一种六妹羊肚菌黔MS311及其应用的制作方法

一种六妹羊肚菌黔ms311及其应用
技术领域
1.本发明属于食用菌领域，具体涉及一种六妹羊肚菌菌株；还涉及该六妹羊肚菌菌株的用途。


背景技术：

2.羊肚菌(morchella)属于羊肚菌科羊肚菌属，因其菌盖酷似羊肚而得名，是一种珍贵的药食兼用菌。羊肚菌多生长在阔叶林或针阔混交林的腐殖质层上，在世界各地均有分布；我国28个省、市、自治区也均有羊肚菌分布。羊肚菌不仅其味道鲜美，口味独特，而且营养价值丰富，蛋白质含量高，富含人体必需氨基酸和维生素、微量元素与碳水化合物，脂肪酸种类也十分丰富。羊肚菌子实体还可以入药，据《中华本草》记载，羊肚菌性平，味甘寒，无毒；有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾、补脑提神等功效；羊肚菌含抑制肿瘤的多糖，抗菌、抗病毒等活性成分，具有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等作用，在欧美等国家一直作为人体营养的高级补品。
3.六妹羊肚菌(morchella sextelata)属于羊肚菌科羊肚菌属的一个种，是我国主要的羊肚菌栽培种类。目前六妹羊肚菌生产中存在的主要问题是：(1)栽培品种少；(2)栽培周期长，栽培周期一般在120天左右；(3)农法季节性栽培受环境影响大，较长的季节性栽培周期意味着面临更多的气候风险，造成生产的不稳定。而培育抗逆性强、性状稳定、出菇快、产量高的六妹羊肚菌是解决上述问题的有效途径。
4.我国从南到北的广大原始森林中具有丰富的野生食用菌资源，其中包括野生羊肚菌资源。对野生的羊肚菌资源进行开发驯化，不仅可以丰富人们的餐桌，满足人们高水平生活的需要；同时利用其药食兼用的特性，还可以开发出附加值更高的食品、饮料和保健品等，在提高人们养生和健康水平的同时，增加菇农收入和出口创汇。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种六妹羊肚菌菌株。
6.本发明另一目的在于提供上述六妹羊肚菌菌株的用途。
7.本发明的目的通过如下技术方案实现：
8.本发明一种六妹羊肚菌(morchella sextelata)菌株黔ms311，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20211230，保藏日期为2021年9月28日。
9.本发明还提供上述菌株黔ms311在食品或保健品中的应用。
10.本发明还提供一种食品或保健品，所述的食品或保健品中含有上述菌株黔ms311或黔ms311的提取物。
11.本发明还提供上述菌株黔ms311在饮料中的应用。
12.本发明还提供一种饮料，所述的饮料中含有上述菌株黔ms311或黔ms311的提取物。
13.本发明还提供上述菌株黔ms311在制备提高免疫力药物上的应用。
14.本发明还提供一种基因工程六妹羊肚菌，所述的基因工程六妹羊肚菌的出发菌株为上述菌株黔ms311。
15.用于鉴定上述菌株黔ms311的分子标记，所述的分子标记是指一个长度为712bp的dna分子片段；所述的dna分子片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。
16.上述分子标记，所述的分子标记的pcr扩增引物由its1和its4组成；所述的引物序列如下：
17.its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；
18.its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
19.上述分子标记在菌株黔ms311真实性或侵权鉴定上的应用。
20.上述六妹羊肚菌菌株黔ms311的栽培方法，包括如下步骤：
21.(1)母种培养：用灭菌冷却后的接种钩将5mm
×
5mm的黔ms311菌种块接种于母种培养基平板中央，然后在温度为22℃、空气相对湿度为60～75％、避光条件下培养8天，菌丝长满平板，得黔ms311母种；
