aav6衣壳和aav6衣壳变体在感染前与ha预温育。受测试的变体包括aav6(d532n)和aav6-3pmut。通过荧光激活细胞分选(facs)，通过在每个样品中将阳性细胞的百分比乘以平均荧光强度计算mcherry表达。误差线代表
–
1标准偏差。ha预处理显著增加了这些颗粒对hek293t细胞的转导。
21.图4例示了验证实验的结果，其中针对三种细胞系中的cd44细胞表面受体评估了免疫组织化学(ihc)。arpe-19细胞(图4a)(人rpe系)展现出cd44表达(如箭头所示)；而hek293t(图4c)和661w细胞(图4b)不表达cd44。
22.图5例示了单独的aav2衣壳和与在50mm和1m nacl之间的不同盐浓度下预温育的aav2衣壳的乙酰肝素结合洗脱谱的结果。ha预处理不会改变aav2衣壳与细胞膜上硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)的相互作用。
23.图6a-6b例示了在体内将raav2经玻璃体内注射至整个小鼠视网膜中后，ha预温育和共同施用对aav2介导的mcherry表达的转导的影响。对照包括未感染的细胞和单独用载体感染的细胞。图6b表示在图6a中观察到的mcherry表达的量化，如通过流式细胞术所测量的。mcherry表达由图6a中的箭头指示。
24.图7a-7c例示了在有或没有用ha预处理的衣壳的情况下，经玻璃体内向三只4周龄的nrl-gfp小鼠中注射包含aav2衣壳变体dge-df的raav颗粒的影响。显示了在注射后2周(图7a)和4周(图7b)采集的眼底图像。图7c表示在图7a和7b中观察到的mcherry表达的量化，如通过在三只小鼠上聚合的流式细胞术数据所测量的。mcherry表达由图7a-7b中的箭头指示。
25.图8a-8c例示了在有或没有用ha预处理衣壳的情况下，经玻璃体内向三只nr1-gfp小鼠中注射包含aav2衣壳变体p2-v2的raav颗粒的影响。显示了在注射后2周(图8a)和4周(图8b)采集的眼底图像。图8c表示在图8a和8b中观察到的mcherry表达的量化，如通过在三只小鼠上聚合的流式细胞术数据所测量的。mcherry表达由图8a-8b中的箭头指示。
26.图9a-9c例示了在有或没有用ha预处理衣壳的情况下，经玻璃体内向nr1-gfp小鼠
中注射包含aav2衣壳变体p2-v3的raav颗粒的影响。显示了在注射后2周(图9a)和4周(图9b)采集的眼底图像。图9c表示在图9a和9b中观察到的mcherry表达的量化，如通过在两只小鼠上聚合的流式细胞术数据所测量的。mcherry表达由图9a-9b中的箭头指示。
27.图10a-10c例示了在有或没有用ha预处理衣壳的情况下，经玻璃体内向三只nrl-gfp小鼠注射包含aav2衣壳变体me-b(y-f t-v)的raav颗粒的影响。显示了在注射后2周(图10a)和4周(图10b)采集的眼底图像。图10c表示在图10a和10b中观察到的mcherry表达的量化，如通过在三只小鼠上聚合的流式细胞术数据所测量的。mcherry表达由图10a-10b中的箭头指示。
28.图11是描绘四种衣壳的聚合流式细胞术数据的示意图：dge-df、p2-v2、p2-v3和me-b(y-f t-v)。
29.图12a-12e是显示在经玻璃体内施用ha处理的dge-df(图12a)、p2-v2(图12b)、p2-v3(图12c)、me-b(y-f tv)(图12d)后视网膜电图(erg)结果和聚合数据(图12e)的示意图。ha处理和共同施用对视网膜细胞功能没有影响。在图12e的上图中，n＝11。p值＝0.478132。在图12e的下图中，n＝11。p值＝0.524563。
30.发明详述
31.本公开提供了用于施用具有增强的转导特性的raav颗粒的新方法、组合物和缓冲液，包括aav衣壳和透明质酸的预温育和/或共同施用。在一些实施方案中，本文公开的方法依赖于用已经包含在哺乳动物眼中的天然物质进行治疗。在一些实施方案中，本文公开的方法不依赖于衣壳的修饰并且通过不干扰aav粘附的机制起作用，因此满足了本领域长期以来的需求。有利地，本文公开的raav颗粒施用的新方法在转导哺乳动物眼的视网膜，特别是在体内转导感光细胞(pr)和视网膜色素上皮(rpe)细胞中具有提高的效率。
32.眼内aav疗法通常具有较差的转导谱。鉴于aav2衣壳聚集的倾向，实现aav2血清型的raav颗粒的充分转导特别难以捉摸。这种聚集在很大程度上是由于衣壳表面上带正电荷的氨基酸残基的存在。aav6衣壳以及aav6、aav2和其他衣壳的几种假型和变体，在其暴露于环境的表面上具有类似的带正电荷的残基的“贴片”。
33.将基因递送到视网膜中的两种常见方法是玻璃体内和视网膜下注射。视网膜下注射需要施用到视网膜色素上皮(rpe)和感光器之间的视网膜下腔中以转导这些神经元。为了实现载体的递送，针必须穿透视网膜，并且在这样做时将感光细胞层与rpe分离。
34.玻璃体内注射侵入性较小，并因此是临床人受试者常规进行的优选施用途径。尽管如此，很少有aav血清型通过玻璃体内递送表现出有效的转导。这部分是由于内界膜(ilm)的存在，它是玻璃体和神经视网膜之间的基底膜，充满硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其通过隔离具有高硫酸乙酰肝素亲和力的衣壳充当载体通过视网膜有效传播的屏障。特别是，aav2载体在通过玻璃体内注射施用后通常不能转导感光细胞。
35.遗传性视网膜退行性疾病是aav介导的基因疗法的临床有希望的焦点。这些疾病源于眼感光细胞或视网膜色素上皮(rpe)中表达的mrna转录物的致病突变，导致细胞死亡和结构恶化。旨在减少aav2和aav6衣壳聚集的先前方法已经涉及用高盐缓冲液对衣壳进行预处理。但这些缓冲液对眼有毒，使得无法在预处理后进行施用。
36.透明质酸(ha)是阴离子的非硫酸化糖胺聚糖，它是人玻璃体的主要组分，在人玻璃体中它与细胞外基质共价连接。此外，ha是经fda批准的具有光学和粘弹性特性的物质，
使其成为人玻璃体的良好替代物。ha通常通过细胞表面糖蛋白，特别是受体cd44的内吞作用进入细胞。ha也可以通过微胞饮作用进入细胞。
37.腺病毒转导是通过依赖于cd44的机制发生的，其并不旨在影响腺病毒感染性的效率。转导的增加主要是由cd44的胞内结构域的释放介导的增加的转基因表达的功能，其作为ha与cd44结合的结果出现。然而，腺病毒疗法的结果不能在重组aav疗法中轻易地重述。此外，由于与cd44受体结合的赋形剂可能干扰aav衣壳结合ilm的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)组分的能力(这对细胞识别和内化至关重要)，存在用通过cd44非依赖性机制起作用的赋形剂施用的需要。
38.已经开发了替代的“subilm”注射方法，其中将aav载体放置在ilm和神经视网膜之间的手术诱导的、水分离的空间或泡中。如上所述，subilm注射通常避免了aav传播的ilm障碍。
39.所描述的方法通过非侵入性玻璃体内递送以可能低于subilm递送的那些的载体剂量提供有效的载体转导。本公开至少部分基于以下发现：在表面上包被具有带正电荷的贴片的aav衣壳防止这些颗粒在玻璃体中聚集。如本文所用，衣壳的“表面暴露的贴片”是指衣壳上暴露于环境的连续或邻接(或基本上连续或邻接)阳离子残基的三维区域。防止衣壳聚集能够使aav的单颗粒悬浮液横向传播以传遍整个视网膜以到达靶细胞，诸如视网膜神经节细胞(rgc)、muller胶质细胞和其他pr。aav的这种增强传播表明，可以减少当前玻璃体内aav的剂量，以在靶细胞中实现相同的转导效率，这提供了更安全的基因疗法。
40.如本文所述，具有阳离子贴片的衣壳与透明质酸的预温育增加了玻璃体内递送的raav颗粒的视网膜转导，并且不依赖于衣壳序列。在一些实施方案中，ha对转导的增强独立于cd44起作用。在一些实施方案中，ha作为媒介物不干扰ilm和玻璃体中hspg的aav结合。
41.在一些实施方案中，所述方法适用于多种aav衣壳血清型和假型。所述方法提高了载体效力，因而降低了实现期望效果所需的raav颗粒的浓度。因此，所述方法能够增加安全性并降低制备或raav的费用。这些方法最小化了与玻璃体内注射相关的手术风险，降低了护理成本，并增加了基因疗法的可及性。所述方法在通过玻璃体内注射递送基于aav2或aav6的衣壳的任何临床环境中增加aav的视网膜转导。
42.某些术语
43.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和组合物可以用于本公开的实践或测试，但本文描述了优选的方法和组合物。出于本公开的目的，以下术语定义如下：
44.如本文所用，术语“透明质酸”和“ha”涵盖透明质酸、透明质烷、和透明质酸钠，而不考虑其分子量或质量。也就是说，这些术语意在涵盖本领域已知或使用的任何分子量的透明质酸。该术语还涵盖透明质酸的变体，包括但不限于ha的截短和化学修饰形式。ha“变体”与野生型ha序列的至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。
45.如本文所用，术语“玻璃体内注射”、“玻璃体内递送”和“玻璃体内施用”是指将物质注射进或注射于眼的玻璃体。该术语不涵盖物质(例如aav载体或颗粒)从由subilm注射
创建的泡渗漏至玻璃体或视网膜。
46.如本文所用，术语“光遗传学致动器(optogenetic actuator)”是指能够调控活组织中的神经元，例如视网膜中的神经元的活性的光敏离子通道蛋白，该神经元已经过基因修饰以表达这些蛋白质。示例性的光致致动器包括但不限于嗜盐菌视紫红质、视黑蛋白、锥视蛋白、通道视紫红质、细菌视紫红质、哺乳动物视紫红质和古细菌相关视蛋白。
47.如本文所用，术语“受试者”描述了生物体，包括哺乳动物，诸如灵长类，可以向其提供用根据本公开的组合物的治疗。可以从所描述的治疗方法中获益的哺乳动物物种包括但不限于类人猿；黑猩猩；红毛猩猩；人；猴；家养动物，诸如狗和猫；家畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其他动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
