芪银三两三用于治疗腹泻的用途的制作方法

1.本发明涉及“芪银三两三”的治疗用途，尤其涉及在治疗吉非替尼相关性腹泻方面的用途。


背景技术：

[0002]“三两三”是民国名医袁国华毕生秘传的民间验方，由宋孝志先生汇总发表，使大众受益，现代应用“三两三”多根据临床辨证在其基础上加味治疗各种疑难杂症，如皮肤病、呼吸性系统疾病如肺纤维化、胃肠道免疫系统疾病如溃疡性慢性结肠炎。其中“芪银三两三”具有益气活血、清热解毒、通络的作用，组成为：生黄芪20-30g、金银花20-30g、全当归20-30g、生甘草6-10g以及蜈蚣1-2g。
[0003]
表皮生长因子受体抑制剂(egfris)相关性腹泻是除皮肤毒性外的最常见不良反应，其发生率甚至高达50％。吉非替尼是临床治疗非小细胞肺癌的一线药，于2005年上市并且于2017年纳入医保，在国内应用广泛。多项临床试验表明吉非替尼的使用可产生多种不良反应，其中腹泻较为常见，严重影响患者生存质量。腹泻还可降低药物的吸收利用，严重者也需暂停抗肿瘤治疗，因此研究腹泻的发生机制并制定合理的管理方案是促进抗肿瘤疗效的一个重要保障。egfris相关的腹泻治疗方案较少，目前临床上主要以日常管理和简单药物治疗为主，药物常用的有洛哌丁胺和益生菌。洛哌丁胺为一种阿片受体激动剂，虽然可以缓解腹泻，但停药后易复发，且单用效果不佳；益生菌可以促进宿主体内的肠道菌群生态平衡，然而有研究对正在应用达克替尼的非小细胞肺癌患者统计腹泻比例，发现应用阿氯米松和益生菌后腹泻并没有得到缓解，表明现有的治疗方案亟需改进。


技术实现要素：

[0004]
一方面，本文提供了芪银三两三在制备用于治疗腹泻的药物中的用途。
[0005]
在一些实施方案中，所述腹泻为表皮生长因子受体抑制剂相关性腹泻。
[0006]
在一些实施方案中，所述表皮生长因子受体抑制剂为吉非替尼。
[0007]
另一方面，本文提供了芪银三两三在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途，其中所述药物还包括表皮生长因子受体抑制剂。
[0008]
在一些实施方案中，所述表皮生长因子受体抑制剂为吉非替尼。
[0009]
另一方面，本文提供了药物组合，其包括芪银三两三和表皮生长因子受体抑制剂。
[0010]
在一些实施方案中，所述表皮生长因子受体抑制剂为吉非替尼。
[0011]
另一方面，本文提供了在受试者中治疗腹泻的方法，其包括以治疗有效量的芪银三两三向所述受试者给药。
[0012]
在一些实施方案中，所述腹泻为表皮生长因子受体抑制剂相关性腹泻。
[0013]
在一些实施方案中，所述表皮生长因子受体抑制剂为吉非替尼。
[0014]
在一些实施方案中，所述受试者为大鼠，芪银三两三的每日给药量不低于8g/kg；或者所述受试者为人，芪银三两三的每日给药量不低于0.3g/kg。
[0015]
另一方面，本文提供了在受试者中治疗非小细胞肺癌的方法，其包括同时地、依序地或分别地以治疗有效量的1)表皮生长因子受体抑制剂；和2)芪银三两三向所述受试者合给药。
[0016]
在一些实施方案中，所述芪银三两三改善所述表皮生长因子受体抑制剂在所述受试者中引起的腹泻。
[0017]
在一些实施方案中，所述表皮生长因子受体抑制剂为吉非替尼。
[0018]
在一些实施方案中，所述芪银三两三通过改变所述受试者中il-34、il-7r、il-1rn、cxcr6和/或ccl25的基因表达而起作用。
[0019]
另一方面，本文提供了制备腹泻动物模型的方法，其包括以吉非替尼向bn大鼠给药。
[0020]
在一些实施方案中，所述吉非替尼的给药剂量为37.5mg/kg/d。
[0021]
本文提供了“芪银三两三”在治疗腹泻中的用途，尤其是“芪银三两三”治疗吉非替尼相关性腹泻的用途。“芪银三两三”具有益气活血、清热解毒、通络的功效，在止泻同时又不致便秘，是预防和辅助治疗egfris相关性腹泻的可行药物。
附图说明
[0022]
图1为实验流程图，其中“qysls”指芪银三两三。
[0023]