22.(2)原种培养：用灭菌冷却后的菌种铲按照1:30的质量比挖取步骤(1)中所得的黔ms311母种，然后接种于原种培养基上，在温度20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，得黔ms311原种；
23.(3)栽培种培养：用灭菌冷却后的菌种铲按照1:30的质量比挖取步骤(2)中所得黔ms311原种，然后接种于栽培种培养基上培养，在温度20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，得黔ms311栽培种；
24.(4)开畦播种与覆膜：选择ph6～6.5、土质较细的温室大棚内耕地，清除杂草后翻耕土壤，播种前开畦，畦面宽80～100cm，畦之间留50cm的走道，土壤含水量为40～45％；将步骤(3)所得的黔ms311栽培种按照每袋兑入拌种剂30ml搅拌均匀，将菌种掰碎成小颗粒后均匀撒播到畦面，每亩播种黔ms311栽培种500袋，播种后立刻均匀覆盖一层薄土，覆土后盖上黑色聚丙烯膜；
25.(5)菌丝培养与摆放营养袋：羊肚菌播种后，控制棚内气温在15～20℃，空气相对湿度60～70％，土壤含水量40～45％，光照强度50～100lux条件下8～10天，菌丝长满畦面形成白色“菌霜”，掀开黑色聚丙烯膜；放置营养袋，每个营养袋打40～60个小孔，打孔面紧贴畦面土壤，每亩地均匀摆放营养袋1800个，营养袋摆放完成后重新覆上黑色聚丙烯膜；营养袋在大田摆放40～45天，然后撤除营养袋，并撤除黑色聚丙烯膜；
26.(6)原基分化：喷洒水使土壤含水量达到45～55％；在子实体生长阶段，控制棚内温度10～20℃、空气相对湿度75～85％、光照强度200～300lux，棚内自然通风，诱导原基形成，喷水后7天形成大量原基，形成原基后7～10天形成1～2cm的幼菇；
27.(7)出菇管理和采收：控制棚内气温在10～20℃、空气相对湿度70～80％、土壤含水量40～45％、光照强度500～1000lux、二氧化碳浓度500-700ppm，高温时利用喷雾、侧窗通风措施降温；从原基发生到子实体成熟为25～30天；当子实体不再增大，菌盖脊与凹坑分明，子囊果部分已基本展开，即为成熟，采收即可。
28.上述栽培方法步骤(1)中所述的母种培养基的组成成分及其比例为：去皮马铃薯200g取汁，葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用纯净水定容至
1000ml。
29.所述的母种培养基的制备方法：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800ml纯净水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用纯净水定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。
30.上述方法步骤(2)中所述的原种培养基或步骤(3)中所述的栽培种培养基的组成成分及其重量百分比为：小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，培养基含水量为60～65％。
31.上述栽培方法步骤(2)中所述的原种培养基或步骤(3)中所述的栽培种培养基的制备方法：按重量百分比取小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，混合均匀，然后按照比例加水，搅拌均匀，装入聚丙烯袋(规格16cm
×
35cm
×
0.005cm)，用聚丙烯绳扎口，121℃灭菌2小时，备用。
32.上述栽培方法步骤(4)中所述的拌种剂的组成成分及其重量比为：硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸锌0.01g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖1g，水1000ml。
33.所述拌种剂的制备方法，按照比例将各组分加入水中，搅拌均匀即可。
34.上述栽培方法步骤(5)中所述的营养袋的组成成分及其重量百分比为：小麦90％，谷壳9％，生石灰1％，含水量60～65％。
35.所述的营养袋的制备方法：按照重量百分比将小麦90％，谷壳9％，生石灰1％，混合均匀，然后按照比例加水，搅拌均匀，得营养料；将混匀的营养料装入聚丙烯袋(规格12cm
