环状RNACwc27下调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用的制作方法

环状rna cwc27下调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及环状rnacwc27(circular rna cwc27，简称circcwc27)及其类似物作为阿尔茨海默病治疗和/或预防的核苷酸药物的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种最常见的神经变性疾病，因其高患病率、高致残率及高死亡率而成为当今社会中一种严重影响人类健康的重大疾病。现有的研究发现ad的主要病理学改变表现为β-淀粉样蛋白(aβ)聚集形成的老年斑(sp)、tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(nft)及脑内神经元的大量丢失。针对ad，临床上至今还缺乏有效的早期诊断手段和治疗措施。在发达国家和我国，ad已成为继心脏病、癌症和卒中之后人类的第4位死因。目前，ad的发病机制依然不清楚，但是普遍认为淀粉样前体蛋白降解通路的激活，导致aβ产生异常增加和聚集，是导致ad发生的关键因素。因此阐明ad发病机制和寻找新型的治疗策略及靶点成为目前急需解决的关键所在。
3.环状rna(circrna)是一类不具有5’端帽子结构和3’端poly a尾结构，以共价键形成环状结构的内源性非编码rna分子。其可以来源于编码基因的外显子或内显子。20世纪70年代，科学家们在针对rna病毒的研究中首次发现了circrna的存在，之后通过rna测序技术和生物信息学的帮助，大量circrna分子陆续被发现。最开始的研究认为circrna是rna剪切形成的副产物，但近年来科学家们逐渐发现由于circrna存在保守性、稳定性、以及表达特异性等特征，使得其具有重要的研究价值。最近的研究表明，分布于核内的circrna能调节其亲本基因的转录，胞质内的circrna能够充当mirna的海绵，rna结合蛋白的隔绝子等，甚至发现小部分circrna也能翻译蛋白质。近年来，国际上对于circrna在ad发病作用的研究日渐增多，目前国内外研究主要集中在circrna表达谱的建立以寻找在ad中异常表达的circrna，而对于这些异常表达的circrna在ad中的功能角色方面的研究还少见报道。在中枢神经系统中，circcwc27的作用依然并不清楚。同时经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关circrna(包括circcwc27)与ad治疗的研究报道。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于提供环状rnacwc27靶点或基于环状rnacwc27靶点的药物在治疗和/或预防阿尔茨海默病中的应用。
5.第一方面，本发明提供环状rnacwc27下调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，其中所述环状rnacwc27下调剂为环状rnacwc27抑制剂和/或环状rnacwc27修饰物。
6.所述环状rnacwc27下调剂能够通过抑制pur-α入核，从而降低aβ前体蛋白app的转录水平，减少app蛋白的表达水平，改善学习和记忆能力，具有治疗ad的临床应用前景。
7.所述环状rnacwc27下调剂为：包括如seq id no.1所示的碱基序列的rna片段；包
括与如seq id no.2所示的碱基序列互补的碱基序列的rna片段；基于seq id no.3经过取代、缺失或者添加一个或多个核苷酸的环状rnacwc27修饰物；或者能够抑制环状rnacwc27表达的多肽、蛋白质或者化合物。其中，seq id no.1是环状rnacwc27的下调剂的核苷酸序列，seq id no.2是环状rnacwc27接头处的核苷酸序列，seq id no.3是环状rnacwc27自身的核苷酸序列。
8.circcwc27在小鼠、大鼠和人脑内的序列高度保守，基本均包含如seq id no.3所示的碱基序列，针对circcwc27在小鼠上取得的研究成果更具有临床转化意义，因此circcwc27可作为阿尔茨海默病的治疗和/或预防的可靠靶点。
9.较佳地，所述环状rnacwc27修饰物是通过对环状rnacwc27进行如下修饰中的至少一种而得：任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰、任意核苷酸的增减、替换。
10.较佳地，所述药物包括环状rnacwc27下调剂、以及药学上可接受的载体或辅料。
11.第二方面，本发明提供环状rnacwc27作为靶点在开发、筛选或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