图2为实验动物整体状态曲线。(a)各组大鼠体重变化趋势，(b)各组大鼠每天进食量趋势，(c)各组大鼠生存率。“*”指与模型组相比，***p《0.005，****p《0.001；“#”指与空白组相比，##p《0.01(n≥4)。
[0024]
图3显示了实验动物腹泻状况结果。(a)给药7天各组大鼠腹泻程度，即粪便评分，(b)给药28天各组大鼠腹泻程度，即粪便评分。“*”指与模型组相比，*p《0.05，****p《0.001(n＝6)。
[0025]
图4显示了实验动物结肠组织he染色结果。放大倍数为40倍，黄色星号代表结肠黏膜受损部位，黄色箭头指向毛细管充血部位，n＝3，bar＝50μm。
[0026]
图5显示了实验动物结肠组织pas染色结果。(a)pas染色照片，放大倍数为40倍，黄色箭头指向的粉色圆形或椭圆形细胞即杯状细胞，n＝3，bar＝50μm。(b)使用image j统计每个腺体中杯状细胞面积占比的平均值。“*”指与模型组相比，**p《0.01，****p《0.001)。
[0027]
图6显示了实验动物结肠差异表达基因测序结果。(a)模型组和空白组相比差异基因火山图，(b)中药高剂量组和模型组相比差异基因火山图，(c)两两比较差异基因的交叉基因数量的韦恩图。up：上调基因；down：下调基因；no-degs(no-differentially expressed genes)：无差异基因。
[0028]
图7显示差异表达基因的kegg pathway富集分析结果。(a)细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)信号通路相关交叉差异基因韦恩图，(b)聚类分析热图，(c)差异基因富集相关的kegg pathway。
[0029]
图8显示了实验动物结肠组织中ccl25蛋白表达情况。(a)各组大鼠结肠组织中ccl25免疫组化结果照片，(b)阳性信号统计结果图：使用image j统计棕色颗粒的面积占比。n＝3，bar＝50μm，“*”指与模型组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.005。
[0030]
图9显示了实验动物结肠组织中中性粒细胞检测结果。(a)各组大鼠结肠组织中中
性粒细胞募集情况免疫组化结果照片，(b)阳性信号统计结果图：使用image j统计棕色颗粒的面积占比。n＝3，bar＝50μm，“*”指与模型组相比，*p《0.05，**p《0.01。
[0031]
图10显示了实验动物结肠组织中巨噬细胞检测结果。(a)各组大鼠结肠组织中巨噬细胞募集情况免疫组化结果照片，(b)阳性信号统计结果图：使用image j统计棕色颗粒的面积占比。n＝3，bar＝50μm，“*”指与模型组相比，*p《0.05。
[0032]
图11显示了实验动物结肠组织中tnf-α蛋白检测结果。(a)各组大鼠结肠组织中tnf-α免疫组化结果照片，(b)阳性信号统计结果图：使用image j统计棕色颗粒的面积占比。n＝3，bar＝50μm，“*”指与模型组相比，***p《0.005。
具体实施方式
[0033]
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0034]“芪银三两三”为中医民间验方，其组成为生黄芪20-30g、金银花20-30g、全当归20-30g、生甘草6-10g和蜈蚣1-2g。在一个具体实例中，可采用如下组成：生黄芪30g、金银花30g、全当归30g、生甘草10g和蜈蚣1条(通常为1-2g)。芪银三两三可以多种形式存在，例如粉末、颗粒或混悬液等，可自行配制或从市场购得。芪银三两三给药方式可为胃肠内给药，例如口服。
[0035]“表皮生长因子受体抑制剂(egfri)”指可抑制表皮生长因子受体(egfr)功能的分子，包括egfr单克隆抗体和低分子量酪氨酸激酶抑制剂等。低分子量酪氨酸激酶抑制剂主要通过与egfr胞内酪氨酸激酶结构域上atp位点竞争性结合，从而抑制egfr激酶活性、阻断egfr下游信号通路，达到促进细胞凋亡、抑制肿瘤生长转移等效果。常见的egfri包括吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼以及奥希替尼。