48.如本文所用，术语“治疗”或其任何语法变体(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于减轻疾病或疾患的症状；和/或减少、遏制、抑制、减轻、改善或影响疾病或疾患的进展、严重性和/或范围。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物、组合物、构建体或药剂以预防、延迟、减轻、阻滞或抑制与疾病相关的症状或病况的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病的症状或疾病的副作用的减少、消除或预防。
49.如本文所用，在一些实施方案中，术语“预处理”是指在将载体施用至受试者或受试者细胞之前，将外源性物质应用于aav载体。
50.如本文所用，术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或疾患或能够产生预期治疗效果的量。
51.如本文所用，术语“工程化的”和“重组的”细胞意图指已经引入外源性多核苷酸区段(诸如导致生物活性分子转录的dna区段)的细胞。因此，工程化细胞不同于不含有重组引入的外源性dna区段的天然存在的细胞。因此，工程化细胞是包含至少一个或多个通过人手引入的异源核酸区段的细胞。
52.如本文所用，术语“启动子”是指调节转录的核酸序列的一个或多个区域。
53.如本文所用，术语“调节元件”是指调节转录的核酸序列中一个或多个区域。示例性调节元件包括但不限于增强子、转录后元件、转录控制序列等。
54.如本文所用，术语“载体”是指能够在宿主细胞中复制和/或另一个核酸区段可以与其可操作地连接从而引起附接区段的复制的核酸分子(通常由dna组成)。质粒、粘粒或病毒是示例性载体。
55.如本文所用，术语“基本上对应于”、“基本上同源”或“基本上同一性”表示核酸或氨基酸序列的特征，其中所选择的核酸或氨基酸序列与所选择的参考核酸或氨基酸序列相比具有至少约百分之70或约75的序列同一性。更通常地，所选择的序列和参考序列将具有至少约百分之76、77、78、79、80、81、82、83、84或甚至85的序列同一性，以及更优选地，至少约百分之86、87、88、89、90、91、92、93、94或95的序列同一性。仍然更优选地，高度同源的序列通常在所选择的序列和与之比较的参考序列之间共享大于至少约百分之96、97、98或99的序列同一性。序列同一性的百分比可以在待比较的序列的整体长度上计算，或者可以通过排除总共小于所选择的参考序列的约百分之25左右的小缺失或添加来计算。参考序列可以是较大序列的子集，诸如基因或侧翼序列的部分，或染色体的重复部分。然而，在两个或更多个多核苷酸序列的序列同源性的情况下，参考序列通常包含至少约18-25个核苷酸，更通常地至少约26至35个核苷酸，甚至更通常至少约40、50，60、70、80、90甚至100个左右的核
苷酸。
56.当期望高度同源的片段时，两个序列之间的百分比同一性程度将是至少约80％，优选至少约85％，更优选约90％或95％或更高，如通过本领域技术人员熟知的一种或多种序列比较算法，诸如由pearson和lipman(1988)描述的fasta程序分析和基于brutlag等人(comp.app.biosci.6:237-245(1990)的算法的blastn计算机程序所容易测定的。用于测定查询序列(例如，本公开的序列)和目标序列之间最佳总体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)可以使用fasta或blastn确定。在序列比对中，查询序列和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果表示为百分比同一性。在fasta氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝pam 0，k元组＝2，错配惩罚＝1，连接惩罚＝20，随机化组长度＝0，截止分数＝1，窗口大小＝序列长度，空位惩罚＝5，空位大小惩罚＝0.05，窗口大小＝500或目标氨基酸序列的长度，以较短者为准。核苷酸是否匹配/比对由fasta序列比对的结果所确定。然后从百分比同一性中减去由以上fasta程序使用指定的参数计算的百分比，得到最终的百分比同一性分数。该最终百分比同一性分数用于本公开目的。
[0057]“百分比(％)同一性”是指两个序列(核苷酸或氨基酸)在比对中的相同位置具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与seq id no:y是x％相同的”是指氨基酸序列与seq id no:y的％同一性，并详细说明为氨基酸序列中x％的残基与seq id no:y中所公开的序列的残基相同。通常，采用计算机程序用于此类计算。比较和比对序列对的示例性程序包括align(myers and miller,1988、fasta(pearson and lipman,1988；pearson,1990)和gapped blast(altschul et al.,1997)、blastp、blastn或gcg(devereux et al.,1984)。
[0058]
如本文所用，术语“可操作地连接”是指被连接的核酸序列通常是连续的或基本上连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时是连续的并且在阅读框中。然而，由于增强子通常在通过几千个碱基与启动子分开时起作用，并且内含子序列可能具有可变长度，一些多核苷酸元件可能是可操作地连接但不连续的。
[0059]
如本文所用，术语“变体”是指具有偏离自然界发生的特性的分子(例如衣壳)，例如，“变体”与野生型衣壳至少约80％相同，至少约90％相同相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。相对于野生型蛋白质序列，蛋白质分子的变体，例如衣壳可以含有由安装到编码衣壳蛋白的核酸序列中的点突变所引起的氨基酸序列的修饰(例如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-15或15-20个氨基酸取代)。这些修饰包括化学修饰以及截短，诸如衣壳蛋白序列的n或c端的截短。
[0060]
如本文所用，单数形式“一个”、“和”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。
[0061]
如本文所用，除非上下文另有明确说明，所有数值或数范围包括在此类范围内或涵盖此类范围的整体整数和在范围内或涵盖范围内的整数或值的分数。因此，例如，提及90-100％的范围，包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等。
[0062]
如本文所用，“约”数目是指包括该数目的范围并且范围从低于该数目的10％到高于该数目的10％。“约”范围是指低于该范围下限的10％，跨越至高于该范围上限10％
[0063]
方法
[0064]
下面描述本公开的说明性实施方案。在一些实施方案中，本公开提供了使用ha作为媒介物用于通过玻璃体内注射将aav颗粒施用至哺乳动物的眼的方法。在一些实施方案中，目前描述的方法提供用于与ha的预温育和/或与ha的共同施用。在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于贮存ha和aav衣壳的缓冲液。
[0065]
在一些实施方案中，本文所述的玻璃体内施用方法能够增强具有一个或多个表面暴露的带正电荷残基的贴片的任何aav衣壳或衣壳变体的转导能力。在一些实施方案中，带正电荷残基的贴片包含多个带正电荷的残基。在一些实施方案中，带正电荷残基的贴片包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、30、50、60个带正电荷的残基。在一些实施方案中，透明质酸的负电荷与衣壳的带正电荷的残基进行静电相互作用。在一些实施方案中，ha与aav衣壳直接接触或缔合。在一些实施方案中，ha不与aav衣壳直接接触。在一些实施方案中，aav衣壳至少部分地由ha包被。在一些实施方案中，ha有效地包被衣壳的阳离子贴片，在施用至眼后屏蔽它免于与其他衣壳的阳离子贴片聚集。在一些实施方案中，这种屏蔽作用释放衣壳以横向传播遍及玻璃体并转导靶rpe和pr细胞，诸如rgc、muller细胞、星形胶质细胞和双极细胞。
[0066]
在一些实施方案中，与宿主细胞的玻璃体和ilm的细胞外基质共价连接的内源性透明质酸分子对与ha施用的aav衣壳的扩散或转导不施加任何阻碍作用。
[0067]
在一些实施方案中，通过用ha预处理和与ha施用提供的aav转导和扩散的增强的机制不依赖于与cd44细胞表面受体的相互作用。在一些实施方案中，本文提供的方法不干扰基底aav衣壳与靶细胞表面上的hspg的相互作用或细胞表面识别，同时仍促进aav颗粒遍及玻璃体的自由扩散。
[0068]
玻璃体液由99％的水、胶原原纤维和糖胺聚糖(gag)组成。绝大多数gag是透明质酸(ha)，人眼中ha的浓度为200ug/ml。ha是d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-葡糖胺二聚体的线性多联体(参见图1)。ha形成创建“网络”结构的折叠、环和转角，赋予分子粘弹性。ha可以多联化为各种长度，从而产生各种不同的分子量，范围从至少20千道尔顿(kda)至5,000kda。
[0069]
在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过玻璃体内注射将raav颗粒和ha施用至受试者的眼，和/或在施用至受试者之前用ha预处理raav颗粒，其中raav衣壳具有一种或多个表面暴露的阳离子贴片，即暴露于环境的衣壳表面上的连续或邻接(或基本上连续或邻接)的阳离子残基的三维区域。相关环境可以是玻璃体、内界膜(ilm)、视网膜下腔、细胞外基质、细胞膜和/或细胞胞质溶胶。在一些实施方案中，施用是相继施用或共同施用。