12.第三方面，本发明提供环状rnacwc27作为靶点在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的筛药模型中的应用。
13.第四方面，本发明提供一种筛选预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物的方法，所述方法包括：用候选物质处理表达环状rnacwc27表达的体系；和检测所述体系中环状rnacwc27的表达；若环状rnacwc27的表达降低，则表明该候选物质是预防和/或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。
附图说明
14.图1示出在app/ps1小鼠皮层、海马及ad患者血浆内circcwc27水平，其中a为app/ps1及对照野生型小鼠皮层内各circrna的表达水平，b为app/ps1及对照野生型小鼠海马内各circrna的表达水平；c为ad患者及健康对照者血浆内circcwc27水平；从图1可以看出在ad患者血浆和app/ps1小鼠脑组织内的circcwc27水平显著升高。
15.图2示出circcwc27干扰病毒对app/ps1小鼠脑内app蛋白表达的影响；其中a为app/ps1小鼠注射circcwc27干扰病毒或对照病毒后海马内app蛋白的电泳图，b为a中app蛋白表达量的统计图；从图2可以看出circcwc27干扰病毒能够显著降低app/ps1小鼠脑内app蛋白的表达。
16.图3示出ad模型小鼠app/ps1经脑立体定位注射补充circcwc27干扰病毒lv-sh-circcwc27两月后的学习和记忆能力，其中a是治疗组与对照组小鼠寻找目标象限潜伏时间，b是治疗组与对照组小鼠寻找目标象限时间的曲线下面积，c是治疗组与对照组小鼠的游泳速度，d是治疗组与对照组小鼠在目标象限的停留时间，e是治疗组与对照组小鼠的运动轨迹图；从图3可以看出，与对照组相比，处理组学习和记忆能力显著提高。
17.图4示出ad模型小鼠app/ps1经脑立体定位注射补充circcwc27干扰病毒lv-sh-circcwc27两月后淀粉样蛋白病理情况，其中a为app/ps1小鼠注射circcwc27干扰病毒或对照病毒后海马及皮层内淀粉样斑块的萤光图，b为a图中淀粉样斑块沉积的统计图；从图4可
以看出，与对照组相比，定位注射补充circcwc27干扰病毒后ad模型小鼠的淀粉样蛋白病理出现显著缓解。
具体实施方式
18.以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
19.本发明人经研究发现，非编码rna环状rna cwc27(简称circcwc27，其碱基序列如seq id no.3所示。在阿尔茨海默病患者和模型小鼠脑组织中表达显著升高，并参与脑内淀粉样蛋白病理的产生。针对ad模型小鼠脑内给予circcwc27干扰病毒可以显著缓解脑内淀粉样蛋白病理的发生，改善小鼠学习和记忆能力，表明circcwc27具有治疗ad的临床应用前景，由此完成本发明。
20.在此公开了circcwc27下调剂在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
21.术语“预防疾病”例如是指在可能暴露或预先处置于疾病但尚未经历或显示疾病症状的哺乳动物中使疾病临床症状不发展。
22.术语“治疗疾病”可指抑制疾病，例如阻止或降低疾病或其临床症状的发展，或者缓解疾病，例如使疾病或其临床症状退化。
23.circcwc27下调剂包括能够降低circcwc27水平的物质。所述环状rnacwc27下调剂为环状rnacwc27抑制剂和/或环状rnacwc27修饰物。例如circcwc27的干扰rna(包括如seq id no.1所示的碱基序列的rna片段。
24.circcwc27抑制剂的一个示例包括其核苷酸序列上具有与circcwc27接头互补的核苷酸序列，即、包括与如seq id no.2所示的碱基序列互补的碱基序列的rna片段。
25.circcwc27修饰物是指基于circcwc27的核苷酸序列设计核酸序列及其修饰物，例如基于seq id no.3经过取代、缺失或者添加一个或多个核苷酸的环状rnacwc27修饰物。所述修饰包括任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合或任意核苷酸的增减、替换。只要修饰后的核苷酸序列能满足降低circcwc27类似的功能活性。
26.另外，应理解，circcwc27下调剂也包括能够降低circcwc27活性和稳定性的物质、能够降低circcwc27有效作用时间的物质。例如，circcwc27下调剂还包括其他能够抑制环状rnacwc27表达的多肽、蛋白质或者化合物。