[0036]“表皮生长因子受体抑制剂相关性腹泻”指在以表皮生长因子受体抑制剂(如吉非替尼)向受试者给药过程中或之后出现的腹泻。
[0037]
在一些实施方案中，诸如吉非替尼或芪银三两三的药物活性成分可以单独使用，或者与药学上可接受的载体配制为药物组合物后使用。
[0038]“药学上可接受的载体”指对于动物体或人体而言，可以安全地给药的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于对人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性成分的活力。依照给药途径的不同，可以采用本领域众所周知的各种不同的载体。常用的给药途径例如包括口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等。常用的载体包括，但不限于，糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油(例如蓖麻油)、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。药物组合物可以制备为任何临床上可接受的剂型，例如片剂、颗粒、粉末、胶囊、注射制剂、栓剂、滴眼液、外贴药膏、软膏、药油、或喷雾剂，等等。
[0039]“药物组合”指两种或更多种药物活性成分的组合。就包括两种药物活性成分的药物组合来说，其不仅包括这两种药物活性成分共存于同一药物制剂(例如药物组合物)中，还意味着这两种药物活性成分可以作为分开的药物制剂存在于同一药物试剂盒中，或甚至这两种药物活性成分可以作为分开的药物制剂存在于不同的药物试剂盒中。实际上，只要
通过给药使得这两种药物活性成分能够在某个时间同时存在于受试者体内，则这种给药方式就采用了这种“药物组合”。在大多数情况下，当将两种药物活性成分构成药物组合并联合给药，是因为这两种药物活性成分在受试者体内会产生协同作用。这种协同作用包括联合给药产生的药效优于任何一种药物活性成分单独给药，一种药物活性成分可以降低另一种药物活性成分的副作用，或者两种药物活性成分联合给药产生了新的功效。换言之，药物组合不仅包括药物组合物形式，还包括在受试者体内可能出现不同药物活性成分能够共存的其他形式。在一些实施方案中，药物组合为药物组合物形式，例如，表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三存在于同一药物制剂中，用于同时给药。在另一些实施方案中，药物组合为非药物组合物形式，例如，表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三存在于不同的药物制剂中。在一些情形下，表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三可作为单独的药物制剂存在于同一药物试剂盒中，例如表皮生长因子受体抑制剂以口服片剂存在，而芪银三两三口作为用于口服的颗粒剂存在。在另一些情形下，表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三各自作为独立的药物试剂盒存在，但是由于这二者联合给药，在受试者体内出现表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三共存的情况。
[0040]
这里所用的“联合给药”，例如对于表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三而言，其包括表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三顺序地分别给药，还包括表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三以分开的药物制剂形式同时给药。在顺序给药的实施方案中，表皮生长因子受体抑制剂和芪银三两三至少在部分时间上共存于受试者体内。在联合给药的一些实施方案中，芪银三两三可改善表皮生长因子受体抑制剂在受试者体内引起的腹泻。
