一种双特异性抗体的药物组合物及其用途的制作方法

一种双特异性抗体的药物组合物及其用途
发明领域
1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种稳定的抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的药物制剂。


背景技术：

2.磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican 3，gpc3)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。gpc3基因编码产生70kda左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40kda左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(n末端)肽和30kda左右含有2个硫酸乙酰肝素(hs)糖链的膜结合的竣基端(c末端)肽。gpc3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。
3.随着生物药的不断发展，治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物。然而，单克隆抗体有其局限性，这些抗体所针对的都是单一的靶标，很多患者不能充分响应单一的疗法，病人可能产生耐药性或无应答。癌症和其他疾病是多因素疾病，有多种信号通路参与疾病发生。单一靶点的免疫疗法似乎并不足以推毁癌细胞。双特异性抗体(bispecific antibody，biab)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够特异性识别和结合两个不同的抗原或抗原表位，其可以在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，将特定的免疫细胞重新定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，或者同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能。
4.现阶段，正在研发的抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体带有两个不同的可变区，其中一个识别结合肿瘤抗原glypican 3，另一个用于结合t细胞，双特异性抗体起一个“连接臂”的作用，将t细胞召集到肿瘤部位。同时该抗体采用共同轻链的结构设计，针对两个靶点的抗体重链拥有相同的轻链，在抗体表达配对上不会导致轻重链错配出现。
5.虽然共同轻链双特异性抗体在成药性和生产工艺的控制上具有很大的优势，但是，因采用两个不同重链，其稳定性远远不如单克隆抗体。因此，双特异性抗体药物制剂也更容易面临药物制剂不稳定，例如，抗体液体制剂在长途运输过程中或长期储存过程中容易出现降解、聚合等现象。因此，为了更好的使抗体药物能够更稳定的发挥应有的活性和作用，生物药物的制剂研究尤为重要。但是，目前并没有抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的上市药物，而且针对双特异性抗体的研究也并不多。
6.本发明通过对多种缓冲体系、稳定剂及表面活性剂等进行研究，研发出有利于本抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体稳定的制剂处方，从而最大程度的保障药物有效性和用药安全性。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种稳定的并适合长期储存
的抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的药物组合物。
8.本发明所述的双特异性抗体的药物组合物，包括抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体和组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系。
9.进一步的，所述药物组合物还包括海藻糖。
10.进一步的，所述药物组合物还包括聚山梨酯-80。
11.进一步的，所述抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的浓度为0.1-20g/l；优选的，所述抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的浓度为0.5-10g/l；更优选的，所述抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体的浓度为1-5g/l。
12.进一步的，所述组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系的浓度为2-200mm；优选的，所述组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系的浓度为1-100mm；更优选的，所述组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系的浓度为10-50mm。
