转录因子BTB-CNC同源体1在非霍奇金淋巴瘤治疗中的应用的制作方法

转录因子btb-cnc同源体1在非霍奇金淋巴瘤治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及转录因子btb-cnc同源体1（btb and cnc homology 1，简称bach1）在非霍奇金淋巴瘤治疗中的应用。


背景技术：

2.转录因子bach1属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族，广泛存在于哺乳动物的各种组织中，其涉及多种生理病理过程，包括氧化应激、细胞周期、血红素稳态、炎症和免疫等，与多种疾病的发生和发展具有紧密联系。近年来，发现bach1可通过改变肿瘤代谢以及上皮间充质转化表型，促进肿瘤增殖转移。例如，在转移性肺癌组织中可观察到bach1的高表达，以及bach1通过激活己糖激酶2和3-磷酸甘油醛脱氢酶增加葡萄糖的摄取和乳酸的分泌，增加糖酵解速率，促进肺癌的恶化和转移。在乳腺癌、食管癌、结直肠癌等癌整中发现高表达的bach1提高了肿瘤细胞的迁移活性。同时，bach1也可通过上调转移相关趋化因子受体、基质金属蛋白酶等的表达促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。但bach1在淋巴瘤中的作用尚无报道。
3.淋巴瘤是一类起源于造血系统的淋巴结和淋巴组织的恶性肿瘤。据世界卫生组织统计，淋巴瘤发病率年增长率为7.5%，近年来发病率增速较快。根据其病理学特点，淋巴瘤主要分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两个大类。从目前的数据来看，霍奇金淋巴瘤通常治疗效果较好，治愈率较高。而非霍奇金淋巴瘤是一组高度异质性的恶性淋巴细胞增殖性疾病，在我国是男性最常见的几种恶性肿瘤之一。目前非霍奇金淋巴瘤的明确病因尚不清楚，可能与遗传、病原体感染、机体免疫异常、环境污染等因素有关。随着生活方式的改变、环境污染的加重、饮食结构的调整、精神压力增加、老龄化等因素影响，近年来发病率明显增加。目前非霍奇金淋巴瘤的主要治疗仍是以化疗或者放疗为主，经济条件较好或者有明确治疗指针的患者可同时应用免疫疗法。在治疗过程中，化疗和放疗由于其细胞毒性，在其应用过程中在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒性作用，使患者在接受化疗和放疗期间出现各种不同程度的副作用，导致患者生存质量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中断治疗，严重影响了疗效与疾病的转归。而免疫疗法主要包括细胞治疗和抗体治疗两个方面，该治疗方法主要通过增加肿瘤抗原性及调控肿瘤免疫逃逸来激活人体自身免疫反应而杀灭肿瘤细胞，对非侵袭性非霍奇金淋巴瘤的治疗有所帮助，但经过初始治疗后复发或难治性非霍奇金淋巴瘤患者的预后仍然很差。因此，面对目前肿瘤治疗的局限性及个体异质性的现状，迫切需要开发特异性的靶点，用于非霍奇金淋巴瘤的治疗。
4.综上所述，bach1在肿瘤方面的作用已越来越受到重视，但是现有报道中尚无bach1与非霍奇金淋巴瘤相关的内容，也无bach1在非霍奇金淋巴瘤治疗方面的用途。


技术实现要素：

5.本发明在现有技术的基础上，提供了转录因子btb-cnc同源体1（即bach1）及其抑制剂在非霍奇金淋巴瘤治疗中的应用。
6.本发明首次发现了bach1与非霍奇金淋巴瘤之间具有关联性，为非霍奇金淋巴瘤
的治疗提供新的靶点。
7.本发明的技术方案如下：转录因子btb-cnc同源体1（即bach1）在制备治疗非霍奇金淋巴瘤药物中的应用，其氨基酸序列如seq id no. 1所示。
8.本发明包括一种能够治疗非霍奇金淋巴瘤的药物和/或药物组合物，其含有能够抑制bach1表达的抑制物。本发明的抑制物包括但不限于抑制bach1蛋白活性的物质、降低bach1蛋白含量的物质、沉默或敲除或突变bach1基因的物质或者抑制bach1基因表达的物质。药物组合中还以进一步包含可药用载体，以及其他包含bach1抑制剂协同作用的其他非霍奇金淋巴瘤治疗剂。
9.本发明包括bach1抑制物在制备治疗非霍奇金淋巴瘤药物中的应用。本发明通过bach1的rna干扰慢病毒感染非霍奇金淋巴瘤细胞系后，可降低bach1的蛋白表达量，并检测了bach1低表达细胞系与表达量无变化的对照细胞系的细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡情况。结果表明，rna干扰慢病毒感染后，可将bach1的蛋白表达量大约降低90%以上；bach1低表达的两种非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875和rec-1/bach1
kd-875细胞周期分布发生明显变化，细胞增殖显著变少，细胞凋亡明显增加。
10.本发明证明bach1抑制剂在非霍奇金淋巴瘤细胞系中可调控细胞周期、细胞增殖以及细胞凋亡，从而影响肿瘤细胞的生长，为非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了一个新的靶点。
附图说明