27.在此公开了circcwc27下调剂在抑制ad脑内淀粉样蛋白病理的效应，应用circcwc27下调剂能够有效抑制ad模型小鼠病理表型的进展，提高学习和记忆能力。研究发现，circcwc27在ad患者外周血浆及app/ps1小鼠脑组织显著升高。针对ad模型小鼠，通过脑内抑制circcwc27，能够显著减少aβ前体蛋白app和关键裂解酶bace1的表达水平，从而抑制aβ的产生和淀粉样蛋白病理的产生。本发明所述的应用中可为制备治疗阿尔茨海默病的一种核苷酸类似物的药物。
28.circcwc27下调剂能够降低app和bace1转录水平，抑制淀粉样前体蛋白途径，作为新型的核苷酸药物。
29.针对ad动物模型app/ps1小鼠，通过脑内注射circcwc27干扰慢病毒作为治疗药物，结果证明，抑制circcwc27能够显著减少aβ的产生和淀粉样蛋白病理的形成，促进学习
和记忆能力的缓解。
30.circcwc27可以作为靶点，用于开发、筛选或制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。可以将circcwc27作为作用对象，对候选物质进行筛选。筛选出的能够降低circcwc27表达、抑制circcwc27活性和稳定性、和/或减少circcwc27有效作用时间的物质可以作为备选的预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。
31.可以建立一种以circcwc27为靶点的筛药模型来筛选以circcwc27为作用对象的药物。
32.一实施方式中，用候选物质处理表达circcwc27的体系，检测所述体系中circcwc27的表达，若circcwc27的表达降低，则表明该候选物质是预防和/或治疗阿尔茨海默病的潜在物质。
33.在此公开一种药物组合物，其包括有效量circcwc27下调剂、以及药学上可接受的载体或辅料。
[0034]“有效量”意指circcwc27下调剂(i)治疗特定疾病、病症或障碍，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状发作的量。
[0035]“药学上可以接受的载体”指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和有效成分相互掺杂，而不明显降低有效成分的药效。药学上可接受的载体或辅料包括但不限于纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0036]
本公开中的药物或药物组合物可按照药物制备的常用方法制成注射制剂、口服制剂、滴鼻剂、喷雾制剂、软膏制剂或贴剂等。
[0037]
circcwc27下调剂也可以与其它预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物进行联合用药。
[0038]
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0039]
实施例1：在ad患者外周血浆和模型小鼠脑组织中，circcwc27水平显著升高。
[0040]
选择6月龄app/ps1转基因小鼠及相同年龄和背景的野生对照鼠各3只，麻醉后灌注取脑，脑组织分成两半，一半用于rna抽提进行circrna测序分析，另一半多聚甲醛固定后制作石蜡切片进行原位杂交实验。相关操作符合伦理学操作标准和流程。
[0041]
circrna测序分析：通过nanodrop nd-100浓度测定，选取1-2μg rna进行文库构建，构建好的文库通过agilent2100鉴定文库质量，并用qpcr进行文库定量，混合好的不同样品文库使用illumina 4000测序仪进行测序，包括naoh碱变性单链生成，illumina flow cell原位扩增，150双端循环测序等步骤。利用solexa pipeline version 1.8软件进行图
像处理和碱基识别，fastqc软件对去接头后的reads质量进行评估，通过star软件比对到参考基因组，使用circexplorer2进行backsplice junction reads检测，利用r软件edger进行表达差异计算。
[0042]
rt-pcr：实验使用碧云天公司rnaeasy
tm plus试剂盒说明书提取总rna，实时荧光定量pcr，根据takara公司提供primescript
tm
rt master mix试剂盒说明书将rna反转录成cdna，按照tb green
tm
premix ex taq
tm
试剂盒说明书提供的方法在rt-pcr abi7300仪上进行实时荧光定量pcr反应，以gapdh为内参照。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的ct值。采用相对定量方法2
δδ