×
24cm
×
0.005cm)中，用聚丙烯绳扎口，得营养袋；121℃灭菌1小时，再冷却至常温；备用。
36.本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明菌株黔ms311的子囊果(子实体菌盖)浅褐色，菇形好，商品价值高，为消费者提供了一种新的羊肚菌类型。(2)本发明菌株黔ms311产量高。黔ms311农业式栽培每亩平均产量为501kg，而国家认定的六妹羊肚菌品种川羊肚菌6号的亩均产量仅为185kg，黔ms311的亩产量是川羊肚菌6号的2倍多。(3)黔ms311栽培周期短。本发明菌株黔ms311从播种到出菇采收的周期为100～110天，比通常的六妹羊肚菌栽培周期的120天左右缩短了10～15天。(4)因其含有能提高人体免疫力的多糖等物质，具有药食兼用特性，除了直接烹制食用外，黔ms311还可以作为原料加工成附加值更高的食品、饮料或保健品，应用前景十分广阔，可大大增加菇农的收入且可出口创汇。(5)本发明分子标记对菌株黔ms311特异性强，检测结果准确、可靠；并且方法简单，检测速度快，适于在真实性和侵权鉴定中对菌株黔ms311进行现场实时、快速检测。
37.生物保藏：本发明六妹羊肚菌(morchella sextelata)菌株黔ms311是本发明人在贵州省毕节市七星关区采集，并经筛选、培育而成。该菌株已于保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：地址中国武汉武汉大学；保藏编号为cctcc no:m20211230，保藏日期为2021年9月28日。
附图说明:
38.图1.本发明菌株黔ms311的子实体照片。
39.图2.本发明菌株黔ms311的系统发育树图。
40.图3.采用rapd引物s484扩增的不同六妹羊肚菌菌种的rapd电泳图谱。其中m为dna分子量标准；1为黔ms311；2为g8；3为gyh。
具体实施方式
41.以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。
42.实施例1本发明菌株黔ms311的采集、分离驯化过程：
43.2017年4月，本发明人在贵州省毕节市七星关地区，发现并采集到一个野生羊肚菌子实体。将该野生羊肚菌的子实体组织分离，得到菌丝(菌种)；然后将组织分离后的菌种进行栽培出菇试验，再对朵型良好的子实体进行菌种分离，接种于pda培养基上进行培养，筛选菌丝生长速度快，长势均匀的菌株，继续栽培驯化，经过数代培养，筛选出一个子囊果(子实体菌盖)浅褐色、产量高、出菇整齐、出菇周期短的羊肚菌，命名为：黔ms311。
44.实施例2本发明菌株黔ms311的分类鉴定：
45.(1)黔ms311的形态学鉴定：
46.子囊果(子实体菌盖)浅褐色，子实体高6～14cm，子囊果长4～10cm，粗2～4cm，圆锥形，顶部钝，下部边缘与菌柄链接，子囊果纵棱发达，纵棱12～18条，横棱较浅，棱上遍布短绒毛，横纵棱纹交叉形成坑，幼嫩时脊较扁平，成熟时变锐；菌柄长2～6cm，粗2.5～4cm，白色，圆柱形，中空；子囊呈柱状，每个子囊含八个孢子，单纵排列。根据《羊肚菌生物学与栽培技术》(刘伟、张亚等，吉林科学技术出版社，2017)中第64页有关六妹羊肚菌的相应形态特征特征描述及照片，黔ms311与六妹羊肚菌的形态特征一致，初步将菌株黔ms311的鉴定分类为六妹羊肚菌种(morchella sextelata)。
47.(2)黔ms311分子生物学分类鉴定
48.采用新型植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)提取黔ms311菌株的基因组dna，并以提取的基因组dna为底物、以its1和its4为引物进行pcr扩增。所述的引物序列如下：
49.its1：5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；
50.its4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
