一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法与流程

1.本发明属于质膜染色技术领域，具体涉及一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法。


背景技术：

2.细胞膜是细胞包围内容物的一层界膜。可以保护细胞内微环境的相对稳定，阻止外来物质的随意进入，同时可以感受外界环境的改变。细胞膜首先是一个具有主动运输功能和高度选择性的膜结构，保持着细胞内外的物质浓度差异，控制着营养成分向细胞内的转运以及细胞内代谢废物、分泌物的排出。其次它具有感受细胞外界信号并进行信号传递的功能，介导了细胞外因子对细胞引发的各种生理、生化反应。它还是细胞与相邻细胞和细胞外基质的连接中介。因此，质膜的研究是当今生物学和生物技术领域中的重要内容，在基础和应用研究中都具有重要的意义。
3.荧光成像技术具有灵敏度高和生物相容性好等优点，所以被广泛应用于生物质膜成像领域。传统的植物质膜荧光标记方法是利用报导的质膜定位蛋白与荧光蛋白融合，转化到植物中后再进行荧光观察，具有操作复杂，难度大，周期长等缺点，因此在很多实验中的应用受到了限制。而如何提供一种操作简单、快速的质膜荧光标记方法，是本领域所急需和必要的。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物的质膜荧光标记方法及质膜蛋白的定位和动态监测方法，可以有效、准确、快速地研究植物的质膜蛋白的定位和动态。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种植物的质膜荧光标记方法，包括以下步骤：利用fm4-64染料对分离得到的质膜结构进行染色，采用缓冲液对已染色的质膜结构进行清洗，得质膜荧光标记的质膜结构。
7.优选的，所述fm4-64染料的工作液浓度为4μm。
8.优选的，所述植物的质膜结构包括根毛细胞和/或叶肉原生质体。
9.优选的，所述植物包括拟南芥。
10.优选的，所述拟南芥的根毛细胞的分离方法，包括：将拟南芥种子消毒后播种于固体1/2ms培养基上，4℃放置2d，而后进行7d光暗交替培养，切取拟南芥幼苗的根作为染色材料；
11.所述拟南芥的叶肉原生质体的分离方法，包括：切取拟南芥第3～4轮叶片，去除叶片下表皮后进行酶解，将酶解后的叶片置于w5溶液中，收集沉淀，即为分离的叶肉原生质体。
12.优选的，所述光暗交替培养的培养温度为22℃，光周期为12h光照/12h黑暗，光强
度为150μe m-2
s-1
；
13.所述酶解用的酶解液包括以下质量体积百分含量的原料：1.5％纤维素酶r10，0.25％果胶酶r10，0.05％β-巯基乙醇和1％bsa，还包括以下物质的量浓度的原料：0.4m甘露醇，20mm kcl，20mm mes和10mm cacl2，ph＝5.7。
14.优选的，所述染色的温度为20～25℃，染色时间为1min。
15.优选的，对所述植物的质膜结构染色后，还包括利用ddh2o对已染色的根毛细胞进行清洗，利用w5溶液对已染色的叶肉原生质体进行清洗。
16.本发明还提供了一种监测植物的质膜蛋白的定位和动态的方法，包括以下步骤：采用激光共聚焦显微镜，对利用上述质膜荧光标记方法得到的质膜荧光标记的质膜结构进行观察和拍照。
17.优选的，设置荧光激发波长为515nm，发射波长为640nm。
18.有益效果：本发明提供了一种植物的质膜荧光标记方法，采用fm4-64染料对质膜结构进行染色，所述fm4-64染料能够嵌合在质膜双分子层中，并跟随质膜进行动态转运，因此也可以进行质膜内吞和转运等后续的相关研究所使用。而且本发明所述荧光标记方法，可在遗传转化或瞬时转化就能进行质膜的荧光标记，节省了实验时间。此外，由于fm4-64染料为红色荧光，适合双荧光标记的质膜共定位使用，例如与绿色荧光蛋白标记的质膜蛋白进行共定位实验。
19.在本发明实施例中，对拟南芥的根毛细胞和叶肉原生质体进行质膜荧光标记，由于拟南芥叶肉原生质体中有较多的叶绿体，而叶绿体具有红色自发荧光，可根据荧光的样式和形态进行荧光信号的区分，叶绿体自发荧光是红色球形或椭球形，分布在叶肉原生质体的内部，而红色的质膜荧光标记是线形的，而且仅分布在叶肉原生质体外围；植物根毛细胞没有叶绿体存在，因此不存在荧光信号的干扰问题。
附图说明