13.进一步的，所述组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系的ph值为5.5-6.5；优选的，所述组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系的ph值为6.0。
14.进一步的，所述海藻糖的浓度为20-500mm；优选的，所述海藻糖的浓度为50-200mm；更优选的，所述海藻糖的浓度为100-150mm。
15.进一步的，所述聚山梨酯-80的体积分数为0.006-0.2％；优选的，所述聚山梨酯-80的体积分数为0.01-0.1％；更优选的，所述聚山梨酯-80的体积分数为0.02％。
16.进一步的，所述药物组合物为水针制剂的形式。本发明还公开了一种双特异性抗体的冻干制剂，其中所述制剂通过上述任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
17.本发明所述的冻干制剂的制备方法为：
18.(1)预冻阶段∶0℃保持60min；-45℃预冻保持2h；
19.(2)一次干燥∶设置真空度在10pa，程序升温；升温至-10℃，保持1h；升温至-5℃，保持26h；升温至0℃，保持5h；升温至5℃，保持2h；
20.(3)解析干燥∶升温至25℃，10pa压力下保持4h，5pa压力下再保持2h；
21.(4)冻干结束，压塞出箱，手动轧盖，4℃保存。
22.本发明还公开了上述任一项所述的组合物或冻干制剂在制备用于治疗、抑制肿瘤细胞增殖或转移的疾病或病症的药物中的用途，优选的，所述疾病或病症为癌症，更优选的，所述癌症选自：胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。
23.本发明的有益效果
24.本发明提供的抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体制剂，稳定性得到了显著提高，相对液体制剂减少了抗体的降解和聚集的发生，极大的解决了抗gpc3和抗cd3的双特异性抗体在长途运输过程中及长时间的储存过程中的不稳定问题，易于生产和储存。
具体实施方式
25.以下结合具体的实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并非限制本发明的范围。本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
26.实施例1抗体的制备
27.从液氮中取出105-102-7号细胞株，37℃水浴快速融化，将细胞转移至摇瓶中培养，细胞接种密度为0.4～1.2
×
106个细胞/ml。
28.细胞在摇瓶中进行扩增培养，每2天传代一次。根据培养体积更换不同规格摇瓶，摇床参数为37℃、5％co2、115rpm。当最终细胞密度达3～6
×
106个细胞/ml，细胞活力大于90％，转移至发酵罐中培养。
29.发酵罐的接种密度为0.8～1.2
×
106个细胞/ml，温度37℃，转速180～250rpm，ph6.8～7.2、溶氧(po2)50％。当细胞密度≥10
×
106个细胞/ml时，将培养温度降为32℃。为了使细胞有足够的营养维持其较高活率并产生目的蛋白，在培养第4、6、8、10天均补初始培养体积3％补料培养基。为避免葡萄糖含量过低对细胞活率产生明显影响，向反应器中补加30％(m/v)葡萄糖溶液，使培养液中葡萄糖含量维持在4g/l。待细胞活率下降至80％左右时，收获细胞发酵液。
30.将收获的发酵液8000～12000rpm离心30分钟，0.45um滤膜过滤后进行蛋白a亲和层析(博格隆at proteina)、阳离子交换层析(ge captos impact)及阴离子交换层析(ge captoq)三步层析，最终得到抗体。
31.实施例2抗体制剂缓冲体系的筛选
32.用下列不同缓冲剂，分别添加0.02％的聚山梨醇-80，配制抗体浓度为5mg/ml的抗体制剂：
33.1)20mm柠檬酸-柠檬酸钠，ph5.5；
34.2)20mm柠檬酸-柠檬酸钠，ph6.5；
35.3)10mm柠檬酸-柠檬酸钠，ph6.0；
36.4)10mm醋酸-醋酸钠，ph5.5；
37.5)20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，ph6.0；
38.6)20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，ph6.5；
39.7)10mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，ph6.0；
40.8)20mm组氨酸-盐酸组氨酸，ph5.5；
41.9)20mm组氨酸-盐酸组氨酸，ph6.0；
42.10)20mm组氨酸-盐酸组氨酸，ph6.5；
43.11)10mm组氨酸-盐酸组氨酸，ph6.0。
44.将抗体经过超滤换液至不同缓冲溶液中，缓冲液置换完成后加入聚山梨酯-80，维持终浓度为0.02％(v/v)，除菌过滤、无菌分装。将上述制备的抗体制剂放置于25℃，分别于第1周和第3周取出进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)的检测，以实验起始(0周)、放置1周和3周的纯度，考查不同的缓冲溶液对制剂稳定性的影响。结果如表1所示。
45.表1抗体不同ph缓冲体系筛选实验结果
[0046][0047]
结果表明，抗体制剂的缓冲体系为组氨酸-盐酸组氨酸时，在25℃下放置3周，纯度下降较少，稳定性好。
[0048]
实施例3抗体制剂稳定剂的筛选
[0049]
用下列不同稳定剂的缓冲剂，制备抗体浓度为5mg/ml的抗体制剂：
