中药分子梣酮在制备治疗神经胶质瘤药物上的应用的制作方法

1.本发明涉及中药分子梣酮在制备治疗神经胶质瘤药物上的应用。


背景技术：

2.神经胶质瘤(glioma，也叫胶质瘤或胶质细胞瘤)，胶质瘤是发生率较高的一种原发性恶性神经系统肿瘤，目前队为恶性神经胶质瘤来源于神经干细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。世界卫生组织(who)中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为i至iv级，i、ii级为低级别脑胶质瘤，iii、iv级为高级别脑胶质瘤。胶质母细胞瘤(gbm，glioblastoma)是胶质瘤的最高级别形式，为tv级胶质瘤。gbm也是成人中最常见的神经胶质瘤，是最致命的癌症之一。高度恶性胶质瘤好发于老年人群，极难治愈，易复发，严重威胁人类健康，给家庭和社会带来沉重负担。目前虽然放疗、化疗、手术、抗egfr治疗、braf靶向治疗等多种手段可用于治疗胶质瘤，但对于恶性程度较高的胶质瘤，目前尚缺乏有效的防治手段，因而迫切需要新的疗法，如靶向治疗、免疫治疗、中药治疗等方式来延长患者的生存期。所以开发新的安全有效的治疗药物、深入研究胶质瘤的调控机制，具有重要的科学和社会意义。
3.近年来中药及其衍生物已成为发现和开发新的抗癌药物的重要来源。中草药中很多化学成分部对胶质瘤有抑制作用。例如，β-榄香烯通过调节yap-cdk6信号促进胶质瘤细胞衰老；丹参酮可以抑制细胞增殖，与替莫唑胺联用可以增强功效。
4.梣酮(fraxinellone，fra)是从芸苔科植物dictamnus dasycarpus的根皮中分离出来的。梣酮是一种四氢苯并呋喃衍生物，研究表明梣酮具有多种病理作用，梣酮能通过降低cugbp1的蛋白质表达，同时增加tfn-γ的表达水平来减少肝纤维化的发生。梣酮可以抑制多个炎症分子的激活，并限制急性胰腺炎的小鼠模型中炎性细胞和巨噬细胞的渗透。并且多项研究表明，梣酮具有抗肿瘤的作用，在骨肉瘤中，梣酮以剂量依赖性的方式抑制骨肉瘤细胞hos和mg63的增殖和迁移，诱导骨肉瘤细胞凋亡和增加自噬流。在肺癌中，梣酮以剂量依赖的方式抑制pd-l1的表达，并且降低hif-1α的表达。然而，梣酮是否具有抗胶质瘤作用及其抑制胶质瘤生长的机制尚不清楚。
5.胶质母细胞瘤是恶性程度最高的胶质瘤，目前尚无有效治疗方法和策略。中医药有传承千年历史，尤其疫情以来其作用之强大令世界刮目相看。中药白鲜成分之一的梣酮对胶质瘤的作用研究还未有报道，
①
本发明通过细胞水平，在体水平深入探时梣酮作用胶质瘤的机制，从分子水平阐明梣酮治疗胶质瘤的作用机制，为临床应用奠定基础。
②
本发明从中药角度出发，阐明中药及其提取物的作用机制，为治疗胶质瘤提供化疗新药物。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的是针对现有技术的不足，提供中药分子梣酮在制备治疗神经胶质瘤药物或保健品上的应用。
7.所述梣酮的结构式如下：
[0008][0009]
作为优选，梣酮通过sirt3信号通路参与抑制胶质瘤的生长。
[0010]
本发明的第二个目的是提供中药分子梣酮在制备防治神经胶质瘤药物或保健品上的应用。
[0011]
本发明的第三个目的是提供一种治疗或防治神经胶质瘤药物或保健品，包括中药分子梣酮。
[0012]
作为优选，所述药物的剂型为医学上队可的任何一种剂型。
[0013]
作为优选，还包括药学上可接受的载体。
[0014]
本发明将神经胶质瘤细胞置于孵育箱中进行培养；向细胞培养基中加入梣酮处理一定时间；采用cck8、ph3免疫荧光、细胞克隆来检测梣酮对胶质瘤细胞增殖的影响；采用细胞划痕和transwell实验检测梣酮对胶质瘤细胞的迁移影响；采用pi染色、流式细胞术及western blot检测梣酮对胶质瘤细胞凋亡的影响。
[0015]
本发明研究梣酮对胶质瘤细胞生长的影响，经研究发现，梣酮可明显抑制胶质瘤的生长，可通过抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移并诱导凋亡来实现。此外发现梣酮通过strt3信号通路参与抑制胶质瘤的生长。因此，本发明既可为胶质瘤的治疗提供了新的思路，也可为抗肿瘤药物的开发提供物质基础。