20.图1为拟南芥根毛细胞质膜fm4-64染色图(dssweet12-gfp)，图中红色为fm4-64染色的质膜荧光信号，绿色为质膜蛋白dssweet12-gfp的荧光信号；
21.图2为拟南芥叶肉原生质体fm4-64染色图(dssweet12-gfp)，图中绿色为质膜蛋白dssweet12-gfp的荧光信号，黄色箭头指示的红色是fm4-64染色的质膜荧光信号，白色箭头指示的红色是叶绿素(chl)自发荧光信号。
具体实施方式
22.本发明提供了一种植物的质膜荧光标记方法，包括以下步骤：利用fm4-64染料对分离得到的质膜结构进行染色，采用缓冲液对已染色的质膜结构进行清洗，得质膜荧光标记的质膜结构。
23.本发明对所述植物的种类并没有特殊限定，实施例中利用拟南芥这一模式植物进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
24.本发明所述fm4-64染料的工作液浓度优选为4μm，所述fm4-64染料的工作液的制备方法，优选包括将所述1mg fm4-64用0.5ml的dmso助溶，利用ddh2o稀释至fm4-64的浓度为4μm即可。本发明所述工作液中fm4-64的含量优选为4μm。
spiculifolius，dssweet12，affercts sugar metabolism and confers osmotic and oxidative stress tolerance inarabidopsis.molecular sciences.2018)
35.1、拟南芥根毛细胞质膜染色；
36.步骤一、将转基因拟南芥种子经70％酒精消毒30s，次氯酸钠消毒3min，无菌水清洗5次后，铺植于固体1/2ms培养基上，4℃放置2天；
37.步骤二、带有种子的培养皿取出后放置于光照培养箱中垂直放置培养7天，培养温度为22℃，光周期为12h光照/12h黑暗，光强度为150μe m-2
s-1
；
38.步骤三、用剪刀切取培养皿中垂直生长7天的拟南芥幼苗整个根，然后放入到1.5ml离心管中，再加入1ml fm4-64工作液(终浓度4μm)中染色1min，弃掉染液，立即用ddh2o清洗两遍；
39.步骤四、压片，用激光共聚焦显微镜观察，找到根成熟区的根毛细胞并拍照。结果如图1所示，红色荧光的fm4-64信号能够与质膜定位的绿色荧光dssweet-gfp信号重合，说明fm4-64染料标记拟南芥根毛细胞质膜的准确性。
40.2、拟南芥叶肉原生质体质膜染色；
41.步骤一、拟南芥叶肉原生质体的分离：(1)选择生长状态良好的8叶期的拟南芥植株，切取第3～4轮叶片，用双面胶粘去叶片下表皮后，将整个叶片背面向下放入6孔板中，向板孔中加入5ml酶解液(1.5％(m/v)纤维素酶r10，0.25％(m/v)果胶酶r10，0.4m甘露醇，20mm kcl，20mm mes，10mm cacl2，0.05％(m/v)β-巯基乙醇，1％(m/v)bsa，ph＝5.7)，室温酶解1h，期间每隔10min，轻轻晃动一次；(2)酶解后小心用移液器吸掉酶切液，此时解离的叶肉原生质体呈绿色，并沉淀在孔板底部，吸取时不要吸到原生质体；
42.步骤二、向孔板内加入200μl w5溶液(0.4m甘露醇，20mm kcl，20mm mes，ph＝5.7)，随后加入fm4-64染料(终浓度4μm)，室温下染色1min；
43.步骤三、小心吸掉w5溶液，再次加入200μl w5溶液清洗一次后，用200μl w5溶液重悬原生质体；
44.步骤四、将1ml的蓝色枪头前端剪掉，小心吸取10μl染色后的叶肉原生质体，注意轻容操作，避免原生质体破碎，加入到载玻片上，制成切片。
45.步骤五、利用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照，激发波长为515nm，发射波长为640nm。由于在此波长下，同样能检测出叶绿体的红色的自发荧光，要根据荧光的样式和形态进行荧光信号的区分和拍照，叶绿体自发荧光是红色球形或椭球形，分布在叶肉原生质体的内部，而红色的质膜荧光标记是线形的，而且仅分布在叶肉原生质体外围。
46.结果如图2所示，红色荧光的fm4-64信号能够与质膜定位的绿色荧光dssweet-gfp信号重合，位于细胞外围，而且是线形的，而叶绿素的红色自发信号是球形或椭球形，分布在原生质体内部，说明了fm4-64染料标记拟南芥叶肉原生质体质膜的准确性。
47.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。