[0070]
预温育
[0071]
在一些实施方案中，在本文所述的方法中，在施用至受试者之前，衣壳与ha预温育至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟或约175分钟或更长的持续时间。在一些实施方案中，ha与aav衣壳直接接触。在一些实施方案中，衣壳与ha预温育约15分钟。在一些实施方案中，衣壳与ha预温育超过约15分钟。
[0072]
在一些实施方案中，衣壳与包含ha的缓冲液预温育至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟或约175分钟或更多分钟。在一些实施方案中，衣壳与包含ha的缓冲液预温育约15分钟，或超过约15分钟。在一些实施方案中，衣壳与包含浓度为至少约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、
0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、2％、3％、5％、10％、15％或20.0％重量/体积(w/v)的ha和bss的缓冲液预温育。在一些实施方案中，衣壳与包含浓度为约0.4％w/v的ha，以及bss、人工脑脊液(csf)和pbs中的一种或多种的缓冲液预温育。在一些实施方案中，衣壳与包含浓度为约0.4％w/v的ha，以及bss、人工csf、pbs、林格氏乳酸溶液、tmn200溶液、聚山梨酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种的缓冲液预温育。
[0073]
在所述方法的一些实施方案中，衣壳与浓度为至少约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、2％、3％、5％、10％、15％或20.0％w/v的ha预温育。在一些实施方案中，衣壳与浓度为约0.4％w/v的ha预温育。在一些实施方案中，衣壳与浓度为约0.5％w/v的ha预温育。
[0074]
剂量
[0075]
在一些实施方案中，raav颗粒通过玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，raav颗粒以至少约1x10
3 vg/ml、1x10
4 vg/ml、1x10
5 vg/ml、1x10
6 vg/ml、1x10
7 vg/ml、1x10
8 vg/ml、1x10
9 vg/ml、1x10
10 vg/ml、5x10
10 vg/ml、1x10
11 vg/ml、5x10
11 vg/ml、1x10
12 vg/ml、2x10
12 vg/ml、3x10
12 vg/ml、4x10
12 vg/ml、约5x10
12
vg/ml、约1x10
13 vg/ml、5x10
13 vg/ml、1x10
14 vg/ml、5x10
15 vg/ml或1x10
14 vg/ml的滴度经由玻璃体内施用来施用。在一些实施方案中，raav颗粒以小于5x10
11 vg/ml的滴度施用。在一些实施方案中，这些滴度的下限代表比在视网膜下aav递送中常规使用的那些剂量显著更低的剂量。
[0076]
在一些实施方案中，raav和ha的混合物以玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，玻璃体内注射以约1000μl、约900μl、约800μl、约700μl、约600μl、约500μl、约400μl、约300μl、约200μl、约175μl、约160μl、约145μl、约130μl、约115μl、约100μl、约90μl、约80μl、约70μl、约60μl、约55μl、约50μl、约45μl、约35μl、约20μl、约10μl、约5μl、约4μl、约3μl、约2μl、约1μl或约0.5μl的体积提供。在一些实施方案中，玻璃体内注射以约50μl的体积提供。
[0077]
在所述方法的某些方面，通过玻璃体内注射以给定的施用体积递送了较高浓度的aav载体。
[0078]
透明质酸
[0079]
在一些实施方案中，适合用于所述方法的ha具有本领域已知或使用的任何分子量。在一些实施方案中，用于根据所述方法施用和/或预处理或使用的ha具有为至少约4kda、5kda、20kda、25kda、30kda、40kda、50kda、75kda、100kda、150kda、200kda、350kda、500kda、750kda、1000kda、1500kda、2000kda、2500kda、3000kda、3200kda、3500kda、4000kda或5000kda的分子量。在一些实施方案中，用于根据所述方法施用和/或预处理或使用的ha具有小于约4kda、5kda、20kda、25kda、30kda、40kda、50kda、75kda、100kda、150kda、200kda、350kda、500kda、750kda、1000kda、1500kda、2000kda、2500kda、3000kda、3200kda、3500kda、4000kda或5000kda的分子量。在一些实施方案中，ha具有约20kda至约200kda范围的分子量。在一些实施方案中，ha具有约20kda或25kda的分子量。在一些实施方案中，ha的分子量是均匀的。在一些实施方案中，ha具有不同的分子量。在一些实施方案中，施用是相继施用或共同施用。
[0080]
施用
[0081]
在一些实施方案中，本文描述了用于向有此需要的哺乳动物提供治疗有效量的所选择的治疗剂的方法。在一些实施方案中，治疗剂在插入重组aav核酸载体的异源核酸或转
基因中编码。在一些实施方案中，核酸载体包含一种或多种异源核酸，该异源核酸包含编码与启动子可操作地连接的感兴趣的蛋白质或多肽的序列，其中一种或多种转基因在每一侧侧接有itr序列。在一些实施方案中，核酸载体进一步包含编码如本文所述的rep蛋白的区域，包含在itr侧翼的区域内或在该区域或核酸之外)与启动子(例如hgrk1启动子)可操作地连接，其中一个或多个核酸区域。itr序列可以衍生自任何aav血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或可以衍生自多于一种血清型。在一些实施方案中，itr序列衍生自aav2或aav6。在一些实施方案中，第一血清型的itr序列衍生自maav3、aav2或aav6。在其他实施方案中，第一血清型的itr序列衍生自aav1、aav5、aav8、aav9或aav10。在一些实施方案中，itr序列与衣壳有相同的血清型(例如，aav3 itr序列和aav3衣壳等)。
[0082]
itr序列和含有itr序列的质粒是本领域已知的并且是市售的(参见，例如，可从vector biolabs,philadelphia,pa；cellbiolabs,san diego,ca；agilent technologies,santa clara,ca；and addgene,cambridge,ma获得的产品和服务；并且向骨骼肌的基因递送导致治疗性蛋白质的持续表达和全身递送。在一些实施方案中，核酸载体包含ptr-uf-11质粒主链，其是含有aav2 itr的质粒。该质粒可从美国模式培养物保藏所(atccmba-331)商业获得。
[0083]
在一些实施方案中，该方法至少包括向哺乳动物的一只或两只眼施用一定量的本文所述raav颗粒中的一种或多种的步骤；达有效为哺乳动物提供治疗有效量的所选择的治疗剂的时间。
[0084]
在一些实施方案中，所描述的raav和ha的混合或施用是共同施用。在一些实施方案中，raav和ha的施用是相继施用。在一些实施方案中，raav和ha的施用是在混合的预温育期之后进行的。
[0085]
在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物的一只或两只眼经玻璃体内施用(单次或多次)一定量的本文所述的一种或多种raav颗粒的步骤；并达有效为哺乳动物提供治疗有效量的所选择的诊断剂或治疗剂的时间。
[0086]
在一些实施方案中，治疗剂是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是神经营养因子或光遗传学致动器。在一些实施方案中，神经营养因子是bdnf、ngf、神经营养蛋白-3、睫状神经营养因子(cntf)、肝配蛋白和胶质细胞系源神经营养因子(gdnf)或其组合。
[0087]
在一些实施方案中，所述方法的光遗传学致动器是细菌视紫红质、嗜盐菌视紫红质、通道视紫红质、微生物感觉视紫红质、哺乳动物视紫红质、锥视蛋白、视黑蛋白；及其组合。在一些实施方案中，光遗传学致动器是通道视紫红质-2(chr-2)。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗或改善哺乳动物的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的一种或多种症状的方法。在一些实施方案中，该方法至少包括向有此需要的哺乳动物的一只或两只眼施用本文所述raav颗粒中的一种或多种的步骤，其量和时间足以治疗或改善哺乳动物的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的一种或多种症状。
[0088]
在一些实施方案中，本公开提供了用于在哺乳动物(例如，人)的一个或多个感光细胞或一个或多个rpe细胞中表达异源核酸区段的方法。在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物的一只或两只眼施用(例如，直接经玻璃体内施用)本文所述raav颗粒中的一种或多种，其中该多核苷酸进一步包含至少第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含与编码治疗剂