[0050]
1)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，25mm精氨酸，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0051]
2)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，50mm精氨酸，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0052]
3)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，50mm精氨酸和234mm海藻糖，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0053]
4)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，50mm甘氨酸，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0054]
5)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，100mm氯化钠，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0055]
6)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，150mm氯化钠，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0056]
7)20mm醋酸-醋酸钠，ph4.5-5.5，150mm氯化钠和234mm海藻糖，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0057]
8)20mm柠檬酸-柠檬酸钠，ph6.0，150mm氯化钠，0.2g/l聚山梨酯-80；
[0058]
9)20mm组氨酸-盐酸组氨酸，ph6.0，234mm海藻糖，0.2g/l聚山梨酯-80。
[0059]
将抗体经过超滤换液至不同稳定剂的缓冲溶液中，进行除菌过滤、无菌分装。将上述制备的抗体制剂放置于37℃，于第2周取出进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)的检测，以实验起始(0周)和放置2周的纯度，考查不同的稳定剂对制剂稳定性的影响。结果如表2所示。
[0060]
表2抗体不同稳定剂筛选实验结果
[0061][0062]
结果表明，抗体制剂的稳定剂为海藻糖时，抗体制剂的稳定性最好。
[0063]
实施例4液体制剂影响因素实验
[0064]
为了进一步对缓冲体系、稳定剂、表面活性剂和ph值的优化，用下列不同稳定剂、表面活性剂和ph值的缓冲剂，配制抗体浓度为5mg/ml的液体制剂：
[0065]
1)20mm醋酸-醋酸钠，120mm海藻糖，0.02％聚山梨酯-80，ph4.5～5.0；
[0066]
2)20mm醋酸-醋酸钠，50mm甘氨酸，0.02％聚山梨酯-80，ph4.5～5.0；
[0067]
3)20mm柠檬酸-柠檬酸钠，234mm海藻糖，0.02％聚山梨酯-80，ph6.0；
[0068]
4)20mm组氨酸-盐酸组氨酸，150mm海藻糖，0.02％聚山梨酯-80，ph6.0。
[0069]
将样品放置于40℃，进行长期稳定性研究，于第1月和第3月取出分别进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)和阳离子交换高效液相色谱(cex-hplc)的检测，其sec-hplc主峰含量和cex-hplc主峰含量如表3所示。
[0070]
表3双特异性抗体的纯度和电荷异构体主峰含量结果
[0071][0072][0073]
抗体液体制剂在40℃下放置1个月和3个月的结果表明，跟方案1和2相比，方案3的sec-hplc主峰含量变化很小，但是cex-hplc主峰含量变化较大，而方案4的sec-hplc和cex-hplc的主峰含量变化都非常小，稳定性更好。与醋酸-醋酸钠和柠檬酸-柠檬酸钠相比，本发明的抗体组合物使用组氨酸-盐酸组氨酸，稳定剂为海藻糖，表面活性剂为聚山梨酯80，ph值为6.0时，稳定性更高。
[0074]
采用不同光照条件下的影响因素实验考察实施例4中方案4的液体制剂稳定性。光照实验条件和方法为：日光光照强度为4500lx
±
500lx，紫外照度为250μw/cm2，室温光照箱中放置样品，分别在2天、5天和10天取样。光照条件如表4所示。实验结果如表5所示。
[0075]
表4光照条件
[0076][0077]
表5液体制剂稳定性实验结果
[0078][0079]
注：na表示未检出；hmw表示高分子量；lmw表示低分子量。
[0080]
抗体的液体制剂在2天日光 紫外的照射下，样品sec-hplc主峰含量有所下降，聚体增加，小分子片段也略有增加，抗体出现一定程度的聚集和降解；在停止紫外照射后，仅日光进行照射，小分子片段急剧增加，样品受损严重；后续光照8天，样品全部降解，未检测到目标抗体。光照试验结果表明，日光光照对抗体影响较大，会导致抗体破碎，小分子片段增加，稳定性下降。因此，液体制剂需要避光保存。
[0081]
实施例5液体制剂稳定性实验
[0082]