11.图1为rna干扰稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞中bach1蛋白量的western blot检测结果；其中，jeko和rec-1细胞对应的第一排为以bach1单克隆抗体为一抗检测bach1蛋白量，第二排为以beta-actin单克隆抗体为一抗检测内参beta-actin蛋白量。其中，#875、#876、#877分别代表用三个不同的rna干扰慢病毒感染人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko和rec-1；con代表用阴性对照慢病毒感染人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko和rec-1。
12.图2为bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko/bach1
con
和rec-1/bach1
con
的生长曲线图；图中设置第0天的细胞计数（1
×
104个）为1倍，计算培养后不同时间点（1、2、3、4、5、6、7、8天）的细胞计数的变化倍数。
13.图3为流式细胞仪检测bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko/bach1
con
和rec-1/bach1
con
的细胞周期分布情况图；图中包括g0-g1、s和g2-m期。
14.图4为流式细胞仪检测bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko/bach1
con
和rec-1/bach1
con
的细胞增殖情况图；图中以对照细胞系为单位“1”将数据进行标准化后进行比较。其中，bach1
kd-875代表bach1低表达稳转非霍奇金淋巴瘤细胞系，bach1
con
代表对照细胞系；**表示p值小于0.001。
15.图5为流式细胞仪检测bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko/bach1
con
和rec-1/bach1
con
的细胞凋亡情况图；图中，7-aad(-)/annexin v( )与7-aad( )/annexin v( )分别表示早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例。其中，bach1
kd-875代表bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系，bach1
con
代表对照细胞系。
具体实施方式
16.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
17.下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值
±
标准差。统计分析采用t检验。*表示p值小于0.05，**表示p值小于0.001。
18.下述实施例中的人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko和rec-1分别购买于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所和北京北纳创联生物技术研究院。并通过细胞str鉴定确认。
19.下述实施例中的bach1的氨基酸序列为序列表中seq id no.1，编码基因序列为序列表中seq id no.2；来源于ncbi数据库。
20.下述实施例中的shrna慢病毒lv-bach1-rnai(875)、lv-bach1-rnai(876)、 lv-bach1-rnai(877)，以及相应的阴性对照慢病毒（不影响bach1的mrna表达量）均为中国上海吉凯基因公司产品。其中，shrna慢病毒lv-bach1-rnai(875)的成熟反义链序列：taatgacacaagcatatgggc（seq id no. 3）；lv-bach1-rnai(876)的成熟反义链序列：tttcttgggcattcttgctgg（seq id no. 4）；lv-bach1-rnai(877)的成熟反义链序列：atatcatggatacaatccagc（seq id no. 5）。
21.下述实施例中的细胞培养条件均为：用含有10% fbs的rpmi-1640培养基在t-25或t-75透气细胞培养瓶、37℃和5% co2条件下培养。
22.实施例1、bach1的rna干扰稳转细胞系构建（1）bach1的rna干扰稳转细胞系的筛选与建立首先用三个不同的shrna慢病毒（875#、876#、877#）及阴性对照慢病毒分别感染人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko和rec-1。
23.具体步骤为：取培养的jeko和rec-1细胞按1
×
106个/孔接种于六孔板，每孔加入3 ml含有10% fbs的rpmi-1640培养基，放置37℃，5% co2细胞培养箱中培养。1小时后取出细胞，加入50 μl病毒液，室温2500 rpm离心1小时，将细胞转移至t-25透气细胞培养瓶中，置于37℃，5% co2细胞培养箱中继续培养24小时。将慢病毒感染后的细胞去除培养基，加入10 ml新鲜的含有10% fbs的rpmi-1640培养基重悬细胞，继续放置37℃，5% co2细胞培养箱中培养。48小时后，将t-25培养瓶中的细胞转移至t-75透气细胞培养瓶中，补充10 ml新鲜的含有10% fbs的rpmi-1640培养基继续培养。24小时后，去除培养基，更换20 ml新鲜培养基重悬细胞，同时加入1 μg/ml嘌呤霉素（puromycin）对细胞株进行筛选，每隔2-3天更换培养基，筛选10-14天。
24.（2）western blot检测rna干扰稳转细胞系中bach1的表达取步骤（1）建立的稳转细胞系jeko/bach1