id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10中列出。在一些实施方案中，衣壳蛋白序列包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10。在一些实施方案中，衣壳蛋白序列包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0097]
在一些实施方案中，本文所述的玻璃体内施用方法适合用于递送其表面上具有氨基酸残基的阳离子贴片的任何衣壳并增强其转导能力。在一些实施方案中，衣壳包含aav2、aav6和衍生自aav2和aav6的衣壳。在一些实施方案中，衣壳包含aav7m8、aav-dj、aav2/2-max、aavshh10、aavshh10y、aav3、aav3b、aavlk03、aav7bp2、aav1(e531k)、aav6(d532n)、aav6-3pmut、aav2g9或其元件。
[0098]
在一些实施方案中，aav-dj包括将7个氨基酸插入至aav2衣壳的hspg结合结构域并且在玻璃体内注射后在muller细胞中具有高表达效率。在一些实施方案中，aav7m8衣壳与aav-dj密切相关。在一些实施方案中，aav2/2-max衣壳包含五个点突变，y272f、y444f、y500f、y730f、t491v。在一些实施方案中，aavshh10和aav6(d532n)衣壳是aav6的衍生物。在一些实施方案中，aav6-3pmut是(也称为aav6(tm6)和aav6(y705 y731f t492v))。
[0099]
在一些实施方案中，衣壳包括包含在如seq id no:2所示的野生型aav2衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸取代的衣壳。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代包含y272f、y444f、t491v、y500f、y700f、y704f y730f或其组合。在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:6所示的野生型aav6衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代包括y445f、y705f、y731f、t492v、s663v或其组合中的一种或多种。
[0100]
在一些实施方案中，衣壳包含aav2g9(aav2的变体)。
[0101]
在一些实施方案中，衣壳包含在如seq id no:8所示的野生型aav8衣壳的氨基酸残基533处的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸取代是e533k、y733f或其组合。在一些实施方案中，衣壳包含aav7bp2(aav8的变体)。
[0102]
在一些实施方案中，衣壳包含如seq id no:2所示的野生型aav2衣壳的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，衣壳包含以下中的一种或多种：
[0103]
(a)y444f；
[0104]
(b)y444f y500f y730f；
[0105]
(c)y272f y444f y500f y730f；
[0106]
(d)y444f y500f y730f t491v；或
[0107]
(e)y272f y444f y500f y730f t491v，或在如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9或seq id no:10中分别所示的野生型aav1、aav3、aav4、aav5、aav7、aav9或aav10衣壳蛋白中的任一种中与其对应的等同氨基酸位置处。
[0108]
在一些实施方案中，衣壳包含如seq id no:6所示的野生型aav6衣壳的非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，衣壳包含以下中的一种或多种：
[0109]
(a)y445f；
[0110]
(b)y705f y731f；
[0111]
(c)t492v；
[0112]
(d)y705f y731f t492v；
[0113]
(e)s663v；或
[0114]
(f)s663v t492v。
[0115]
在各种实施方案中，raav颗粒包含以下衣壳之一，即aav2的衣壳变体：dge-df(也称为
‘
v1v4vr-v’)、p2-v2、p2-v3和me-b(y-f t-v)。dge-df衣壳变体含有在野生型aav2 vp1的氨基酸492、493、494、499和500位处的天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸。p2-v2衣壳变体含有在aav2 vp1的263、490、492、499、500和530位处的丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。p2-v3衣壳变体含有在aav2 vp1的263、264、444、451、454、455、459、527、530和531位处的天冬酰胺、丙氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸。me-b(y-f tv)衣壳变体分别含有在aav2 vp1的492、493、494、499和500位处的天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，在aav2 vp1的546-556位处的saagadxaxds(seq id no:5)，以及以下取代：y272f、y444f和t491v。
[0116]
在其他实施方案中，raav颗粒包含选自aav6(3pmut)、aav2(quadyf t-v)或aav2(trpyf)的衣壳。在一些实施方案中，raav颗粒包含在国际专利公开号wo 2018/156654中描述的任何衣壳变体。
[0117]
在一些实施方案中，本文描述了施用ha和raav颗粒用于增强视网膜细胞中的所述raav颗粒的转导的方法，该raav颗粒包含dge-df衣壳、p2-v2衣壳、p2-v3衣壳或me-b(y-f tv)衣壳。在一些实施方案中，所述方法包括施用ha和包含选自以下的衣壳的raav颗粒：aav2(y444f)、aav2(y444f y500f y730f)、aav2(y272f y444f y500f y730f)、aav2(y444f y500f y730f t491v)和aav2(y272f y444f y500f y730f t491v)、aav6(y445f)、aav6(y705f y731f)、aav6(y705f y731f t492v)、aav6(s663v)、aav6(t492v)或aav6(s663v t492v)。
[0118]
在一些实施方案中，本公开的raav多核苷酸或核酸载体可以包含在具有选自aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4的血清型的病毒粒子内、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、aav血清型9或aav血清型10，或病毒领域普通技术人员已知的任何其他血清型内。
[0119]
货物(cargo)
[0120]
在一些实施方案中，本公开进一步提供了raav多核苷酸或核酸载体、病毒粒子、感染性病毒颗粒或宿主细胞的群体或多个raav多核苷酸或核酸载体、病毒粒子、感染性病毒颗粒或宿主细胞，其包含多突变衣壳蛋白和一个或多个核酸区段，该核酸区段包括与编码至少第一诊断和/或第一治疗分子的所选择的多核苷酸可操作地连接的rpe或pr细胞特异性启动子。
[0121]
在一些实施方案中，本公开提供了组合物和制剂，其包括本公开的蛋白质或其生物活性片段、核酸区段或其生物活性片段、病毒多核苷酸或其生物活性片段、核酸载体、宿主细胞或病毒颗粒中的一种或多种连同一种或多种药学上可接受的缓冲液、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括在一种或多种诊断或治疗试剂盒内，其用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍的一种或多种症状。在一些实施方
案中，诊断或治疗试剂盒包括用于将治疗剂递送至哺乳动物眼的感光和/或rpe细胞的试剂盒。
[0122]
在一些实施方案中，本文描述了用于为有此需要的哺乳动物提供诊断或治疗有效量的所选择的治疗剂的方法，该方法包括向有此需要的哺乳动物的细胞、组织或器官提供一定量的所述raav多衣壳突变颗粒或核酸载体中的一种或多种；并且达有效为哺乳动物提供诊断或治疗有效量的所选择的治疗剂的时间。
[0123]
在一些实施方案中，本公开提供了用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物中的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的至少一种或多种症状的方法。在一些实施方案中，该方法至少包括向有此需要的哺乳动物施用所述raav颗粒或核酸载体中的一种或多种的步骤，其量和时间足以诊断、预防、治疗或改善哺乳动物中的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的一个或多个症状。
[0124]
在一些实施方案中，本公开提供了在人眼中转导哺乳动物细胞群，且特别是一个或多个眼部细胞的方法。在一些实施方案中，该方法至少包括将包含有效量的本文所述raav颗粒或核酸载体中的一种或多种的组合物引入群体的一种或多种细胞中的步骤。在一些实施方案中，将所述基因疗法构建体递送至视网膜下的一个或多个细胞，允许感光和rpe细胞的高效转导。
[0125]