[0041]“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病(例如肺癌或腹泻)的个体，或者，在预测患病风险时“受试者”也可能包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。在本发明的大多实施方案中，受试者为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。
[0042]“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的的量，可通常由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。当用于预防目的时，“治疗有效量”也可以认为是“预防有效量”。例如，典型的日剂量范围可以为受试者每kg体重0.01μg至100mg或更多药物活性成分。在一个具体实例中，对于实验动物如大鼠，芪银三两三的每日给药量不低于2g/kg，优选不低于4g/kg，更优选不低于8g/kg。在另一个实例中，对于人患者，芪银三两三的每日给药量不低于0.3g/kg，例如约0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2、3、或5g/kg，可以每天给药一次或更多次。
[0043]
本发明提供了芪银三两三用于治疗腹泻的用途，尤其是治疗表皮生长因子受体抑制剂(如吉非替尼)引起的腹泻。本发明还提供了利用芪银三两三来治疗腹泻的方法，尤其是是治疗表皮生长因子受体抑制剂(如吉非替尼)引起的腹泻。本发明还提供了包括芪银三两三和表皮生长因子受体抑制剂(如吉非替尼)的药物组合(或药物组合物)，其中芪银三两三可改善表皮生长因子受体抑制剂引起的腹泻。本文还提供了制备腹泻动物模型的方法，包括以吉非替尼向bn大鼠给药。
[0044]
本发明的一些实施方案至少部分地基于我们通过动物实验意外地发现芪银三两三具有改善腹泻的作用。以下通过实施例对这些动物实验进一步详细说明。
[0045]
实施例
[0046]
1材料与方法：
[0047]
1.1材料
[0048]
1.1.1动物
[0049]
雌性bn大鼠(120-160g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0050]
1.1.2药物
[0051]
吉非替尼(gefitinib，原料药)购自美国ark pharm.公司(货号：ak-72948)，分子量为446.90，纯度≥98％；中药复方颗粒剂芪银三两三购于北京中医药大学东直门医院(其组成为生黄芪20-30g、金银花20-30g、全当归20-30g、生甘草6-10g、蜈蚣1-2g以及制备颗粒剂所必需的辅料)。
[0052]
1.1.3试剂与仪器
[0053]
4％免疫组化固定液(北京兰博利德商贸有限公司p4500-500 ml)
[0054]
苏木素染液(武汉赛维尔生物科技有限公司g1004-500 ml)
[0055]
伊红染液(武汉赛维尔生物科技有限公司g1001-500 ml)
[0056]
糖原pas染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司g1281)
[0057]
pbs缓冲液粉末(北京中杉金桥生物技术有限公司zli-9062)
[0058]
柠檬酸盐修复液(北京中杉金桥生物技术有限公司zli-9065)
[0059]
中性树胶(北京酷来搏科技有限公司cn7750-100 ml)
[0060]
anti-ccl25抗体(北京博奥森生物技术有限公司bs-5093r)
[0061]
anti-tnf-α抗体(美国novus公司nb600-587)
[0062]
anti-cd68抗体(美国abcam公司ab201340)
[0063]
anti-myeloperoxidase抗体(美国abcam公司ab208670)
[0064]