ct来计算circrna的相对表达水平。
[0043]
蛋白免疫印迹实验：pc12细胞(购自江苏凯基生物技术股份有限公司)转染si-circcwc27(购自吉满生物科技(上海)有限公司)及对照后72小时，用ripa裂解液裂解细胞，20min后将裂解液转移至1.5ml离心管中并标记，用bca试剂盒蛋白定量。蛋白变性后，经sds-page系统电泳分离后转pvdf膜，5％脱脂奶粉(0.1％tbst稀释)室温封闭1h，tbst洗3次，每次5min，4℃分别孵育app及内参蛋白gapdh抗体(购自abcam，app抗体货号ab32136，gapdh抗体货号ab8245)(1∶1000)过夜，tbst洗涤3次，每次5min，孵育二抗hrp标记抗体(购自碧云天)(1∶5 000)2h，tbst洗涤3次，最后加ecl发光液、曝光、显影，用image j软件进行灰度分析。
[0044]
实施例1中通过circrna测序分析及rt-pcr实验表明，如图1所示，在ad患者外周血浆和app/ps1模型小鼠脑组织(海马和皮层)中，circcwc27水平显著升高(
*
p《0.05,
**
p《0.01与wt组；n＝6,
***
p《0.001与对照组；n(对照组)＝18，n(ad)＝20，数据以平均值
±
sem表示)。
[0045]
实施例2：干扰circcwc27的表达降低app蛋白水平
[0046]
ad模型小鼠app/ps1经脑立体定位注射补充circcwc27干扰病毒lv-sh-circcwc27(购自上海吉荧生物技术有限公司)。以慢病毒为载体包被circcwc27干扰rna，用于长期稳定降低小鼠脑内的circcwc27表达，circcwc27干扰rna序列如seq id no.1所示，病毒浓度为1
×
109病毒/微升，注射量为5μl。对照组为app/ps1小鼠经脑立体定位注射补充对照病毒lv-sh-circcon(购自上海吉荧生物技术有限公司)组，注射病毒浓度为1
×
109病毒/微升，注射量为5μl。而后经蛋白质免疫印迹实验发现，circcwc27干扰病毒能够显著降低app/ps1小鼠脑内app蛋白的表达，这表明circcwc27在调节aβ生成中具有重要作用。
[0047]
图2显示出circcwc27干扰病毒能够显著降低app/ps1小鼠脑内app蛋白的表达(***p《0.001app/ps1-lv-sh-circ与对照组相比；n＝4,数据以平均值
±
sem表示)。
[0048]
实施例3：circcwc27抑制剂缓解ad模型小鼠脑内淀粉样蛋白病理和行为表征
[0049]
该实验经过上海交通大学医学院动物实验伦理委员会批准，按照动物实验操作指南实施。6月龄app/ps1雄性小鼠购于南京大学模式动物中心。将小鼠随机分为wt-lv-sh-circcon组(野生型小鼠注射对照病毒组)，wt-lv-sh-circcwc27组(野生型小鼠注射circcwc27干扰病毒组)，app/ps1-lv-sh-circcon(app/ps1小鼠小鼠注射对照病毒组)组和app/ps1-lv-sh-circcwc27组(app/ps1小鼠注射circcwc27干扰病毒组)。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，俯卧位将其头部固定于立体定位注射仪上，用微量注射器吸取5μl lv-sh-circcwc27(购自上海吉荧生物技术有限公司)溶液，溶液的浓度是1
×
109病毒/微升，在颅骨孔处竖直插入脑组织。用微量注射泵以0.5μl/min速度入小鼠第三脑室(前卤后：-0.3mm，矢状缝左/右：1.0mm，深度：2.2mm)，待注射完毕后将注射器缓慢抽出。小鼠立体定位
注射术后将颅骨注射点周围消毒，缝合皮肤后放回鼠笼中继续饲养。两个月后通过morris水迷宫检测小鼠学习和记忆能力。行为学后处死取脑，固定切片后检测脑内淀粉样蛋白病理(淀粉样蛋白aβ抗体购自cell signaling technology，货号2450t)。
[0050]
如图3所示，行为学实验结果表明，circcwc27抑制剂可以显著缩短app/ps1小鼠的到达平台的潜伏期，并提高目标象限的停留时间。从对照组小鼠的运动轨迹图可以看出，与对照组相比，处理组学习和记忆能力显著提高(
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001wt-lv-sh-circ与对照组相比；
#
p《0.05app/ps1-lv-sh-cir与对照组相比，n＝7-10,数据以平均值
±
sem表示)。
[0051]
如图4所示，脑组织病理检测结果表明，circcwc27抑制剂治疗可以降低脑内淀粉样斑块的沉积，缓解脑内淀粉样蛋白病理的严重程度(
***
p《0.001app/ps1-lv-sh-circ与对照组相比，n＝4,数据以平均值
±
sem表示)。