在一些实施方案中，本公开提供了编码如本文所述的aav突变体衣壳蛋白中的一种或多种的分离的核酸区段，并提供了包含所述区段的重组核酸载体。
[0126]
在一些实施方案中，本公开提供了组合物以及治疗和/或诊断试剂盒，其包括，与一种或多种额外成分一起配制，或与一种或多种使用说明一起制备的所述的aav颗粒或核酸载体组合物中的一种或多种。
[0127]
在一些实施方案中，本公开提供了包含重组腺相关病毒(aav)载体、病毒粒子、病毒颗粒及其药物制剂的组合物，其可用于递送编码一种或多种有益或治疗产物的遗传物质至哺乳动物细胞和组织的方法。在一些实施方案中，本公开的组合物和方法通过它们在一种或多种哺乳动物疾病的症状的治疗、预防和/或改善中的用途提供了本领域的显著进步。
[0128]
在一些实施方案中，所述方法的raav颗粒另外包括包含异源核酸序列的载体，该异源核酸序列编码与rpe或pr细胞特异性启动子可操作地连接的至少第一诊断剂或其生物活性片段或治疗剂或其生物活性片段，该rpe或pr细胞特异性启动子能够在一个或多个已经用该载体转化的细胞中表达该区段。在一些实施方案中，pr细胞特异性启动子是人视紫红质激酶(hgrk1)、irbp、杆视蛋白、nrl、gnat2e-irbp、l/m视蛋白、锥抑制蛋白启动子、这些中的任一种的生物活性片段或其组合。在一些实施方案中，rpe细胞特异性启动子包含vmd2(best1)或rpe65启动子。
[0129]
在一些实施方案中，本公开的表面暴露的氨基酸修饰的raav颗粒或核酸载体包含一个或多个增强子序列，该增强子序列各自可操作地连接至编码感兴趣的诊断或治疗分子的核酸区段或其生物活性片段。本公开的表面暴露的氨基酸修饰的raav颗粒或核酸载体包含一种或多种增强子序列。在一些实施方案中，增强子序列是cmv增强子、合成增强子、光感受器特异性增强子、视网膜色素上皮细胞特异性增强子、血管特异性增强子、眼特异性增强子增强剂、神经细胞特异性增强剂、视网膜细胞特异性增强剂、这些的生物活性片段，以及其任何组合。
[0130]
在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是光感受器特异性和/或rpe细胞特异性启动子。
[0131]
在一些实施方案中，核酸载体包含转录后调节序列或多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，核酸载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、多腺苷酸化信号序列、内含子/外显子连接/剪接信号或其任何组合。
[0132]
在一些实施方案中，本文所述的货物是本文公开的核酸序列、基因、编码的蛋白质或蛋白质的编码活性片段。
[0133]
在一些实施方案中，改良的raav颗粒包含编码以下的序列：诊断或治疗蛋白质、分子标志物的多肽或生物活性片段、光敏视蛋白、肾上腺素能激动剂、抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、红细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、纺锤素、神经活性肽、神经活性肽受体、神经源性因子、神经源性因子受体、神经纤毛蛋白、神经营养因子、神经营养蛋白、神经营养蛋白受体、n-甲基-d-天冬氨酸拮抗剂、神经丛蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、脑信号蛋白、脑信号蛋白受体、血清素转运蛋白、血清素摄取抑制剂、血清素受体、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白受体、肿瘤抑制物或其任何组合。在一些实施方案中，光敏视蛋白包括视紫红质、视黑蛋白、锥视蛋白、通道视紫红质或细菌、古细菌相关视蛋白、这些中的任一种的生物活性片段或其组合。
[0134]
在一些实施方案中，本公开的raav颗粒包含编码多肽rpe65、bestrophin(best1)、rep1、mertk、sod2、myo6a、mfrp、lrat、kcnj13、鸟氨酸氨基转移酶(oat)、这些中的任一种的生物活性片段或其任何组合的核酸区段。
[0135]
在一些实施方案中，raav颗粒包含编码多肽cntf、gdnf、bdnf、il6、lif、xiap、stat3、这些中的任一种的生物活性片段或其任何组合的核酸区段。
[0136]
在某些实施方案中，raav颗粒包含编码夜盲蛋白(nyx)、代谢型谷氨酸受体6-mglur6(grm6)、瞬时受体电位melastatin1(trpm1)、g蛋白偶联受体179(gpr179)，和g蛋白gβ5,gβ3,ga0
1/2
,gγ13,rgs7,rgs11,r8ap以及其任何组合或肽片段的核酸区段。
[0137]
在一些实施方案中，本文描述了包含至少第一核酸区段的raav核酸载体，该核酸区段编码改变、抑制、减少、预防、消除或损害用感兴趣的载体适当转化的哺乳动物细胞中一种或多种内源性生物过程的活性的一种或多种诊断剂、治疗剂或其生物活性片段。在一些实施方案中，诊断剂、治疗剂或其生物活性片段包含选择性抑制或降低一种或多种代谢过程、功能障碍、病症或疾病的影响的分子。在一些实施方案中，缺陷是由期望治疗的哺乳动物的损伤或创伤引起的。在一些实施方案中，缺陷是由内源性生物化合物的过表达引起的。在一些实施方案中；该缺陷是由一种或多种内源性生物化合物的低表达或缺乏引起的。
[0138]
在一些实施方案中，本公开的raav核酸载体和表达系统包含第二核酸区段，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：改变、改善、调节和/或影响感兴趣的由raav颗粒表达的核苷酸序列的转录的增强子、调节元件、一种或多种转录元件或其任何组合。
[0139]
在一些实施方案中，本公开的raav核酸载体包含第二核酸区段，其包含cmv增强子、合成增强子、细胞特异性增强子、组织特异性增强剂或其任何组合。在一些实施方案中，第二核酸区段进一步包含、基本上由以下组成或由以下组成：一种或多种内含子序列、一种
或多种转录后调节元件或来自视紫红质、视黑蛋白、锥视蛋白、通道视紫红质、细菌或古细菌相关视蛋白、肾上腺素能激动剂，抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、红细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、纺锤素、神经活性肽、神经活性肽受体、神经源性因子、神经源性因子受体、神经纤毛蛋白、神经营养因子、神经营养蛋白、神经营养蛋白受体、n-甲基-d-天冬氨酸拮抗剂、神经丛蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白质脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、脑信号蛋白、脑信号蛋白受体、血清素转运蛋白、血清素摄取抑制剂、血清素受体、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白受体或肿瘤抑制物的一种或多种增强子。在一些实施方案中，第二核酸区段进一步包含、基本上由以下组成或由以下组成：一种或多种内含子序列、一种或多种转录后调节元件，或来自rpe65、bestrophin(best1)、rep1、mertk、sod2、myo6a、mfrp、lrat、kcnj13或鸟氨酸氨基转移酶(oat)的一种或多种增强子。在一些实施方案中，第二核酸区段包含、基本上由以下组成或由以下组成：一种或多种内含子序列、一种或多种转录后调节元件，或来自rpe65、bestrophin(best1)、rep1、mertk、sod2、myo6a、mfrp、lrat、kcnj13、鸟氨酸氨基转移酶(oat)、cntf、gdnf、bdnf、il6、lif、xiap或stat3的一种或多种增强子。
[0140]
在一些实施方案中，raav颗粒包含多核苷酸，其包含、基本上由以下组成或由以下组成：一种或多种多接头、限制性位点和/或多克隆区以促进一种或多种所选择的遗传元件、感兴趣的基因和/或一种或多种治疗或诊断分子在载体内的所选择位点插入(克隆)到raav颗粒中。
[0141]
在一些实施方案中，外源性多核苷酸通过包含本文所述核酸载体的raav颗粒递送到合适的宿主细胞中，该核酸载体是哺乳动物来源的，具有编码例如人、非人灵长类、猪、牛、绵羊、猫、犬、马、石斑鱼(epine)、山羊或羽扇豆来源的一种或多种多肽或肽的多核苷酸。
[0142]
在一些实施方案中，通过所述颗粒或病毒载体递送到宿主细胞中的外源性多核苷酸编码一种或多种蛋白质、一种或多种多肽、一种或多种肽、一种或多种酶，或一种或多种抗体(或其抗原结合片段)、这些中的任一种的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源性多核苷酸表达一种或多种sirna、核酶、反义寡核苷酸、pna分子或其任何组合。在一些实施方案中，从单个raav表达系统产生两种或更多种不同的分子，或者，可以用两种或多种独特的raav表达系统转染所选择的宿主细胞，其中的每一种可以包含一种或多种不同的编码治疗剂的多核苷酸。
[0143]
在一些实施方案中，本文提供了包含在感染性腺相关病毒颗粒或病毒粒子中的raav核酸载体以及多个此类病毒粒子或感染性颗粒。在一些实施方案中，本文公开的载体和病毒粒子与一种或多种稀释剂、缓冲液、生理溶液或药物媒介物以组合物配制用于以一种或多种诊断、治疗和/或预防方案施用至哺乳动物。在一些实施方案中，本公开的载体、病毒颗粒、病毒粒子及其复数以赋形剂制剂提供，该赋形剂制剂对于兽医施用至所选择的家畜、外来动物、驯养动物和伴侣动物(包括宠物等)，以及非人类灵长类、动物学或其他圈养标本是可接受的。
[0144]
在实施方案中，本文描述了重组腺相关病毒病毒粒子(例如，改善转导效率的粒
子)、组合物和宿主细胞，其包含、基本上由或由一种或多种本文所述的raav颗粒，例如用于玻璃体内或视网膜下施用至哺乳动物研究的载体的药物制剂组成。