[0016]
作为优选，所述神经胶质瘤细胞为大鼠胶质瘤细胞株c6或人恶性胶质瘤细胞株dbtrg。
[0017]
作为优选，所述步骤(1)中孵育箱中co2浓度为5％，培养温度为37℃，细胞培养基为含10％fetal bovine serum(fbs)以及1％penicillin-streptomycin(ps)的dmem。
[0018]
因此，本发明具有以下有益效果：
[0019]
(1)通过梣酮处理胶质瘤细胞，处理条件温和，所需时间短；
[0020]
(2)易于操作，并且成功率高，效果良好；
[0021]
(3)既可为胶质瘤的治疗提供了新的思路，也可为抗肿瘤药物的开发提供物质基础。
附图说明
[0022]
图1为梣酮对胶质瘤细胞生长的影响，为梣酮治疗后c6异种移植肿瘤于裸鼠皮下的代表图。
[0023]
图2为梣酮对胶质瘤细胞增殖的影响。其中a、b分别为c6、dbtrg细胞用不同浓度的梣酮(0μm，20μm，50μm，and100μm)处理0，24和48h后，cck8试剂(经典的细胞增殖检测试剂)检测细胞增殖情况；c、d分别为c6、dbtrg细胞分别用不同浓度的梣酮(0μm，20μm，50μm，and 100μm)处理48h后，ph3(细胞增殖标记物)的免疫细胞化学染包；e、f分别是c、d图中ph3染色阳性细胞比例的统计结果(n＝15)，one-way anova；g是c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理7天后，检测细胞集落增殖情况；h是g图中细胞克隆数的统计结果(n＝3)，student’s t-test。数据为均数
±
标准误，*p＜0.05，***p＜0.001。
[0024]
图3为梣酮对胶质瘤细胞迁移的影响。其中a、b分别为c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理0，24和48h后，划痕实验检测细胞迁移情况；c为c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理24h后，transwell实验检测细胞迁移情况；d、e分别为a，b图中划痕愈合比例的统计结果(n＝15)，one-way anova；f、g分别为c图中迁移细胞数的统计结果(n＝3)，student’s t-test。数据为均数
±
标准误，*p＜0.05，***p＜0.001。
[0025]
图4为梣酮对胶质瘤细胞周期与凋亡的影响。其中a是c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理48h后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；b是c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理48h后，流式细胞仪检测细胞周期情况；c、d分别为c6、dbtrg细胞用100μm浓度的梣酮处理48h后，pi试剂(经典的细胞凋亡检测试剂)检测细胞凋亡情况；e为western blot检测c6、dbtrg细胞凋亡后，c-caspase 3和cyclin d1表达水平的变化；f是图c、d中pi试剂检测c6、dbtrg细胞凋亡后的统计图以及e图中c-caspase 3和cyclin d1表达的统计图(n＝3)，student’s t-test。数据为均数
±
标准误，*p＜0.05，**p＜0.01。
[0026]
图5为梣酮对胶质瘤细胞生长的影响。其中：图a为梣酮治疗后c6异种移植肿瘤的代表图；图b为图a中肿瘤的重量统计图；图c为梣酮处理23d后，western blot检测异种移植肿瘤中p53、cyclin d1、cleaved-caspase 3和sirt3表达水平的变化；图d、图e、图f和图g分别为图c中p53、cyclin d1、cleaved-caspase 3和sirt3蛋白的统计图。
具体实施方式
[0027]
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。下述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的芳动。因此，本发明不限于下述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改部应该在本发明的保扩范围之内。
