一种杭白菊总多酚的提取方法
(一)技术领域
1.本发明涉及分离提取领域，尤其涉及一种杭白菊总多酚的提取方法。
(二)
背景技术：
2.杭白菊是我国传统的茶用菊，也是菊花茶中最好的一个品种。杭白菊内含多酚、菊甙、氨基酸、黄酮类及多种维生素和微量元素，中华医学研究表明，杭白菊具有养肝明目、清心、补肾、健脾和胃、润喉、生津，以及调整血脂等功效。常饮本品，春暖去湿、夏暑解渴、秋日解燥、冬季清火。更能美容养颜、补血提神，以增强生命之活力，使人延缓衰老，更能使老年人延年益寿，是一种高效超值之保健饮品。
3.近年来有研究表明杭白菊的茎叶中也含有大量功效性成分，可以通过进一步研究，对杭白菊中的多酚类化合物、黄酮类化合物和挥发油类等进行分离提取，将提取物应用于食品、医药、化妆品、饲料添加剂和生物杀虫剂等领域。绿色安全的提取方法是颇受期待的。将连续动态逆流提取、靶向柱分离、纳膜分离等多种分离技术进行系统化集成，实现植物活性成分生产过程的高度集成化，自动化和绿色化。集多种技术和方法于一体进行分离纯化，不仅有效地克服有机溶剂对人类和环境造成的污染，也能提高产物的分离效率和得率。
4.为提高杭白菊中多酚类物质的提取率，本发明将酶法预处理结合连续动态逆流提取、靶向柱分离、纳膜分离等多种分离技术引入农业副产品加工及功能性天然产物提取领域，其实施将有助于降低行业废弃物排放，具有较强的可操作性。
(三)
技术实现要素：
5.本发明目的是提供一种杭白菊总多酚的提取方法，该法提取速度快，效率高，有助于降低行业废弃物排放，具有较强的可操作性。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种杭白菊总多酚的提取方法，所述方法按如下步骤进行：
8.(1)预处理：取杭白菊烘干、粉碎，得杭白菊粉末；将杭白菊粉末加入体积浓度50-70％的乙醇水溶液中，在室温下搅拌充分溶胀杭白菊细胞，调节温度45～65℃之间，ph值在4.0～5.5之间，添加纤维素酶，在45～65℃酶解30-60min后加入柠檬酸，然后在超声波功率为200w、超声波频率为20khz条件下超声提取10-25分钟(优选置于超声波清洗机中超声提取)，获得超声后的物料；
9.(2)连续动态逆流提取：采用罐组式动态提取，将步骤(1)超声后的物料平均加入各个罐中，以体积浓度50-70％乙醇水溶液为溶媒，每罐于40～60℃、40-100rpm提取3次，每次30-40min，提取溶剂沿原料溶质浓度由低向高输送经过各罐并多次套用，每罐重复提取3次，收集每罐第一次提取液，获得逆流提取液；
10.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液减压浓缩回收乙醇，离心(优选5000rpm离心20min)，取上清液，依次进行微滤、超滤，得到滤过液；
11.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离，将步骤(3)滤过液以2-4bv/h(bv为树脂的床体积，bv/h为每小时流出的床体积量)的速度上样，用体积浓度30％-70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为1-3bv/h，洗脱量为均为8-10bv，采用分光光度法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度《5％，获得去除农药残留的浓缩物；
12.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以2-4bv/h的速度上样大孔吸附树脂层析柱，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度60-70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度1-3bv/h，洗脱量8-10bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，获得杭白菊总多酚。
13.进一步，步骤(1)杭白菊包括低档滞销杭白菊、修剪梗叶、碎末。杭白菊烘干、粉碎优选在105℃下烘焙2～4h，粉碎(优选放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末)，过80～120目筛，获得杭白菊粉末。
14.进一步，步骤(1)所述50-70％乙醇水溶液体积用量以杭白菊粉末质量计为6-12ml/g。所述纤维素酶酶活为10000u/g，所述纤维素酶质量添加量为杭白菊粉末重量的0.1-0.3％。所述柠檬酸质量添加量为杭白菊粉末重量的10-20％。
15.进一步，步骤(2)体积浓度50-70％乙醇水溶液体积用量以步骤(1)杭白菊粉末重量计为5-12ml/g，步骤(2)和步骤(1)体积浓度50-70％乙醇水溶液总的体积用量以步骤(1)杭白菊粉末重量计为15-20ml/g。
16.进一步，步骤(2)所述罐组式动态提取方法为：将步骤(1)超声后的物料平均加入各个提取罐中，每罐在40～60℃下提取三次，每次提取时间均为30-40min，搅拌频率为40-100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度50-70％乙醇水溶液作为溶剂，使料液比为1:5～20，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同；将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，即每只提取罐第n次提取所加溶剂均为上一提取罐第n 1次的提取液，每一提取罐每次提取料液比均为1:5～20，液体不足用同浓度的乙醇水溶液补充，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
17.进一步，所述罐组式动态提取设置6个提取罐。
18.进一步，步骤(3)梯度洗脱依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行洗脱。
19.进一步，步骤(3)所述微滤采用孔径0.2～0.45μm的聚砜膜或磺化聚砜膜，在40～50℃下进行微滤。所述超滤采用截留分子量为1～3万的聚醚砜膜，在温度35～45℃、压力0.1-0.5mpa、膜面流速为2～2.5m/s下进行超滤。
20.进一步，步骤(4)所述大孔吸附树脂型号为ads-7、ab-8、lk001、聚酰胺或者d-101。
21.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
22.(1)本发明采用纤维素酶预处理，可以充分水解杭白菊的细胞壁，使得多酚类物质充分释放出来，对比例1是在实施例4基础上，不经过酶解，产量从97.8g降到82.4g。
23.(2)本发明采用动态连续逆流提取技术，通过循环的提取液不断地将有效成分提
取出来，缩短提取周期，并减少溶剂用量，对比例2是在实施例4基础上，由动态逆流提取改为普通罐提取，产量从97.8g降到85.6g。
24.(3)本发明采用微滤、超滤技术进行膜分离，提高其纯度。
25.(4)本发明工艺简单，所用设备简单，试剂易得、安全，生产成本低，易于实现工业化。
(四)具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
27.本发明中若非特指，所有试剂和原料均可从市场购得或本行业常用，所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
28.所述室温是指25-30℃。所述杭白菊是指菊科、茼蒿属、杭菊种，花中含挥发油0.13％、菊甙、腺嘌呤、胆碱、水苏碱及微量维生素a样物质、维生素b、氨基酸及刺槐树碱等。所述低档滞销杭白菊是指一些采摘前就掉落的花和一些比较小的不好卖的等外品。所述杭白菊修剪梗叶是指一些落叶和期间剪掉的一些枝杈。杭白菊碎末是指采摘后分拣包装时剩下的一些废花瓣等。纤维素酶酶活为10000u/g。