[0145]
试剂盒
[0146]
在一些实施方案中，本文描述了包含所述raav颗粒或核酸载体中的一种或多种(以及一种或多种病毒粒子、病毒颗粒、转化的宿主细胞或包含此类载体的药物组合物)的试剂盒；并且本公开还提供了在一种或多种治疗、诊断和/或预防临床实施方案中使用此类试剂盒的说明。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种试剂、限制性内切酶、肽、治疗剂、药物化合物或用于将组合物递送至宿主细胞或动物的方法(例如注射器、注射剂等)。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒治疗、预防或改善疾病、缺陷、功能障碍和/或损伤的症状。在一些实施方案中，试剂盒包括用于病毒载体本身大规模生产的组分，诸如用于商业销售或供其他人，包括例如病毒学家、医学专业人员等使用。
[0147]
用途
[0148]
在一些实施方案中，本文描述了本文所述的raav颗粒或载体、病毒粒子、表达系统、组合物和宿主细胞在制备用于诊断、预防、治疗或改善动物中，特别是眼中的疾病、功能障碍、病症、异常状况、缺陷、损伤或创伤的至少一种或多种症状的用途的方法。在一些实施方案中，该方法包括直接向有此需要的哺乳动物的一只或两只眼的玻璃体施用一种或多种所述载体、病毒粒子、病毒颗粒、宿主细胞、组合物或其多种，其量和时间足以诊断、预防、治疗或减轻受影响动物的一只或两只眼中的此类疾病、功能障碍、病症、异常状况、缺陷、损伤或创伤的一种或多种症状。
[0149]
在一些实施方案中，本文描述了包含所述raav颗粒、表达系统、感染性aav颗粒和宿主细胞中的一种或多种的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含至少第一药学上可接受的赋形剂，其用于制备药物和涉及治疗性施用此类raav颗粒或核酸载体的方法。在一些实施方案中，药物制剂适合于玻璃体内施用到人或其他哺乳动物的一只或两只眼中。
[0150]
在一些实施方案中，本文描述了本文所述的颗粒、载体、病毒粒子、表达系统、组合物和宿主细胞在用于治疗或改善症状的方法中或在制备用于治疗或改善哺乳动物眼中的多种缺陷，特别是人感光或rpe细胞中的一种或多种缺陷的症状的药物中的用途。在一些实施方案中，治疗或改善症状的眼的疾病和病症(例如，由pr或pre细胞中的一种或多种遗传缺陷引起)包括视网膜色素变性、leber先天性黑矇、年龄相关性黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、葡萄膜炎、best病、stargardt病、usher综合征、地图状萎缩、糖尿病性视网膜病、视网膜劈裂、色盲、无脉络膜症、bardet biedl综合征、糖原贮积病(眼部表现)或其组合。在一些实施方案中，该方法包括向有次需要的受试者的一只或两只眼玻璃体内或视网膜下施用所述的颗粒载体、病毒粒子、宿主细胞或组合物中的一种或多种，其量和时间足以治疗或改善受影响哺乳动物的此类缺乏的症状。在一些实施方案中，该方法包括防治性治疗怀疑患有此类病症的动物，或在诊断后或症状发作前将此类组合物施用至有发展此类疾患的风险的那些动物。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。
[0151]
贮存和制备缓冲液
[0152]
在一些实施方案中，本文提供了用于贮存和制备本文公开的raav颗粒的缓冲液。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含缓冲溶液。
[0153]
在一些实施方案中，本文描述了用于贮存raav载体或衣壳和ha的混合物的缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液包含浓度为至少约0.05％、0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％重量/体积(w/v)的ha和bss。在一些实施方案中，所述缓冲液包含浓度为至少约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％、1.0％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％重量/体积(w/v)的ha和bss，以及一种或多种以下赋形剂：人工脑脊液(csf)、pbs、林格氏乳酸溶液、tmn200溶液、聚山梨酯20和泊洛沙姆188(商业上称为pluronicf-)和/或其他赋形剂或其组合。
[0154]
在一些实施方案中，缓冲液包含浓度为约0.4％w/v的ha，以及bss、人工csf或pbs中的一种或多种。在一些实施方案中，缓冲液包含浓度为约0.4％w/v的ha，以及bss、人工csf、pbs、林格氏乳酸溶液中的一种或多种；和任选地tmn200溶液、聚山梨酯20(tween 20)和泊洛沙姆188。在一些实施方案中，所述缓冲液包含浓度为约至少0.005％、0.009％、0.01％0.014％、0.02％、0.1％、0.2％0.5％或1％的tween 20和浓度为约0.005％、0.009％、0.01％、0.02％、0.1％、0.2％0.5％或1％的泊洛沙姆100。
[0155]
在一些实施方案中，所述缓冲液基本上由浓度为约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％或1.0％w/v的ha、bss、人工csf、pbs和林格氏乳酸溶液组成。
[0156]
在一些实施方案中，本文描述了用于制备包含ha的raav颗粒的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可以用于在包装和配制为最终产品之前立即从亲和柱洗脱aav衣壳。在一些实施方案中，缓冲剂防止具有表面暴露的阳离子贴片的aav衣壳在制备过程中聚集。在一些实施方案中，缓冲液包含低于7的ph。在一些实施方案中，缓冲液包含低于5的ph。在一些实施方案中，缓冲液是酸性的。在一些实施方案中，缓冲液是碱性的。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物是酸性的。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物是碱性的。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物是中性的。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的ph。
[0157]
在一些实施方案中，缓冲液包含浓度为0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.75％或1.0％w/v的ha。
[0158]
在一些实施方案中，本文描述了制备raav颗粒的方法，包括纯化aav衣壳，其中衣壳从含有选自aav-x或avb亲和树脂的树脂或本领域已知的另一种树脂的亲和柱洗脱。
[0159]
raav颗粒
[0160]
本公开的方面涉及用于递送一种或多种核酸载体至各种组织、器官和/或细胞中的重组腺相关病毒(raav)颗粒或此类颗粒的制剂，该核酸载体包含编码rep蛋白和/或感兴趣的蛋白或多肽的序列。在一些实施方案中，如本文所述在rep蛋白存在下将raav颗粒递送至宿主细胞。
[0161]
重组腺相关病毒(raav)载体已经成功用于大量人疾病的临床前动物模型中的体内基因转移，并已经成功用于多种治疗剂的长期表达。当靶向免疫豁免(immune-privileged)部位，例如，用于leber先天性黑矇的眼部递送时，aav载体还已经在人类中产生了长期的临床益处。该载体的优点是其相对低的免疫特性，仅引发有限的炎症反应，并且在某些情况下，甚至可以引导对转基因产物的免疫抗性。尽管如此，当靶向非免疫豁免器官
时，由于针对病毒衣壳的抗体和cd8

t细胞应答，治疗效率在人中受到限制，而在动物模型中，也报道了对转基因产物的适应性反应。
[0162]
腺相关病毒(aav)由于其效率、持久性和低免疫原性而被用于眼部基因疗法。识别能够通过玻璃体转导pr的载体历来依赖于识别哪些血清型在局部递送后对该细胞类型具有天然向性。在视网膜下注射后，已经使用几种血清型成功地将转基因靶向pr(包括例如aav2、aav5和aav8)，所有三种血清型在跨多种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、狗、猪和非人类灵长类)进行的实验中显示出功效。
[0163]
在一些实施方案中，aav2和aav8载体包含表面暴露的酪氨酸残基的点突变(酪氨酸到苯丙氨酸，y-f)展示在视网膜下和玻璃体内注射后相对于未修饰的载体增加视网膜细胞类型中的转基因表达。在一些实施方案中，aav2包含三重突变体(称为“三重y
→
f”)。在一些实施方案中，aav2包含四重突变体(“四重y
→
f”)。在一些实施方案中，aav包括将表面暴露的苏氨酸(t)或丝氨酸(s)残基定向诱变为在这些氨基酸中的一个或多个处的非天然氨基酸。在一些实施方案中，aav包含y
→
f和/或t
→
v/t
→
a突变。
[0164]
在一些实施方案中，raav是本文所述的raav。
[0165]
在一些实施方案中，raav核酸载体包含单链(ss)或自身互补(sc)aav核酸载体，诸如单链或自身互补重组病毒基因组。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。
[0166]