兔二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司pv-9001)
[0065]
鼠二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司pv-9001)
[0066]
浓缩型dab试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司zli-9017)
[0067]
电子天平(上海花潮实业有限公司htp312)
[0068]
分析天平(德国赛多利斯cp324s)
[0069]
恒温烘箱(德国美墨尔特if110)
[0070]
切片机(德国徕卡rm2255)
[0071]
超分辨显微组织成像系统(德国徕卡aperio versa)
[0072]
恒温烘箱(德国美墨尔特if110)
[0073]
切片机(德国徕卡rm2255)
[0074]
超分辨显微组织成像系统(德国徕卡aperio versa)
[0075]
1.2方法
[0076]
1.2.1分组：
[0077]
将bn大鼠分为5组，每组6只：空白组(蒸馏水)，模型组(吉非替尼临床剂量1.5倍，37.5mg/kg/d)，中药低剂量组(临床剂量等倍，吉非替尼37.5mg/kg/d 芪银三两三2g/kg/d)，中药中剂量组(临床剂量两倍，吉非替尼37.5mg/kg/d 芪银三两三4g/kg/d)和中药高剂量组(临床剂量四倍，吉非替尼37.5mg/kg/d 芪银三两三8g/kg/d)。大鼠给药剂量为按照人临床剂量的约6倍换算。
[0078]
1.2.2模型制备与给药
[0079]
除空白组给予蒸馏水外，模型组和三个中药组均每日上午9时灌胃给药吉非替尼，中药干预组同时每日下午3时灌胃给药芪银三两三(模型组给予蒸馏水)，整个周期为33天(图1)。称量250mg吉非替尼溶于20ml蒸馏水中，配成浓度为12.5mg/ml的混悬液，每天现用现配；称量19.2g中药复方颗粒溶于热水中，使母液终体积为24ml(高剂量)，再将其等倍稀释为中剂量和低剂量。所有动物在给药前都对背部做了剃毛处理。
[0080]
1.2.3检测指标
[0081]
1.2.3.1整体状态指标：在给药过程中，对各组大鼠每3天称量一次体重；分别于给药前、给药6天、18天、30天称量各组大鼠食物重量；计算每只大鼠每天的进食量；每日统计各组大鼠生存率。
[0082]
1.2.3.2腹泻指标：根据“布里斯托粪便量表”，分别在给药第7天和28天对各组大鼠腹泻程度评分。
[0083]
1.2.3.3结肠粘膜指标：动物给药周期结束后，麻醉取材，取结肠组织制备石蜡切片进行常规的he染色和pas染色。
[0084]
1.2.3.4炎症因子指标：动物给药周期结束后，麻醉取材，取部分结肠组织冻存至-80℃进行基因测序分析，部分结肠组织制备石蜡切片进行常规免疫组化。
[0085]
1.2.3.5炎症细胞指标：动物给药周期结束后，麻醉取材，取结肠组织制备石蜡切片进行免疫组化包括巨噬细胞和中性粒细胞的检测。
[0086]
1.2.4统计学方法
[0087]
采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析，结果用平均值
±
标准误(mean
±
sem)表示。计量资料满足正态分布及方差齐性，选择单因素方差分析(one-way anova)或多因素方差分析(two-way anova)；当方差不齐时，采用dunnett’s t3检验。不满足正态分布时，则采用非参数检验。p《0.05即为具有统计学差异
[0088]
1.3结果
[0089]
1.3.1“芪银三两三”改善bn大鼠整体状态
[0090]
实验动物体重变化如图2a所示，空白组体重平稳上升，模型组体重与空白组相比显著下降(p《0.001)；模型组和各给药组体重生长缓慢甚至下降，与模型组相比，中药低剂量组、中剂量组无明显差异，高剂量组体重显著上升，具有统计学意义(p《0.005)。进食量差异如图2b所示，给药6天时模型组及各中药组进食量稍低于空白组；给药18天时，模型组、中药低剂量组、中剂量组、高剂量组进食量均明显低于空白组；而给药30天时，中药高剂量组进食量与空白组差异不大，其他各组均显著降低。生存率差异如图2c所示，模型组及中药低剂量组在给药28天时分别死了一只，给药30天时又分别死了一只(p《0.01)，空白组、中药中剂量组和高剂量组大鼠无死亡情况。