29.所述高速多功能粉碎机，fw10001a，常州市金坛友联仪器研究所。所述罐组式动态逆流提取采用6个提取罐，每个提取罐容积为20l。ls-806b专用树脂购自西安蓝深特种树脂有限公司。
30.本发明实施例中总多酚含量的检测采用分光光度法检测765nm处吸光值，以没食子酸为标准品制备标准曲线，曲线方程为y＝0.01x 0.0034，r2＝0.9994，根据曲线方程获得总多酚含量。
31.实施例1
32.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙2h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加6l体积浓度60％乙醇水溶液中，料液比1:6，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，加热温度至45℃，调节ph值4.0，添加1g纤维素酶，在45℃酶解50min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取20分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
33.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在40℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度60％乙醇水溶液1.5l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推到第6提取罐，收集6个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
34.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，先采用孔径0.2μm的聚砜膜在40℃下进行微滤，取微滤液再在温度40℃、压力0.1mpa、膜面流速为2m/s下，采用截留分子量为1万的聚醚砜膜进行超滤，得到滤过液；
35.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以2bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.3％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
36.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ads-7大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度60％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量8bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，获得杭白菊总多酚95.4g。
37.实施例2
38.(1)原料预处理：取杭白菊修剪梗叶，在105℃下烘焙4h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入10l体积浓度50％乙醇水溶液中，料液比1:10，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值5，添加3g纤维素酶，50℃酶解35min后，加入167g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
39.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为30min，搅拌频率为80转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度65％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
40.(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，先采用孔径0.3μm的聚砜膜在40℃下进行微滤，取微滤液再在温度40℃、压力0.25mpa、膜面流速为2.5m/s下，采用截留分子量为2万的聚醚砜膜进行超滤，得到滤过液；
41.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以4bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.6％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
42.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样lk001大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度50％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法检测，获得杭白菊总多酚34.6g。
43.实施例3
44.(1)原料预处理：取杭白菊碎末，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加12l体积浓度70％乙醇水溶液，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度65℃，调节ph值5.5，添加2g纤维素酶，65
℃酶解30min后，加入143g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取20分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
45.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在60℃下提取三次，每次提取时间均为30min，搅拌频率为50转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
46.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的磺化聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2.0m/s下进行超滤，得到滤过液；
47.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以2bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为3bv/h，洗脱量均为10bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.2％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
48.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样聚酰胺大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚97.6g。
49.实施例4
50.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊副产物粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值4.5，添加3g纤维素酶，50℃酶解40min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