野生型aav基因组是正义或负义的单链脱氧核糖核酸(ssdna)。基因组包含两个反向末端重复(itr)，在dna链的每个末端各一个，两个开放阅读框(orf)：itr之间的rep和cap，以及位于itr之间并任选地包含转基因的插入核酸。rep orf包含四个重叠的基因，其编码aav生命周期所要求的rep蛋白。cap orf包含编码衣壳蛋白的重叠基因：vp1、vp2和vp3，它们相互作用形成病毒衣壳。vp1、vp2和vp3翻译自一个mrna转录物，其可以以两种不同的方式剪接：可以切除较长或较短的内含子，从而形成两种mrna亚型：a约2.3kb和约2.6kb长的mrna同种型。衣壳使约60个单独的衣壳蛋白亚基的超分子组装形成能够保护aav基因组的无包膜t-1二十面体晶格。成熟衣壳以约1:1:10的比率由vp1、vp2和vp3(分子量分别为约87、73和62kda)组成。
[0167]
重组aav(raav)颗粒可以包含核酸载体，其可以至少包含：(a)包含编码感兴趣的蛋白质或多肽或感兴趣的rna(例如，sirna或microrna)的序列的一个或多个转基因，或包含编码rep蛋白的序列的一个或多个核酸区域；以及(b)包含位于一个或多个异源核酸区域(例如转基因)的两侧的反向末端重复(itr)序列的一个或多个区域。在一些实施方案中，核酸载体的大小在4kb和5kb之间(例如，大小为4.2至4.7kb)。在一些实施方案中，核酸载体进一步包含编码如本文所述的rep蛋白的区域。本文所述的任何核酸载体可以由病毒衣壳诸如aav6衣壳或另一种血清型(例如，与itr序列具有相同血清型的血清型)封装，其可以包含如本文所述的修饰的衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸载体是环状的。在一些实施方案中，核酸载体是单链的。在一些实施方案中，核酸载体是双链的。在一些实施方案中，双链核酸载体可以是，例如自身互补载体，其含有与核酸载体的另一区域互补的核酸载体区域，引发核酸载体双链的形成。
[0168]
因此，在一些实施方案中，raav颗粒或含有此类颗粒的raav制剂包含病毒衣壳和如本文所述的核酸载体，其由病毒衣壳封装。在一些实施方案中，核酸载体的插入核酸包含
(1)一个或多个转基因，其包含编码感兴趣的蛋白质或多肽的序列，(2)一个或多个核酸区域，其包含促进转基因表达的序列(例如，启动子)，和(3)一个或多个核酸区域，其包含促进转基因整合到受试者基因组中的序列(任选地与包含促进表达的序列的一个或多个核酸区域)。
[0169]
辅助质粒
[0170]
在一些实施方案中，含有本文公开的核酸载体序列的质粒与一种或多种辅助质粒(例如，含有rep基因(例如，编码rep78、rep68、rep52和rep40)和cap基因(编码vp1、vp2和vp3，包括如本文所述的修饰的vp3区))组合。在一些实施方案中，将辅助质粒转染至生产者细胞系中，以便可以包装raav颗粒并随后将其纯化。
[0171]
在一些实施方案中，一个或多个辅助质粒包括包含rep基因和cap基因的第一辅助质粒和/或包含e1a基因、e1b基因、e4基因、e2a基因、va基因或其组合的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是衍生自aav2的rep基因。在一些实施方案中，cap基因衍生自aav2。在一些实施方案中，cap基因包括对该基因的修饰以产生本文所述的修饰的衣壳蛋白。在某些实施方案中，rep基因包含rep78、rep68、rep52或rep40。在某些实施方案中，cap基因包含vp1、vp2、vp3或其变体。在一些实施方案中，辅助质粒包含pdm、pdg、pdp1rs、pdp2rs、pdp3rs、pdp4rs、pdp5rs、pdp6rs、pdg(r484e/r585e)或pdp8.ape质粒。
[0172]
产生
[0173]
在一些实施方案中，本文描述了raav颗粒产生的方法。在一些实施方案中，产生或获得一种或多种辅助质粒。在一些实施方案中，一种或多种辅助质粒包含用于期望的aav血清型和腺病毒va、e2a(dbp)和e4基因的rep和cap orf。在一些实施方案中，用于期望的aav血清型和腺病毒va、e2a(dbp)和e4基因的rep和cap orf在其天然启动子的转录控制下。在一些实施方案中，cap orf包含一种或多种修饰以产生如本文所述的修饰的衣壳蛋白。在一些实施方案中，用辅助质粒和含有本文所述核酸载体的质粒通过capo4介导的转染、脂质或聚合分子诸如聚乙烯亚胺(pei)来转染hek293细胞(可从获得)。在一些实施方案中，将hek293细胞温育至少约60小时以允许raav颗粒产生。在一些实施方案中，用含有核酸载体的单一重组杆状病毒感染基于sf9的生产者稳定细胞系。在一些实施方案中，用含有核酸载体和任选地一种或多种辅助hsv的hsv感染hek293或bhk细胞系。在一些实施方案中，辅助hsv含有如本文所述的rep和cap orf以及在其天然启动子的转录控制下的腺病毒va、e2a(dbp)和e4基因。在一些实施方案中，然后将hek293、bhk或sf9细胞温育至少60小时以允许raav颗粒产生。在一些实施方案中，纯化raav颗粒。在一些实施方案中，通过碘克沙醇阶梯梯度、cscl梯度、色谱法或聚乙二醇(peg)沉淀来纯化raav颗粒。
[0174]
改良的raav递送的试剂盒和用途
[0175]
在一些实施方案中，本文描述了包含在用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍的一种或多种症状的试剂盒内的raav颗粒和透明质酸的混合物。在一些实施方案中，试剂盒可用于诊断、防治和/或疗法，以及如本文所讨论的哺乳动物眼中的一种或多种缺陷的治疗、预防和/或改善。在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒可以包含单位剂量形式的药物组合物。在一些实施方案中，方法可以包括制备本文公开的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个容器、瓶或安瓿。在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明。
[0176]
在一些实施方案中，本文描述了包括本文所述的缓冲剂和组合物在制备用于治疗、预防或改善疾病、病症、功能障碍、损伤或创伤的症状，包括治疗、预防和/或防治疾病、病症或功能障碍，和/或改善此类疾病、病症或功能障碍的一种或多种症状的药物中的用途的方法。
[0177]
在一些实施方案中，本文描述了用于治疗或改善哺乳动物和人的一只或两只眼中的此类疾病、损伤、病症或功能障碍的症状的方法。在一些实施方案中，该方法包括至少向有此需要的哺乳动物施用如本文所述的raav颗粒中的一种或多种，其量和时间足以治疗或改善哺乳动物的一只或两只眼中的此类疾病、损伤、病症或功能障碍的症状的步骤。在一些实施方案中，
[0178]
包含raav颗粒的药物组合物
[0179]
在一些实施方案中，本文所述的改良的raav递送方法允许递送较小滴度的病毒颗粒，以实现与使用较高水平的常规raav方法获得的相同的转导效率。在一些实施方案中，该方法包括包含单次施用的治疗有效量的所述组合物的施用。在一些实施方案中，该方法包括单次注射足够数量的感染性颗粒以向进行此类治疗的患者提供治疗益处。在一些实施方案中，该方法包括在相对较短或相对延长的时期内多次或连续施用aav载体组合物。在一些实施方案中，施用至受试者的感染性颗粒的数量是至少约101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或甚至更高的感染性颗粒/ml。在一些实施方案中，按照可能要求的，感染性颗粒作为单一剂量(或分成两次或更多次施用等)给予以实现对所治疗的特定疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，该方法包括单独或联合一种或多种其他诊断剂、药物、生物活性剂施用两种或更多种不同的基于raav颗粒或载体的组合物，以实现特定方案或疗法的期望效果。在一些实施方案中，与aav衣壳未经ha预处理或不与ha共同施用时所要求的传染性颗粒滴度相比，当实施所述的用ha预处理和与ha共同施用aav衣壳的方法时将需要较低滴度的传染性颗粒。在一些实施方案中，衣壳序列包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，衣壳序列包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9或seq id no:10。在一些实施方案中，raav颗粒不包含在嵌合病毒/非病毒纳米颗粒中。
[0180]
在一些实施方案中，raav颗粒包含在一种或多种启动子控制下的编码治疗剂的核酸区段。在一些实施方案中，为了使序列“处于”启动子的“控制之下”，人们通常将转录阅读框的转录起始位点的5’端定位在所选启动子的“下游”约1至约50个核苷酸之间。在一些实施方案中，“上游”启动子刺激dna转录并促进所编码多肽的表达。在一些实施方案中，重组载体构建体是包括衣壳蛋白修饰的raav载体的那些，该载体含有rpe细胞或感光细胞特异性启动子，其可操作地连接至编码一种或多种诊断和/或治疗剂的至少一个核酸区段。
[0181]
在一些实施方案中，该方法包括将一种或多种外源性蛋白质、多肽、肽、核酶和/或反义寡核苷酸引入用载体转染的特定细胞。在一些实施方案中，使用本文所述的raav颗粒以将一种或多种外源性多核苷酸递送至所选择的宿主细胞，例如，递送至哺乳动物眼内的一种或多种所选择的细胞。
[0182]
在一些实施方案中，施用至受试者的病毒颗粒的数量可以在近似于至少约101至10
20
个颗粒/ml或103至10
15
个颗粒/ml的范围内，或在任一范围之间的任何值，诸如例如，约101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14 10
15
、10
16
、10
17
、10
18
、10
19
或10
20
个颗粒/ml。在一些实施方案中，可以施用高于10
13
个颗粒/ml的病毒颗粒。在一些实施方案中，施用至受试者的病毒颗粒的数量可以在近似于至少约106至10
14
载体基因组(vg)/ml或103至10
15
vg/ml的范围内，或者在任一范围之间的任何值。在一些实施方案中，施用至受试者的病毒颗粒的数量可以是近似于约101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