51.its-pcr反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg
2
)2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl dna聚合酶0.2μl，0.2μm引物各0.5μl，加双蒸水至20μl。its-pcr反应条件为：预变性94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃75s，30个循环；72℃延伸10min。将所得pcr扩增产物进行凝胶电泳，结果所得pcr扩增产物为长度为712bp的dna分子片段；将该dna分子片段送交上海生工进行测序，结果该dna分子片段的核苷酸序列(its序列)如seq id no：1所示。将该dna分子片段的核苷酸序列在genebank中进行blast比对，结果黔ms311菌株的its序列与六妹羊肚菌(morchella sextelata)的its序列相似度最高，其相似度最高可达99.86％，说明本发明菌株黔ms311在分类上属于羊肚菌属六妹羊肚菌(morchella sextelata)。构建黔ms311的系统发育树图，结果(见图2)从系统发育树图可以看出，本发明菌株黔ms311属于羊肚菌属六妹羊肚菌(morchella sextelata)。此外，从blast对比结果可知，本发明菌株黔ms311与任何已知的羊肚菌的菌株不同，说明本发明菌株黔ms311是一种新的六妹羊肚菌菌株。
52.实施例3本发明菌株黔ms311与其他六妹羊肚菌的rapd对比鉴定试验
53.按照如下方法进行：
54.采用新型植物基因组dna提取试剂盒cw0531(北京康为世纪公司)分别提取黔ms311、g8(贵州乐丰公司生产的六妹羊肚菌)、gyh(甘肃临夏地区采集的人工栽培的六妹羊
肚菌)3个菌株的基因组dna，选取20条rapd引物(见表1)进行pcr扩增。所述的随机引物序列如下：
55.表1 rapd随机引物序列
56.引物名称引物序列5
’‑3’
引物名称引物序列5
’‑3’
s01tgatccctggs75gacggatcags03gtagacccgts76cacactccags08agtcagccacs86gtgcctaaccs12ccttgacgcas119ctgaccagccs18ccacaccagts159acggcgtatgs22tgccgagctgs161acctggacacs24aatcgggctgs172agagggcacas31cacactccags240cagcatggtcs38ctgacgtcacs242ctgaggtctcs47ctgcatcgtgs484agtgcgctga
57.rapd-pcr扩增反应体系为：总体积20μl：20-50ng/μl的dna模板1μl，10
×
buffer(with mg2 )2μl，2.5mm dntp 0.5μl，5u/μl easytaq酶0.2μl，0.2μm引物1μl，加双蒸水至20μl。rapd-pcr反应条件为：预变性95℃5min；94℃45s，36℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
58.结果(见图3)从以s484为引物扩增的rapd电泳图谱可以看出，本发明菌株黔ms311与六妹羊肚菌菌株g8、gyh之间均存在具有明显差异的特异性条带(白色箭头处)，说明本发明菌株黔ms311与其他六妹羊肚菌菌株g8和gyh不同，是一种新的六妹羊肚菌(morchella sextelata)菌株。
59.实施例4本发明菌株黔ms311的栽培试验
60.按照如下步骤进行：
61.(1)母种培养：用灭菌冷却后的接种钩将5mm
×
5mm的黔ms311菌种(本菌种已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20211230)接种于母种培养基平板中央，在温度为22℃、空气相对湿度为60～75％、避光条件下培养8天，菌丝长满平板，此时平板形成大量菌核，得黔ms311母种；所述母种培养基的制备方法：将马铃薯200g去皮切成1.5cm左右方块，放入800ml纯净水中煮沸20min，3层纱布过滤取浸提液，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，混匀后用纯净水定容至1000ml，121℃灭菌30min；倒入直径9cm平板，备用。