[0091]
1.3.2“芪银三两三”改善吉非替尼相关的bn大鼠腹泻
[0092]
实验动物腹泻状况如图3所示，给药7天时，各给药组均发生腹泻，其中模型组与空白组相比具有显著性差异(p《0.05，图3a)。给药28天时，模型组、中药低剂量组均发生严重腹泻，但中药中、高剂量组腹泻程度趋于缓和，其中中药高剂量组与模型组相比具有统计学差异(p《0.001，图3b)。
[0093]
1.3.3“芪银三两三”改善吉非替尼相关的肠道粘膜受损
[0094]
腹泻的发生常常伴随肠黏膜损伤、坏死，通过对结肠组织he染色的病理结果分析，发现模型组和中药低剂量组大鼠结肠黏膜结构破坏严重、毛细管充血，柱状上皮细胞受损，中药中剂量组、高剂量组结肠组织黏膜层结构有一定的恢复、毛细管充血不明显，且高剂量组上皮细胞排列较为整齐(图4)。对各组大鼠结肠组织进行pas染色(杯状细胞：一种粘液分泌细胞，具有保护黏膜上皮的作用。杯状细胞中含有大量的粘多糖，组织溶于水后会使细胞呈空泡样，因此采用糖原染色法可以使杯状细胞表现为红色或粉红色)。实验结果显示空白组结肠组织肠腺中含有大量杯状细胞，模型组杯状细胞不明显且形态较小，中药中剂量组和高剂量组杯状细胞数量增多，且高剂量组细胞形态有恢复正常的趋势(p《0.01)(图5a和图5b)。
[0095]
1.3.4“芪银三两三”改善吉非替尼相关的肠道炎症
[0096]
首先对结肠组织进行mrna-seq全转录组高通量测序，一共检测了三个组，分别为空白组(control，4个样本)、模型组(model，4个样本)、中药高剂量组(treatment，4个样本)。12个样本一共检测到19789个基因，火山图结果显示两两比较差异基因分别为control-vs-model(下调基因2242个，上调基因2603个，总共4845个)(图6a)，model-vs-treatment(下调基因310个，上调基因375个，总共685个)(图6b)，韦恩图分析显示交叉的差异基因有504个(图6c)。
[0097]
目前对于egfris相关的不良反应中，细胞因子的异常表达一直为研究热点。有研究报道肠上皮的伤口愈合通过多种因子调节如细胞因子、生长因子、调节肽、饮食因素等，同时也有研究表明细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路可作为肠损伤的通路指标。因此通过分类kegg pathway分析，选择细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路作为靶向通路(表1)，进而选择靶向基因。采用韦恩图分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路相关的基因分别有control-vs-model(63个)，model-vs-treatment(13个)，交叉的差异基因有9个(图7a)，具体差异基因名称及差异值见表2，其中il-34、il-7r、il-1rn、cxcr6、ccl25均为与炎症及炎症细胞密切相关的因子。通过进一步对空白组、模型组、中药高剂量组做聚类分析，结果显示中药高剂量组和空白组基因表达的相关性高于模型组(图7b)。通过kegg pathway进一步分析这67个细胞因子信号富集情况(图7c)，可以看到趋化因子信号通路(chemokine signaling pathways)、tnf信号通路(tnf signaling pathways)以及肠免疫网络信号通路(intestinal immune network for iga production)均有涉及。
[0098]
表1分类kegg pathway
[0099][0100]
表2细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路交叉差异基因