vg/ml。在一些实施方案中，施用高于10
13
vg/ml的病毒颗粒。在一些实施方案中，病毒颗粒作为单剂量施用。在一些实施方案中，按照可能要求的将病毒颗粒分成两次或更多次施用，以实现对所治疗的特定疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，将0.0001ml至10ml，例如0.001ml、0.01ml、0.1ml、1ml、2ml、5ml或10ml递送给受试者。
[0183]
在一些实施方案中，本文描述了本文所述的一种或多种基于病毒的组合物在药学上可接受的溶液中的制剂，其用于单独或联合一种或多种其他治疗方式施用至细胞或动物，并且在特别是用于治疗影响受试者的人细胞、组织和疾病。
[0184]
在一些实施方案中，本文所述的raav颗粒也联合其他药剂施用，该其他药剂诸如，例如蛋白质或多肽或各种药学活性剂，包括一种或多种全身或局部施用的治疗性多肽、生物活性片段或其变体。在一些实施方案中，组合物可以从宿主细胞或其他生物来源中纯化，或者可替代地可以如本文所述化学合成。
[0185]
在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的缓冲液、赋形剂或载体溶液。在一些实施方案中，配制组合物用于口服、肠胃外、玻璃体内、眼内、静脉内、鼻内、局部、关节内、肌内施用或其组合。
[0186]
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；或防腐剂。
[0187]
在一些实施方案中，这些制剂包含至少约0.1％的治疗剂(例如，raav颗粒)或更多。在一些实施方案中，活性成分的百分比在总制剂的重量或体积的至少约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％或2％和约70％或80％或更多之间。
[0188]
在一些实施方案中，术语“赋形剂”是指与raav颗粒一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。在一些实施方案中，药物赋形剂包含无菌液体，诸如水或油，包括石油诸如矿物油、植物油诸如花生油、大豆油或芝麻油、动物油或合成来源的油的那些。在一些实施方案中，液体载体包括盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液或其组合。在一些实施方案中，赋形剂和媒介物包括ha、bss、人工csf、pbs、林格氏乳酸溶液、tmn200溶液、聚山梨酯20、泊洛沙姆100或其组合。
[0189]
在一些实施方案中，治疗有效量的组合物的施用包括单次施用，诸如例如单次注射足够数量的病毒颗粒以向进行这种治疗的患者提供治疗益处。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物的施用包括组合物在相对较短或相对较长的时间段内的多次或连续施用，这可以由监督此类组合物施用的医生确定。
[0190]
在一些实施方案中，组合物包含单独或联合一种或多种额外的活性成分(其可以
从天然或重组来源获得或化学合成)的raav颗粒或核酸载体。
实施例
[0191]
实施例1-体外实验
[0192]
试图确定含有表面暴露的衣壳残基的阳离子贴片的aav衣壳(即aav2和aav6)是否在与ha预温育后表现出增强的hek293t(人)和661w细胞(鼠锥衍生的感光细胞系)转导。
[0193]
将aav2衣壳与以3:1(aav:)的比率预温育，然后以2000的感染复数(moi)注射到细胞中。对照包括未感染的细胞和单独用aav载体感染的细胞。图2a中aav介导的mcherry报告物表达数据表明，在与ha预温育后(在感染前5分钟、15分钟和1小时)，ha增加了体外施用raav2颗粒后661w细胞的转导。
[0194]
aav6衣壳含有带正电荷的残基的贴片，类似于aav2。两种血清型在与ha预温育后都显示出转导的改善。如图3所示，与aav2一样，在施用以5000至10,000的感染复数(moi)注射的基于自身互补raav6的载体后，ha预处理和共同施用增加了体外hek293t细胞中mcherry报告物(在普遍存在的cba启动子的控制下)的转导。对于该实验，评估了在ha预温育存在和不存在的情况下衣壳变体aav6(d532n)和aav6-3pmut的转导效率。
[0195]
相比之下，在衣壳表面上具有均匀负电荷的aav5未能表现出增强的转导(参见图2和3)。
[0196]
接下来，确立了ha介导的转导增强不依赖于与cd44细胞表面受体的结合。首先，通过免疫细胞化学证实了hek293t和661w没有表现出cd44的表达(参见图4)，但是arpe19细胞(已知表达cd44的人rpe细胞系)表现出cd44表达。
[0197]
当在arpe19细胞中进行与hek293中基于aav6的衣壳进行的类似实验时，显示用ha预处理aav降低转导。这种抑制通过用透明质酸酶消化ha来克服，所述透明质酸酶会减少ha的侧链长度，使其不再被cd44识别。
[0198]
如上所述，aav2与ha的预温育抑制arpe19细胞的转导，并且arpe19细胞表达cd44。然而，aav2与已用透明质酸酶消化的ha预温育增强arpe19细胞的转导。当透明质酸酶切割ha时，产生的缩短的多联体通常为50-100个单体长(分子量为20-40kda)。ha对cd44的亲和力随着分子量的降低而显著降低，特别是在20kda分子量标记附近(单价相互作用相对于二价相互作用)。
[0199]
接下来，询问ha包被的aav2是否仍然识别视网膜的玻璃体内转导所需的细胞识别和内化事件所要求的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)受体足迹。为了评估这一点，将ha与aav2温育，然后评估与肝素的结合，所述肝素是已确立的hspg替代物质。如图5所描绘的洗脱谱所示，ha处理没有改变与肝素的结合。ha包被的aav2的肝素亲和力与单独的aav2没有显著差异，表明ha介导的转导增强对aav衣壳的规范hspg结合几乎无或无影响。
[0200]
总之，结果表明ha介导的转导改善不是cd44依赖性的。
[0201]
实施例2-体内实验
[0202]
然后确定了与单独的病毒相比，几种基于aav2的衣壳变体与ha的预温育是否促进了经玻璃体内注射的小鼠中增强的视网膜转导(参见图6a-6b)。在注射30分钟内将10μl病毒衣壳(2x10
12
载体基因组拷贝(vg)/ml)与10μl(分子量为5百万kda)混合。仅病毒
对照由10μl病毒(2x10
12 vg/ml)与10μl平衡盐溶液(bss) tween 20混合组成。最终载体浓度为1x10
12
vg/ml。对4周龄nrl-gfp小鼠进行玻璃体内注射，并在注射后两周和四周采集眼底图像。测试了四种衣壳——所有保留阳离子表面暴露贴片的aav2的变体。这些衣壳在本领域中称为“dge-df”、“p2-v2”、“p2-v3”和“me-b(y-f tv)”(参见国际专利公开号wo2018/156654)。增益和积分设置在所有图像中是一致的(参见图7a-7b、8a-8b、9a-9b和10a-10b)。
[0203]
注射后五周，进行视网膜电图(erg)和facs分析。使用流式细胞仪通过测量mcherry表达来分析视网膜细胞的转导，并使用未注射的眼的整个视网膜进行门控。对于dge-df在图7a-7c中、p2-v2在图8a-8c中、p2-v3在图9a-9c中以及me-b(y-f t-v)在图10a-10c中显示了注射后2周和4周的眼底图像，以及这些图像中信号的聚合流式细胞术量化。聚合了所有四种衣壳的流式细胞术数据并如图11所示。
[0204]
四种衣壳变体中的每一种在与ha预温育后都表现出改善的视网膜转导。还证实，如通过erg数据评估的，衣壳经ha预处理和与ha共同施用对玻璃体内递送后的视网膜功能没有显著影响(参见图12a-12e)。用ha处理后，杆细胞和锥细胞中a波和b波的振幅没有显著程度的变化。
[0205]
总而言之，结果表明用ha预处理和与ha共同施用提高了具有表面暴露的阳离子贴片的几种不同衣壳类型的体内转导效率。用ha预处理代表了一种强大的新方法，其用于改善aav转导，并降低实现期望转导所需的这些aav滴度，而不修饰衣壳本身的残基。
[0206]
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且根据其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员并且将包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以相同的程度通过引用并入本文，就像每篇参考文献单独且具体地表明通过引用并入并在本文中列出整体一样。除非在本文中另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在充当单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入说明书中，就像它在本文中单独列举一样。
[0207]
根据本公开，可以制备和执行本文描述和要求保护的所有组合物和方法而不用过度实验。尽管已经根据优选实施方案描述了组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以将变化应用于组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序中而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将显而易见的是，某些化学和/或生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员而言显而易见的所有此类类似的替代和修改都视为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。