将样品放置于4℃，进行长期稳定性研究，于第1月和第2月取出分别进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)和阳离子交换高效液相色谱(cex-hplc)的检测，其sec-hplc主峰含量和cex-hplc主峰含量如表6所示。
[0083]
表6双特异性抗体的纯度和电荷异构体主峰含量结果
[0084][0085]
抗体液体制剂在4℃下放置1个月和2个月的结果表明，虽然方案1、方案2、方案3和方案4的sec-hplc主峰含量变化都很小，但是，方案1、方案2和方案3的cex-hplc主峰含量变化较大，而方案4的cex-hplc主峰含量变化较小。
[0086]
由此可以说明，与醋酸-醋酸钠和柠檬酸-柠檬酸钠相比，本发明的抗体组合物使用组氨酸-盐酸组氨酸，稳定剂为海藻糖，表面活性剂为聚山梨酯80，ph值为6.0时，稳定性更高。
[0087]
实施例6冻干制剂的制备
[0088]
配制如表7所示浓度的冻干前溶液，并冻干成成品。
[0089]
表7冻干前溶液组分
[0090]
成分含量抗体5mg/ml组氨酸-盐酸组氨酸20mm海藻糖150mm聚山梨酯-800.02％(v/v)
[0091]
将纯化后的抗体用超滤膜包进行超滤置换浓缩，超滤至ph6.0组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液中，再与含一定比例的海藻糖、聚山梨酯-80，ph6.0组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液混合，使得混合后各组分的浓度如表7所示。充分混匀后，分装至冻干用注射剂瓶中，按2ml/瓶分装，进行冷冻干燥。冷冻干燥程序如下：
[0092]
(1)预冻阶段∶0℃保持60min；-45℃预冻保持2h；
[0093]
(2)一次干燥∶设置真空度在10pa，程序升温，升温至-10℃，保持1h；升温至-5℃，保持26h；升温至0℃，保持5h；升温至5℃，保持2h；
[0094]
(3)解析干燥∶升温至25℃，10pa压力下保持4h，5pa压力下再保持2h；
[0095]
(4)冻干结束，压塞出箱，再手动轧盖，4℃保存。
[0096]
实施例7冻干制剂影响因素实验
[0097]
将实施例6的冻干制剂进行40℃高温实验，分别于t-0(实验开始)、t-1m(放置1个月)、t-2m(放置2个月)进行取样，进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)、阳离子交换高效液相色谱(cex-hplc)检测。实验结果如表8所示。
[0098]
表8冻干制剂稳定性实验
[0099][0100]
注：na表示未检出；hmw表示高分子量；lmw表示低分子量。
[0101]
抗体的冻干制剂在40℃下放置2个月，sec-hplc和cex-hplc主峰含量都没有下降，说明抗体制剂非常稳定。
[0102]
采用不同光照条件下的影响因素实验考察实施例6的冻干制剂稳定性。光照实验条件和方法为：日光光照强度为4500lx
±
500lx，紫外照度为250μw/cm2，室温光照箱中放置样品，分别在2天、5天和10天取样。光照条件如表9所示。实验结果如表10所示。
[0103]
表9光照条件
[0104][0105]
实验结果如表10所示。
[0106]
表10冻干制剂稳定性实验结果
[0107][0108][0109]
注：na表示未检出；hmw表示高分子量；lmw表示低分子量。
[0110]
抗体的冻干制剂在2天紫外及10天日光的照射下，样品质量较为稳定，sec-hplc主峰含量并没有下降，cex-hplc主峰含量下降也比较小，相较于液体制剂更为稳定。
[0111]
实施例8冻干制剂稳定性实验
[0112]
将实施例6的冻干制剂进行25℃加速及4℃长期稳定性实验，分别于t-0(实验开始)、t-1m(放置1个月)、t-2m(放置2个月)进行取样，进行分子排阻高效液相色谱(sec-hplc)、阳离子交换高效液相色谱(cex-hplc)检测。实验结果如表11所示。
[0113]
表11冻干制剂稳定性实验
[0114][0115]
注：na表示未检出；hmw表示高分子量；lmw表示低分子量。
[0116]
抗体的冻干制剂分别在25℃及4℃下放置2个月，sec-hplc和cex-hplc主峰含量都没有下降，说明抗体制剂非常稳定。
[0117]
实施例9不溶性微粒的检测
[0118]
根据《中国药典》规定，采用光阻法对实施例4的冻干制剂及冻干前原液(液体制剂)进行不溶性微粒检测。开始检测前，先用检测合格的微粒检查用水进行空白标定。
[0119]
原液检测直接取一定体积(不小于25ml)加入取样杯，静置2分钟或适当时间去除气泡。开始搅拌使溶液混匀(避免气泡产生)，每个供试品依照药典规定检测4次，每次取样不少于5ml，记录数据，放弃第一次数据，取后续数据平均值作为测定结果。分别在实验开始(t-0)及放置三个月(t-3m)进行测定。
[0120]
针对静脉注射用冻干粉针剂检查采用合并溶液进样的方法：取12-15瓶样品(规
格：10mg/2ml/瓶)，每瓶用2ml微粒检查用水复溶后，合并入一个容器中，混合搅拌后进样测定，测定方法及记录数据与原液检测方法类似。复溶及混样尽量采用同一手法，避免微粒混入。冻干制剂在实验开始(t-0)进行测定。
[0121]
实施例4的冻干制剂及冻干前原液(液体制剂)的不溶性微粒检测实验结果如表12所示。实验结果符合中国药典的规定。
[0122]
表12不溶性微粒检测结果(微粒数：个/2ml)
[0123][0124]
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。