51.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
52.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至乙醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
53.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚97.8g。
54.对比例1
55.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞；
56.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)溶胀后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
57.(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
58.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用实施例1所述分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液达到未检出标准，即《10ppb。
59.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚82.4g。
60.对比例2
61.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值4.5，添加3g纤维素酶，50℃酶解40min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
62.(2)提取：将步骤(1)超声后的物料全部加入多功能提取罐(yc-020，上海雅程仪器设备有限公司)中，然后加入8l体积浓度70％乙醇水溶液使料液比为1:20，于50℃提取2h，获得提取液。
63.(3)膜分离：将步骤(2)制备的提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
64.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用实施例1所述分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至乙醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液达到未检出标准，即《10ppb。
65.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚85.6g。
(一)技术领域
1.本发明涉及分离提取领域，尤其涉及一种杭白菊总多酚的提取方法。
(二)
背景技术：
2.杭白菊是我国传统的茶用菊，也是菊花茶中最好的一个品种。杭白菊内含多酚、菊甙、氨基酸、黄酮类及多种维生素和微量元素，中华医学研究表明，杭白菊具有养肝明目、清心、补肾、健脾和胃、润喉、生津，以及调整血脂等功效。常饮本品，春暖去湿、夏暑解渴、秋日解燥、冬季清火。更能美容养颜、补血提神，以增强生命之活力，使人延缓衰老，更能使老年人延年益寿，是一种高效超值之保健饮品。
3.近年来有研究表明杭白菊的茎叶中也含有大量功效性成分，可以通过进一步研究，对杭白菊中的多酚类化合物、黄酮类化合物和挥发油类等进行分离提取，将提取物应用于食品、医药、化妆品、饲料添加剂和生物杀虫剂等领域。绿色安全的提取方法是颇受期待的。将连续动态逆流提取、靶向柱分离、纳膜分离等多种分离技术进行系统化集成，实现植物活性成分生产过程的高度集成化，自动化和绿色化。集多种技术和方法于一体进行分离纯化，不仅有效地克服有机溶剂对人类和环境造成的污染，也能提高产物的分离效率和得率。
4.为提高杭白菊中多酚类物质的提取率，本发明将酶法预处理结合连续动态逆流提取、靶向柱分离、纳膜分离等多种分离技术引入农业副产品加工及功能性天然产物提取领域，其实施将有助于降低行业废弃物排放，具有较强的可操作性。
(三)
技术实现要素：
5.本发明目的是提供一种杭白菊总多酚的提取方法，该法提取速度快，效率高，有助于降低行业废弃物排放，具有较强的可操作性。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种杭白菊总多酚的提取方法，所述方法按如下步骤进行：
8.(1)预处理：取杭白菊烘干、粉碎，得杭白菊粉末；将杭白菊粉末加入体积浓度50-70％的乙醇水溶液中，在室温下搅拌充分溶胀杭白菊细胞，调节温度45～65℃之间，ph值在4.0～5.5之间，添加纤维素酶，在45～65℃酶解30-60min后加入柠檬酸，然后在超声波功率为200w、超声波频率为20khz条件下超声提取10-25分钟(优选置于超声波清洗机中超声提取)，获得超声后的物料；
9.(2)连续动态逆流提取：采用罐组式动态提取，将步骤(1)超声后的物料平均加入各个罐中，以体积浓度50-70％乙醇水溶液为溶媒，每罐于40～60℃、40-100rpm提取3次，每次30-40min，提取溶剂沿原料溶质浓度由低向高输送经过各罐并多次套用，每罐重复提取3次，收集每罐第一次提取液，获得逆流提取液；
10.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液减压浓缩回收乙醇，离心(优选5000rpm离心20min)，取上清液，依次进行微滤、超滤，得到滤过液；
11.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离，将步骤(3)滤过液以2-4bv/h(bv为树脂的床体积，bv/h为每小时流出的床体积量)的速度上样，用体积浓度30％-70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为1-3bv/h，洗脱量为均为8-10bv，采用分光光度法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度《5％，获得去除农药残留的浓缩物；
12.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以2-4bv/h的速度上样大孔吸附树脂层析柱，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度60-70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度1-3bv/h，洗脱量8-10bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，获得杭白菊总多酚。
13.进一步，步骤(1)杭白菊包括低档滞销杭白菊、修剪梗叶、碎末。杭白菊烘干、粉碎优选在105℃下烘焙2～4h，粉碎(优选放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末)，过80～120目筛，获得杭白菊粉末。
14.进一步，步骤(1)所述50-70％乙醇水溶液体积用量以杭白菊粉末质量计为6-12ml/g。所述纤维素酶酶活为10000u/g，所述纤维素酶质量添加量为杭白菊粉末重量的0.1-0.3％。所述柠檬酸质量添加量为杭白菊粉末重量的10-20％。
15.进一步，步骤(2)体积浓度50-70％乙醇水溶液体积用量以步骤(1)杭白菊粉末重量计为5-12ml/g，步骤(2)和步骤(1)体积浓度50-70％乙醇水溶液总的体积用量以步骤(1)杭白菊粉末重量计为15-20ml/g。