62.(2)原种培养：用灭菌冷却后的菌种铲按照1:30的质量比挖取步骤(1)中所得黔ms311母种，然后接种于原种培养基上，在温度为20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，此时菌瓶形成大量菌核，得黔ms311原种；所述原种培养基的组成成分及其重量百分比为：小麦80％，腐殖土13％，稻壳5％，石膏1％，碳酸钙1％，培养基含水量为60～65％。原种培养基的制备：按照比例将各组分混合，搅拌均匀，装入聚丙烯袋(规格16cm
×
35cm
×
0.005cm)，用聚丙烯绳扎口，121℃灭菌2小时；备用。
63.(3)栽培种培养：按照1:30的质量比用灭菌冷却后的菌种铲挖取步骤(2)中所得黔ms311原种，然后接种于栽培种培养基上，在温度为20℃、空气相对湿度为60～75％，避光条
件下培养25～30天，菌丝长满菌瓶，此时菌瓶形成大量菌核，得黔ms311栽培种；所述栽培种培养基的组成与步骤(2)中所述的原种培养基相同，制备方法亦相同。
64.(4)开畦播种与覆膜：选择ph6～6.5、土质较细的温室大棚内耕地，清除杂草后翻耕土壤，播种前开畦，畦面宽80～100cm，畦之间留50cm的走道，土壤含水量40～45％，将步骤(3)所得的黔ms311栽培种平均每袋兑入拌种剂30ml，搅拌均匀，将菌种掰碎成小颗粒后均匀撒播到畦面，每亩播种黔ms311栽培种500袋，播种后立刻均匀覆盖一层薄土，覆土后盖上黑色聚丙烯膜。其中所述的拌种剂的组成成分及其重量比为：硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸锌0.01g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖1g，水1000ml。所述拌种剂的制备方法，按照比例将各组分加入水中，搅拌均匀。
65.(5)菌丝培养与摆放营养袋：羊肚菌播种后，控制棚内气温在15～20℃、空气相对湿度60～70％、土壤含水量40～45％、光照强度50～100lux条件下8～10天，菌丝长满畦面形成白色“菌霜”，掀开黑色聚丙烯膜，并放置营养袋，每个营养袋打40～60个小孔，打孔面紧贴畦面土壤，每亩均匀摆放营养袋1800个，营养袋摆放完成后重新覆上黑色聚丙烯膜。营养袋在大田摆放40～45天撤除，并撤除黑色聚丙烯膜；所述营养袋的制备方法：按照重量百分比比例将小麦90％，谷壳9％，生石灰1％混合均匀，加水至含水量60～65％，搅拌均匀，得营养料；将营养料装入聚丙烯袋(规格12cm
×
24cm
×
0.005cm)中，用聚丙烯绳扎口，得营养袋；121℃灭菌1小时，再冷却至常温；备用。
66.(6)原基分化：在步骤(5)撤除营养袋后，喷洒水使土壤含水量达到45～55％；在子实体生长阶段，控制棚内温度10～20℃，空气相对湿度75～85％，光照强度200～300lux，棚内自然通风，诱导原基形成，喷水后7天形成大量原基，形成原基后7～10天形成1～2cm的幼菇。
67.(7)出菇管理和采收：控制棚内气温在10～20℃，空气相对湿度70～80％，土壤含水量40～45％，光照强度500～1000lux，二氧化碳浓度500-700ppm，高温时利用喷雾、侧窗通风措施降温。从原基发生到子实体成熟为25～30天。当子实体不再增大，菌盖脊与凹坑分明，子囊果部分已基本展开，即为成熟，及时采收，使用干净的刀片从子实体基部切割，完成采收。对采收的子实体进行观测和称重。
68.结果本发明菌株黔ms311的子囊果(子实体菌盖)浅褐色，菇形好，子实体质地紧密，口感细嫩，商品价值高。其次，本发明黔ms311农业式栽培亩均产量为501kg，远高于国家认定的六妹羊肚菌品种川羊肚菌6号185kg的亩产量；也远高于目前主栽六妹羊肚菌品种g8和gyh的150～250kg的亩产量。此外，本发明菌株黔ms311栽培周期短，从播种到出菇采收的周期为100～110天，比现有的六妹羊肚菌主栽品种g8、gyh的栽培周期缩短10～15天。