[0028]
实施例1：梣酮对胶质瘤细胞增殖的影响
[0029]
为了检测梣酮对胶质瘤增殖是否有影响，通过cck8实验、克隆形成实验、ph3免疫荧光检测梣酮对胶质瘤的增殖作用。具体操作如下：1)cck8实验测定48h梣酮对c6和dbtrg的半抑制浓度：c6和dbtrg细胞在dmem，10％fbs及双抗的培养液环境下生长，到合适密度时使用胰酶消化，培养液重恳后使用血球计数板计数，96孔板铺板，每孔3000个细胞，细胞贴壁24小时后，换成分别含有0μm，25μm，50μm，100μm梣酮浓度的培养液，每孔100μl，使用cck8分别测定加药0h，24h，48h的细胞活力，cck8每孔加10μl，反应两个小时后450nm酶标仪读板，每种浓度下每个时间点分别设置3个重复孔，实验重复3次，根据结果计算生长曲线并进行统计学分析，结果显示在两种细胞系中梣酮作用48h的半抑制浓度大约为100μm。
[0030]
2)克隆形成实验检测梣酮对胶质瘤的增殖作用：在6孔板里接种细胞恳液(500个细胞/孔)，加入含有100μm的梣酮的培养液，放在培养箱中培养5天(37℃，5％co2)，pfa固定，结晶紫染色，拍照。
[0031]
3)ph3免疫荧光染包检测梣酮作用对细胞增殖影响：将c6和dbtrg细胞以合适密度均匀铺在铺有无菌并经过poly-lysine包被的细胞爬片上，接种细胞恳液(10000个细胞/孔)，细胞贴壁生长24h后，使用对照和含有100μm梣酮的1％fbs培养液饥饿处理24h，使用4％pfa固定15min，然后用pbs清洗爬片3次，每次5min。0.1％triton x100通透，5％bsa封闭
后，孵育5％bsa稀释的一抗ph3在4℃过夜，1xpbs清洗后，孵育荧光二抗，dapi染核，使用共聚焦显微镜拍摄，统计ph3阳性信号细胞与核阳性细胞比例，实验重复三次，统计学分析实验组和梣酮处理实验组细胞增殖情况；
[0032]
如图2所示，通过cck8实验、细胞克隆实验、ph3免疫荧光可以发现，梣酮可以抑制胶质瘤细胞的增殖(图c-d将彩图转换成灰度模式后，荧光强度与原图有所差异，从原图和图e-f可以看出，相较于对照组而言，经梣酮处理后c6和dbtrg细胞的荧光强度均明显减小)。
[0033]
实施例2：梣酮对胶质瘤细胞迁移的影响
[0034]
为了检测梣酮对胶质瘤迁移是否有影响，通过划痕实验、transwell检测梣酮对胶质瘤的迁移作用。具体操作如下：
[0035]
1)划痕实验：使用12孔极，分别铺板c6，dbtrg细胞每孔15万细胞，观察细胞长满后使用1ml枪头沿着6孔板盖子均匀划横线(在孔中线上下，左右划两道)，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。pbs清洗掉碎片细胞后换对照或加100μm梣酮的含1％fbs培养液培养，分别拍摄划痕0，24，48h划痕愈合状态，一次实验对照组和实验组分别重复3孔，实验重复3次，使用image j统计划痕愈合率并统计学分析；
[0036]
2)transwell实验：采用适配24孔板的transwell小室，上室加对照或者含有100μm梣酮的无血清培养液200μl，内含1万个c6或细胞，下室10％fbs，24小时后4％pfa固定后使用结晶紫染包，每次实验实验组对照组重复三孔，实验重复三次，拍照统计穿越细胞数量并统计学分析；
[0037]
如图3所示，通过划痕实验和transwell实验可以发现梣酮可以抑制胶质瘤细胞的迁移。
[0038]
实施例3：梣酮对胶质瘤细胞周期与凋亡的影响
[0039]
为了检测梣酮对胶质瘤细胞周期与凋亡是否有影响，通过流式细胞术、western blot和pi染包来检测梣酮对胶质瘤细胞周期与凋亡的作用。具体操作如下：
[0040]