16.进一步，步骤(2)所述罐组式动态提取方法为：将步骤(1)超声后的物料平均加入各个提取罐中，每罐在40～60℃下提取三次，每次提取时间均为30-40min，搅拌频率为40-100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度50-70％乙醇水溶液作为溶剂，使料液比为1:5～20，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同；将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，即每只提取罐第n次提取所加溶剂均为上一提取罐第n 1次的提取液，每一提取罐每次提取料液比均为1:5～20，液体不足用同浓度的乙醇水溶液补充，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
17.进一步，所述罐组式动态提取设置6个提取罐。
18.进一步，步骤(3)梯度洗脱依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行洗脱。
19.进一步，步骤(3)所述微滤采用孔径0.2～0.45μm的聚砜膜或磺化聚砜膜，在40～50℃下进行微滤。所述超滤采用截留分子量为1～3万的聚醚砜膜，在温度35～45℃、压力0.1-0.5mpa、膜面流速为2～2.5m/s下进行超滤。
20.进一步，步骤(4)所述大孔吸附树脂型号为ads-7、ab-8、lk001、聚酰胺或者d-101。
21.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
22.(1)本发明采用纤维素酶预处理，可以充分水解杭白菊的细胞壁，使得多酚类物质充分释放出来，对比例1是在实施例4基础上，不经过酶解，产量从97.8g降到82.4g。
23.(2)本发明采用动态连续逆流提取技术，通过循环的提取液不断地将有效成分提
取出来，缩短提取周期，并减少溶剂用量，对比例2是在实施例4基础上，由动态逆流提取改为普通罐提取，产量从97.8g降到85.6g。
24.(3)本发明采用微滤、超滤技术进行膜分离，提高其纯度。
25.(4)本发明工艺简单，所用设备简单，试剂易得、安全，生产成本低，易于实现工业化。
(四)具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
27.本发明中若非特指，所有试剂和原料均可从市场购得或本行业常用，所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
28.所述室温是指25-30℃。所述杭白菊是指菊科、茼蒿属、杭菊种，花中含挥发油0.13％、菊甙、腺嘌呤、胆碱、水苏碱及微量维生素a样物质、维生素b、氨基酸及刺槐树碱等。所述低档滞销杭白菊是指一些采摘前就掉落的花和一些比较小的不好卖的等外品。所述杭白菊修剪梗叶是指一些落叶和期间剪掉的一些枝杈。杭白菊碎末是指采摘后分拣包装时剩下的一些废花瓣等。纤维素酶酶活为10000u/g。
29.所述高速多功能粉碎机，fw10001a，常州市金坛友联仪器研究所。所述罐组式动态逆流提取采用6个提取罐，每个提取罐容积为20l。ls-806b专用树脂购自西安蓝深特种树脂有限公司。
30.本发明实施例中总多酚含量的检测采用分光光度法检测765nm处吸光值，以没食子酸为标准品制备标准曲线，曲线方程为y＝0.01x 0.0034，r2＝0.9994，根据曲线方程获得总多酚含量。
31.实施例1
32.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙2h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加6l体积浓度60％乙醇水溶液中，料液比1:6，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，加热温度至45℃，调节ph值4.0，添加1g纤维素酶，在45℃酶解50min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取20分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
33.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在40℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度60％乙醇水溶液1.5l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推到第6提取罐，收集6个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
34.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，先采用孔径0.2μm的聚砜膜在40℃下进行微滤，取微滤液再在温度40℃、压力0.1mpa、膜面流速为2m/s下，采用截留分子量为1万的聚醚砜膜进行超滤，得到滤过液；
35.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以2bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.3％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
36.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ads-7大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度60％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量8bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，获得杭白菊总多酚95.4g。
37.实施例2
38.(1)原料预处理：取杭白菊修剪梗叶，在105℃下烘焙4h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入10l体积浓度50％乙醇水溶液中，料液比1:10，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值5，添加3g纤维素酶，50℃酶解35min后，加入167g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
39.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为30min，搅拌频率为80转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度65％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
40.(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，先采用孔径0.3μm的聚砜膜在40℃下进行微滤，取微滤液再在温度40℃、压力0.25mpa、膜面流速为2.5m/s下，采用截留分子量为2万的聚醚砜膜进行超滤，得到滤过液；
41.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以4bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.6％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