kd-875、jeko/bach1
kd-876 、jeko/bach1
kd-877 、rec1/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-876、rec-1/bach1
kd-877及各自对应的对照细胞系jeko/bach1
con 和rec-1/bach1
con
提取总蛋白。具体步骤为：90 g离心5分钟收集细胞，用预冷1
×
pbs缓冲液洗两遍，加150～300 μl ripa裂解液，冰上裂解30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟；吸取上清，利用pierce bca法进行蛋白定量；各取10 μg总蛋白进行western blot检测。
25.western blot检测的具体方法为：第一步进行电泳及转膜：对待测蛋白样品进行sds-page电泳，先在电压80v下电泳30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120v继续电泳约1-1.5小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至pvdf膜，400ma，2小时。第二步为封闭膜：用pbs-t溶液洗（1
×
pbs缓冲液中加入2 ml tween-20，定容至1l）pvdf膜10-15分钟。将pvdf膜放入含5％bsa的pbs-t溶液中，室温封闭1小时。第三步为免疫杂交：先进行一抗孵育，将购买于美国santa cruz biotechnology公司的bach1（分子量92kda）单克隆抗体（或购买于美国cell signaling technology公司的beta-actin抗体）按1 : 1000稀释于pbs-t溶液中，4℃冷室中与pvdf膜在摇床上孵育过夜，用5 ml pbs-t溶液洗膜10分钟，重复3次。后进行二抗孵育，将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔igg抗体按1 : 5000稀释在pbs-t溶液中，室温下与pvdf膜在摇床上一起孵育约45分钟，用5ml pbs-t溶液洗膜10分钟，重复3次。第四步为ecl试剂显色：使用ecl蛋白杂交检测试剂盒（美国biorad公司），参照操作说明进行pvdf膜显色反应。
26.结果：如图1所示。采用lenti-bach1-shrna-875#慢病毒感染后建立的稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875与rec-1/bach1
kd-875中bach1的蛋白表达量均明显低于阴性对照慢病毒感染后建立的对照细胞系jeko/bach1
con 和rec-1/bach1
con
。
27.实施例2、bach1低表达的稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系及对照细胞系的生长曲线比较取实施例1中建立的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko-1/bach1
kd-875、rec1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko-1/bach1
con
和rec-1/bach1
con
作为供试细胞，分别培养在1 ml含有普通培养基（含有10% fbs的rpmi-1640培养基）的24孔板中，细胞密度为1
×
104个/孔，分别于培养后不同时间点（1、2、3、4、5、6、7、8天）收集一个孔内的所有细胞进行计数，设置第0天的细胞计数（1
×
104个）为“1”倍，计算培养后不同时间点的细胞计数的变化倍数。
28.结果：图2为bach1低表达的稳转非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875与rec-1/bach1
kd-875和各自对照细胞系jeko/bach1
con 和rec-1/bach1
con
的生长曲线图；可见降低bach1在人非霍奇金淋巴瘤细胞jeko和rec-1中的蛋白表达量后，与对照细胞系相比，细胞生长受到明显的抑制。
29.实施例3、bach1低表达的稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系及对照细胞系的细胞周期比较取实施例1中建立的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko-1/bach1
kd-875、rec1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko-1/bach1
con
和rec-1/bach1
con
作为供试细胞，分别培养在3 ml含有普通培养基（含有10% fbs的rpmi-1640培养基）的6孔板中，细胞密
度为1
×
106个/孔，培养48小时后收获细胞，进行细胞周期检测。检测步骤为：用pbs清洗细胞后，使用70%无水乙醇固定细胞1小时后，去除乙醇并加入1ml pi/rnase staining buffer（美国biosciences公司），室温避光孵育15 分钟后用流式细胞仪进行检测，结果使用flowjo软件进行分析。
30.结果：图3为流式细胞分析检测获得的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875与rec-1/bach1
kd-875和各自的对照细胞系jeko/bach1