[0101][0102]
注：log值为正值代表上调，log值为负值代表下调，q值越低代表差异越显著。粗体标记为所选靶向基因。
[0103]
mrna-seq全转录组测序的结果显示“芪银三两三”改善吉非替尼相关的bn大鼠腹泻的靶基因为il-34、il-7r、il-1rn、cxcr6、ccl25，作用分别为上调il-34的表达，下调il-7r、il-1rn、cxcr6和ccl25的表达。基因测序的方法更全面的检测了空白组、模型组、中药高剂量组的基因表达差异，为研究egfris相关腹泻的机制及“芪银三两三”改善腹泻的机制提供了良好的思路。有研究表明ccl25/ccr9信号通路与炎性疾病如胃十二指肠炎和结肠炎有关，并且ccl25在两两比较的q值中差异均较为显著，因此采用免疫组化的方法验证ccl25在各组大鼠结肠组织中的表达差异情况。结果显示模型组结肠组织中ccl25的表达显著高于空白组(p《0.005)，与模型组相比中药中剂量组和中药高剂量组ccl25的表达降低，且具有显著性差异(分别为p《0.05和p《0.01)(图8a和图8b)。
[0104]
1.3.5“芪银三两三”改善吉非替尼相关的炎症细胞募集
[0105]
结肠组织测序结果中il-1rn和cxcr6的异常表达与中性粒细胞密切相关，有文献报道化疗药可使小肠组织中性粒细胞大量浸润，但目前关于egfris是否会使结肠组织中性粒细胞募集尚不清楚，因此采用免疫组化的方法检测各组大鼠结肠组织中中性粒细胞标记物中性粒细胞过氧化物酶(myeloperoxidase)的表达情况。结果显示模型组中性粒细胞过氧化物酶的表达显著高于空白组(p《0.01)，与模型组相比中药中剂量组和高剂量组中性粒细胞过氧化物酶的表达显著降低(分别为p《0.05和p《0.01)，且具有剂量依赖性(图9a和图9b)。
[0106]
测序的结果中炎症因子il-34、il-7r和趋化因子cxcr6、ccl25的表达异常与巨噬细胞紧密相关，且有文献报道化疗药可促进小肠组织巨噬细胞大量募集，但目前关于egfris是否会促进结肠组织巨噬细胞募集尚不清楚。因此采用免疫组化的方法检测各组大鼠结肠组织中巨噬细胞标记物cd68的表达情况，结果显示，模型组结肠组织中cd68的表达显著高于空白组(p《0.05)，与模型组相比中药中剂量组和高剂量组cd68的表达降低，其中高剂量组与模型组相比具有显著性差异(p《0.05)(图10a和图10b)。tnf-α是活化巨噬细胞
的一种产物，扩大炎症效应，在多种炎症性肠病的发生中起关键作用，因此检测了各组大鼠结肠组织中tnf-α的表达是否有差异。结果显示模型组tnf-α的表达显著高于空白组(p《0.005)，与模型组相比中药高剂量组tnf-α的表达显著降低(p《0.005)，且具有剂量依赖性(图11a和图11b)。
[0107]
目前关于egfris相关性腹泻的研究较少，且治疗方法具有一定的局限性。实验前期选择了两种小鼠，c57bl/6和fvb/n，发现即使达到临床剂量的6倍，也没有出现腹泻(可能有肠道毒性，但是没有出现腹泻的表型)，所以之后又选择了bn大鼠，选用的是临床等倍剂量(22.5mg/kg/d)，在造模前一周发现吉非替尼会使大鼠的粪便偏软，出现了轻微的腹泻，所以为了使腹泻表型更明显，在后面的正式实验中选择了临床1.5倍剂量(37.5mg/kg/d)造模，出现了明显的腹泻表型。我们建立的吉非替尼相关的腹泻动物模型与文献现有的所依靠提高剂量导致腹泻的模型具有一定的区别，本发明中模型的造模剂量更接近临床剂量，研究更有意义。中医具有整体调节的优势，验方“芪银三两三”可能通过调节患者气虚、热毒停聚的症状发挥治疗腹泻的作用。
[0108]
之前文献中所报道的治疗egfris相关性腹泻的中药配方大部分为临床个案的报道，还没有深入的机制研究，且处方组成较为复杂。本发明中采用的芪银三两三只由5味中药组成，首次应用中医辨证的思路，结合现代应用技术，研究其发挥治疗egfris相关性腹泻的机制，并从炎症因子和炎症细胞的相互影响关系出发，阐释发挥药效的独特性，为发展中医药提供了新的思路。