42.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样lk001大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度50％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法检测，获得杭白菊总多酚34.6g。
43.实施例3
44.(1)原料预处理：取杭白菊碎末，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加12l体积浓度70％乙醇水溶液，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度65℃，调节ph值5.5，添加2g纤维素酶，65
℃酶解30min后，加入143g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取20分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
45.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在60℃下提取三次，每次提取时间均为30min，搅拌频率为50转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
46.(3)膜分离：将步骤(2)逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的磺化聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2.0m/s下进行超滤，得到滤过液；
47.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以2bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为3bv/h，洗脱量均为10bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.2％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
48.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样聚酰胺大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚97.6g。
49.实施例4
50.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊副产物粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值4.5，添加3g纤维素酶，50℃酶解40min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
51.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)超声后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
52.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至乙醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液中农药残留达到未检出标准，即《10ppb。
53.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚97.8g。
54.对比例1
55.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞；
56.(2)连续动态逆流提取：将步骤(1)溶胀后的物料分成6等份，分别加入6只提取罐中，每罐在50℃下提取三次，每次提取时间均为40min，搅拌频率为100转/分钟，第一提取罐第一次提取加入体积浓度70％乙醇水溶液1.33l，第二次和第三次提取分别补加同浓度的乙醇水溶液，总体积与第一次提取相同。将第一提取罐第一次提取的提取液过滤后放入储备罐备用，第二次提取的提取液作为第二提取罐第一次提取的溶剂，提取后将提取液过滤备用，第三次提取的提取液作为第二提取罐第二次提取的溶剂，提取所得提取液作为第三提取罐第一次的提取溶剂，以此类推直到第6罐，收集每个提取罐的第一次提取的提取液，获得逆流提取液。
57.(3)膜分离：将步骤(2)制备的逆流提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
58.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用实施例1所述分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至甲醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液达到未检出标准，即《10ppb。
59.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部乙醇洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚82.4g。
60.对比例2
61.(1)原料预处理：取低档滞销杭白菊，在105℃下烘焙3h，放入高速多功能粉碎机中研磨成粉末，过100目筛，得杭白菊粉末；将1kg杭白菊粉末加入12l体积浓度70％乙醇水溶液中，料液比1:12，在室温下搅拌，充分溶胀杭白菊细胞，温度50℃，调节ph值4.5，添加3g纤维素酶，50℃酶解40min后，加入200g的柠檬酸，然后置于超声波清洗机中超声提取25分钟，超声波功率为200w，超声波频率为20khz，获得超声后的物料；
62.(2)提取：将步骤(1)超声后的物料全部加入多功能提取罐(yc-020，上海雅程仪器设备有限公司)中，然后加入8l体积浓度70％乙醇水溶液使料液比为1:20，于50℃提取2h，获得提取液。
63.(3)膜分离：将步骤(2)制备的提取液旋转蒸发回收乙醇，5000rpm离心20min，取上清液，采用孔径0.45μm的聚砜膜在温度40℃下进行微滤，取微滤液，再采用截留分子量为3万的聚醚砜膜，在温度40℃、压力0.5mpa、膜面流速为2m/s下进行超滤，得到滤过液；
64.(4)去除农药残留：采用ls-806b专用树脂进行柱层析分离(柱子高500mm，直径20mm)，将步骤(3)滤过液以3bv/h的速度上样，依次用体积浓度30％、40％、50％、60％和70％甲醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱速度均为2bv/h，洗脱量均为9bv，采用实施例1所述分光光度法方法检测流出液中多酚的含量，收集多酚质量含量》10％的洗脱液，减压浓缩至乙醇体积浓度1.4％，获得去除农药残留的浓缩液，浓缩液达到未检出标准，即《10ppb。
65.(5)柱层析：将步骤(4)制备的浓缩液，以3bv/h的速度上样ab-8大孔吸附树脂层析柱(20mm
×
500mm)，吸附完成后，先用水洗至下注液接近无色，弃去水洗液，再用体积浓度70％乙醇水溶液洗脱，洗脱速度2bv/h，洗脱量9bv，收集全部洗脱液，减压浓缩至干，采用实施例1方法鉴定，获得杭白菊总多酚85.6g。
再多了解一些
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