l)western blot结合流式细胞分析术检测梣酮对细胞凋亡的影响：c6和dbtrg细胞在6cm盘生长到合适密度后，分别使用对照和含有100μm梣酮的培养液培养条件下培养24h，弃去培养液，预冷的1 x pbs清洗，加适量含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，使用细胞刮将贴壁细胞刮下收集到预冷的1.5ml ep管中，20％功率，超产2s停3s，持续1分钟，冰上裂解15min，4℃，14000g，离心10分钟，收上清，使用bca法进行蛋白定量，5x蛋白loading buffer制杆，sds-page跑胶，pvdf膜20％甲醇条件下转膜，5％脱脂牛奶室温封闭1h，根据分子量大小裁膜，孵育凋亡相关蛋白c-caspase 3，4℃孵育过夜，1 x tbst清洗后，孵育相应种属来源偶联hrp二抗，1 x tbst清洗干净后，使用ecl发光液孵育，化学发光采集信号，根据信号强弱反映蛋白含量，使用imagej进行条带灰度计算，进行统计学分析差异；流式细胞术分析使用移酶消化后的细胞，细胞量大于30万，离心后，1 x pbs清洗，300g，2min离心去上清，binding buffer 500μl重恳细胞，加fitc和pi进行混匀染色，室温避光孵育5min，过滤后通过流式管上机进行细胞凋亡分析；
[0041]
2) western blot结合流式细胞分析术检测梣酮对细胞周期阻滞作用的影响：c6和dbtrg细胞在6cm盘生长到合适密度后，分别使用对照和含有100μm梣酮的培养液培养条件下培养24h，弃去培养液，预冷的1 x pbs清洗，加适量含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液，
使用细胞刮将贴壁细胞刮下收集到预冷的1.5ml ep管中，20％功率，超声2s停3s，持续1分钟，冰上裂解15min，4℃，14000g，离心10分钟，收上清，使用bca法进行蛋白定量，5x蛋白loading buffer制杆，sds-page跑胶，pvdf膜20％甲醇条件下转膜，5％脱脂牛奶室温封闭1h，根据分子量大小裁膜，孵育周期相关蛋白cyclin d1，4℃孵育过夜，1 x tbst清洗后，孵育相应种属来源偶联hrp二抗，1 x tbst清洗干净后，使用ecl发光液孵育，化学发光采集信号，根据信号强弱反映蛋白含量，使用image j进行条带灰度计算，进行统计学分析差开；流式细胞术分析使用移酶消化后的细胞，细胞量大于30万，离心后，1 x pbs清洗，300g，2min离心去上清，500μl70％乙醇重恳，固定2h，4℃保存，离心去上清，1 x pbs清洗，离心去上清，加100μl rnasea，37℃孵育30min，加400μl pi，4℃避光30min，过滤后通过流式管上机进行周期阻滞分析；
[0042]
如图4所示，通过流式细胞术、western blot和pi染色可以发现，梣酮可以促进胶质瘤细胞的凋亡，并将胶质瘤细胞阻滞在g1/s期。
[0043]
实施例4：梣酮对在体胶质瘤生长的影响
[0044]
为了检测梣酮对在体胶质瘤生长的影响，通过皮下成瘤模型来检测。具体操作如下：
[0045]
1)皮下成瘤模型建立：将3
×
106个c6细胞恳浮于无血清dmem培养基中，接种于裸鼠皮下。当注射部位可见肿瘤生长到50-100mm3时，将小鼠随机分为两组：药物对照组和梣酮组。
[0046]
2)将梣酮溶解于玉米油中，按50mg/kg灌胃给药，按体重0.1ml/10g灌胃给药18d，以等量玉米油为对照。每二天测量一次肿瘤体积，计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5
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l
×
w2，l为长，w为宽。最后，用颈椎脱位法处死小鼠，切除肿瘤、心脏、肝脏、肺和肾脏。肿瘤被立即拍照并称重。然后用4％pfa固定肿瘤和脏器，进行he分析。
[0047]
如图1和图5所示，通过皮下成瘤模型可以发现，梣酮可以抑制在体胶质瘤的生长。
[0048]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0049]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保扩范围。综上所述，本发明提供了一种新的治疗脑胶质瘤衰老的药物，开发现其治疗胶质瘤可能的分子机制，可为胶质瘤的治疗提供新的思路。