con
、rec-1/bach1
con
的细胞周期结果图。bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875在g0-g1期的细胞占总细胞计数的值为58.7%，s期占总细胞计数的值为29.9%，g2-m期细胞占总细胞计数的值为11.3%；其对照细胞系jeko/bach1
con
在g0-g1期的细胞占总细胞计数的值为46.2%，s期占总细胞计数的值为48.4%，g2-m期细胞占总细胞计数的值为4.76%。与之类似，bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系rec-1/bach1
kd-875在g0-g1期的细胞占总细胞计数的值为44.6%，s期占总细胞计数的值为36.4%，g2-m期细胞占总细胞计数的值为19.0%；其对照细胞系rec-1/bach1
con
在g0-g1期的细胞占总细胞计数的值为47.0%，s期占总细胞计数的值为43.8%，g2-m期细胞占总细胞计数的值为9.2%。可见bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞jeko/bach1
kd-875、rec-1/bach1
kd-875与各自的对照细胞系相比，均表现出分布于s期的细胞比例明显减少，而分布于g2-m期的细胞明显增加，说明降低bach1的蛋白表达量可以影响人非霍奇金淋巴瘤细胞的细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的生长。
31.实施例4、bach1低表达的稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系及对照细胞系的细胞增殖比较取实施例1中建立的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko-1/bach1
con
和rec-1/bach1
con
作为供试细胞，分别培养在3 ml含有普通培养基（含有10% fbs的rpmi-1640培养基）的6孔板中，细胞密度为1
×
106个/孔，培养48小时后收获细胞，进行细胞增殖检测。检测使用美国bd biosciences公司的apc brdu flow kit细胞增殖检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行细胞的处理和标记后，用流式细胞仪进行检测，结果使用flowjo软件进行分析。
32.结果：图4为流式细胞分析检测获得的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875
与rec-1/bach1
kd-875
和各自的对照细胞系jeko/bach1
con
的细胞增殖（即分布于s期的细胞）数量为对照细胞系jeko-1/farsa
kd-con
的84%、rec-1/bach1
con
的细胞增殖结果图；以对照细胞系为单位“1”将数据进行标准化后进行比较，结果显示bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875分布于s期的增殖细胞数量的平均值为对照细胞系jeko/bach1
con
的61.8%；另一个bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系rec-1/bach1
kd-875分布于s期的增殖细胞数量的平均值为对照细胞系rec-1/bach1
con
的75.8%。说明减少bach1的蛋白表达量可以显著影响人非霍奇金淋巴瘤细胞的细胞增殖，从而抑制肿瘤细胞生长。
33.实施例5、bach1低表达的稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系及对照细胞系的细胞凋亡比较取实施例1中建立的bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875、rec1/bach1
kd-875及各自的对照细胞系jeko-1/bach1
con
和rec-1/bach1
con
作为供试细胞，分别培养在3 ml含有普通培养基（含有10% fbs的rpmi-1640培养基）的6孔板中，细胞密
度为1
×
106个/孔，培养48小时后收获细胞，进行细胞凋亡检测。细胞凋亡检测试剂盒为美国bd biosciences公司的7-aad/annexin v细胞凋亡试剂盒。按照试剂盒说明书进行细胞的处理和标记后，用流式细胞仪进行检测，结果使用flowjo软件进行分析。
34.结果：如图5所示bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系jeko/bach1
kd-875与对照细胞系jeko/bach1
con
的早期凋亡比例分别为28.2%和4.88%；晚期凋亡比例分别为22.7%和0.62%；总体凋亡比例分别为50.9%和5.5%；另一个bach1低表达稳转人非霍奇金淋巴瘤细胞系rec-1/bach1
kd-875和其对照细胞系rec-1/bach1
con
的早期凋亡比例分别为2.87%和1.47%；晚期凋亡比例分别为1.33%和0.09%；总体凋亡比例分别为4.2%和1.56%。说明减少bach1的蛋白表达量可以显著增加人非霍奇金淋巴瘤细胞的细胞凋亡。
35.以上结果表明，减少或抑制bach1在人非霍奇金淋巴瘤细胞系中的表达量可调控细胞周期、细胞增殖以及细胞凋亡，从而影响肿瘤细胞的生长，可作为非霍奇金淋巴瘤治疗的靶点。